CN104286031A - 一种生物复配杀菌组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物复配杀菌组合物，所述生物复配杀菌组合物含有5～40％吡唑醚菌酯和40~2000亿CFU/g的枯草芽孢杆菌两种活性组分。本发明还公开了上述生物复配杀菌组合物在防治草莓枯萎病中的应用。本发明复配药剂中枯草芽孢杆菌DJ-6和吡唑醚菌酯分别为不同作用机理的杀菌剂；该制剂对草莓重茬病害不但防治效果好，而且促进生长作用明显，对环境友好且具有成本低和加工简易的优点，明显减少病苗和死苗发生，明显提高重茬草莓种植产量和品质，能较好满足生产上农作物病害防治的需要。
Description
技术领域
本发明属于农药技术领域，涉及一种生物复配杀菌组合物及其应用。
背景技术
草莓(Fragaria ananassa Duch)以其果实柔软多汁、味道鲜美、营养丰富、生育期短、结果早和产量高等特点备受欢迎，在国际市场上具有重要的经济地位。由尖孢镰刀菌草莓专化型(Fusarium oxysporum f.sp.fragariae)从根部侵染引起的草莓枯萎病，是危害草莓的主要土传病害，由于大棚草莓连作现象很普遍，从而导致草莓枯萎病的发生越来越严重,植株发病率可达89.2％。草莓枯萎病主要发生在高温期，苗期或开花至收获期均可发病。初期仅心叶变黄绿或黄色，有的卷缩或呈波状产生畸形叶，致病株叶片失去光泽，植株生长衰弱，在3片小叶中往往有1～2片畸形或变狭小硬化，且多发生在一侧，老叶呈紫红色萎蔫，被害株的根冠部、叶柄、果梗维管束都变成褐色至黑褐色，造成草莓生长发育迟缓、匍匐茎明显减少，草莓结果减少、果实无法正常膨大，品质低，甚至全株枯死。
目前对该病害仍以化学防治为主，常用恶霉灵、代森锰锌、多菌灵和甲基托布津等杀菌剂根部施用，长期使用抗药性严重，且防效不尽理想，易造成农药残留超标和污染环境。目前成功用于防治草莓枯萎病的生物农药专用制剂少。文献已报道生物防治控制病害的生防菌属(种)主要有(1)木霉菌属真菌(Trichodermaspp.)中的绿色木霉(Trichoderma viride)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；(2)芽孢杆菌属细菌(Bacillus spp.)中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)；(3)假单胞菌属细菌(Pseudomonasspp.)中的荧光假单胞细菌(Pseudomonas fluorescens)等。由于单一生防菌往往防效不够稳定等因素实际使用更少，因此，必须调整对草莓枯萎病的防治策略，合理使用杀菌剂，同时也急需筛选出更多有效防治草莓枯萎病的杀菌剂。
枯草芽孢杆菌(拉丁文学名为Bacillus subtilis)DJ-6菌株由镇江农科所从杜娟根部分离筛选，已于2012年7月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.6314，枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。吡唑醚菌酯又名唑菌胺酯，为新型广谱杀菌剂，其作用机理为线粒体呼吸抑制剂，即通过在细胞色素合成中阻止电子转移，具有保护、治疗、叶片渗透传导作用，该化合物低毒，对非靶标生物安全，而且对使用者和环境均安全友好，已被美国环保局列为“减小风险的候选药剂”。
采用枯草芽孢杆菌DJ-6和吡唑醚菌酯混配，弥补单一生防菌剂的不足，提高生物农药的使用效果，也能减少化学防治。目前枯草芽孢杆菌DJ-6和吡唑醚菌酯的相关复配剂没有报道，试验增效显著，对草莓枯萎病的效果明显好于单一制剂，能较好满足生产上农作物作物病害防治的需要。
发明内容
发明目的：本发明的第一个目的是提供了一种防治效果较好且高效低毒的生物复配杀菌组合物。本发明的第二个目的是提供了上述杀菌组合物的应用。长期连作设施草莓枯萎病等发生严重，生产中常用恶霉灵、多菌灵等化学农药根部施用，但草莓为不去果皮的鲜食为主的水果，防止农药残留提高安全品质事关人们的健康，由于在草莓重茬病害上应用的生物农药少，且因防效不够稳定等因素实际使用更少，为了提高生物农药的使用效果，替代或减少化学防治，本发明通过对枯草芽孢杆菌DJ-6和吡唑醚菌酯混配科学组合防治连作草莓田枯萎病等。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种生物复配杀菌组合物，所述生物复配杀菌组合物含有5～40％吡唑醚菌酯和40～2000亿CFU/g的枯草芽孢杆菌DJ-6两种活性组分。
其中，上述枯草芽孢杆菌DJ-6与吡唑醚菌酯重量比为1:1～1:5。
其中，上述生物复配杀菌组合物为20％吡唑醚菌酯·200亿CFU/g枯草芽孢杆菌DJ-6的可湿性粉剂。
其中，上述生物复配杀菌组合物还包括助剂和填料。
其中，上述杀菌组合物的剂型为可湿性粉剂、水乳剂、悬浮剂或水分散粒剂中的一种。
其中，上述助剂为表面活性剂和分散剂。
其中，上述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，分散剂为NNO。
其中，上述填料为白炭黑或高岭土中的一种或几种。
上述的一种生物复配杀菌组合物在防治草莓枯萎病中的应用。
在连作重茬的草莓田，草莓苗定植时将所述的杀菌组合物稀释1000-3000倍液，每株灌根250ml。
有益效果：本发明复配药剂中枯草芽孢杆菌DJ-6和吡唑醚菌酯分别为不同作用机理的杀菌剂；该制剂对草莓重茬病害不但防治效果好，而且促进生长作用明显，对环境友好且具有成本低和加工简易的优点，明显减少病苗和死苗发生，明显提高重茬草莓种植产量和品质，能较好满足生产上农作物病害防治的需要。
具体实施方式
供试原药(母药)：1000亿CFU/g枯草芽孢杆菌DJ-6(Bacillus subtili)母药，由镇江农科所现代研究室提供；97％吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)原药，由江苏耘农化工有限公司提供。
本发明的生物组合杀菌组合物可制成可湿性粉剂，将吡唑醚菌酯(折百重量)20g，1000亿CFU/克枯草芽孢杆菌DJ-620g，十二烷基硫酸钠40g，扩散剂NNO460g，白炭黑100g，高岭土余量，加至1000g，混合物进行气流粉碎，制得20％吡唑醚菌酯·200亿CFU/g枯草芽孢杆菌DJ-6的可湿性粉剂。
实施例1
1、室内抑菌活性测定
1.1 试验时间与地点
于2012年4—7月份在镇江市农业科学研究所现代农业研究室实验室进行。
1.2 供试菌株
草莓枯萎病菌，采自江苏省句容市大棚草莓，品种为红颊，由镇江市农业科学研究所现代农业研究室分离、鉴定、及按照柯郝法则(Koch’s Rule)验证后并保存备用。菌株保存于马铃薯蔗糖琼脂(PSA)斜面上(4℃)。
1.3 供试药剂
1000亿CFU/克枯草芽孢杆菌DJ-6(Bacillus subtili)母药，由镇江农科所现代研究室提供；97％吡唑醚菌酯((Pyraclostrobin)原药，由江苏耘农化工有限公司提供。
1.4 仪器设备
电子天平(感量0.1mg)、GZP-300A培养箱、直径为75mm的培养皿、三角瓶、移液器、移液管、洗耳球、打孔器、接种刀等。
1.5 试验方法
1.5.1 药液的配制及浓度设计
(1)母液配制：将1000亿CFU/g枯草芽孢杆菌DJ-6母药加无菌水配成10000μg/mL，97％吡唑醚菌酯原药用适量丙酮溶解后并加入10％的吐温-80，配制成1000μg/mL母液，置于4℃冰箱中备用。
(2)各药剂单剂与复配剂的浓度设计：枯草芽孢杆菌DJ-6、吡唑醚菌酯以及枯草芽孢杆菌DJ-6与吡唑醚菌酯(1:1、1:2、1:3、1:4和1:5)复配剂在含药PSA中的浓度设计均为100.00、50.00、25.00、12.50、6.25，3.125，1.5625和0.78125μg/mL，8个不同浓度梯度的PSA培养基。除母液外，所有试验药剂系列浓度的药液均为现配现用。
1.5.2 试验方法
采用菌丝生长速率法，将各单剂与复配剂的药液依次稀释至所需浓度，然后将1mL药液与9mL培养基在培养皿内混匀，制成含系列浓度药剂的PSA培养基，采用无菌水作空白对照，各处理重复4次。将保留的草莓枯萎病菌转接到PSA平皿中，在25℃下活化72h，然后在近菌落边缘用打孔器制取直径为5mm的菌饼，并转接到含药的PSA平皿和空白对照中。25℃培养96h，待对照中菌落长至约平皿直径的4/5时，采用十字交叉法量取菌落直径。
计算菌落直径均值，并按照下列公式计算菌丝生长平均抑制率：
菌丝生长平均抑制率＝{(对照菌落直径均值-处理菌落直径均值)/(对照菌落直径均值-接种菌饼直径)}×100％，采用DPS13.0专业版数据处理系统，计算出药剂对草莓枯萎病菌菌丝生长抑制的回归方程、EC50及其95％置信限。
根据Wadley法,计算增效系数(SR)。根据增效系数(SR)评价药剂混用的联合作用类型，即SR<0.5为拮抗作用，0.5≤SR≤1.5为相加作用，SR>1.5为增效作用。
SR＝EC50(Eth)/EC50(Eob)……………………………………..(1)
EC50(th)＝(a+b)/[(a/EC(A)50+(b/EC(B)50]…………………….(2)
其中，A、B分别为杀菌剂单剂，a、b为相应单剂在混剂中的比例，EC50(Eth)为混剂EC50理论值，EC50(Eob)为混剂EC50实测值。
1.6 室内抑菌活性测定结果
1.6.1 枯草芽孢杆菌DJ-6及吡唑醚菌酯对草莓枯萎病菌菌丝生长的影响
从表1中的结果表明，枯草芽孢杆菌DJ-6与吡唑醚菌酯的浓度为0.78125～100μg/mL时，对草莓枯萎病病菌的抑菌率分别为3.08～36.92％、41.03～77.44％。
表1 枯草芽孢杆菌DJ-6与吡唑醚菌酯对草莓枯萎病菌的抑制效果(72h)
注：菌落直径含菌饼5mm。下同。
1.6.2 枯草芽孢杆菌DJ-6与吡唑醚菌酯混配对草莓枯萎病病菌菌丝生长的影响
从表2看出，枯草芽孢杆菌DJ-6与吡唑醚菌酯5种混配组合的浓度为0.78125～100μg/mL时，1:1、1:2、1:3、1:4和1:5的配比复配组合对草莓枯萎病菌菌丝生长抑菌率分别为37.95％～89.74％，37.95％～91.28％、32.82％～91.28％、34.87％～92.31％、41.03％～75.90％。
1.6.3 对草莓枯萎病病菌的毒力和混配联合作用类型
表2 枯草芽孢杆菌DJ-6与吡唑醚菌酯不同配比对草莓枯萎病菌的抑制效果(72h)
2种单剂和5种混配组合对草莓枯萎病病菌的作用模型见表3，浓度对数与防治效果几率值的相关系数均≥0.9740，说明防治效果几率值的变异有97.40％或以上来自浓度对数的变异，表明用所得模型表达浓度对数与防治效果几率值的关系可行。
表3数据表明，枯草芽孢杆菌DJ-6、吡唑醚菌酯对草莓枯萎病病菌的EC50分别为213.5212μg/mL、2.6892μg/mL，吡唑醚菌酯对草莓枯萎病病菌的室内生物活性显著高于枯草芽孢杆菌DJ-6。从表3还可以看出，枯草芽孢杆菌DJ-6与吡唑醚菌酯5个不同配比的增效系数(SR)均大于1，表明联合作用类型均为相加或增效作用；其中，1:1、1:2、1:3、1:4配比的SR分别是2.28、1.77、1.53、1.64，均大于1：5，表明对草莓枯萎病病菌表现为增效作用，1:1配比的SR最大，增效作用最佳。
表3 枯草芽孢杆菌DJ-6与吡唑醚菌酯及其混配对草莓枯萎病的抑制作用
应用实例
1、田间促生防病试验方法
试验设在句容华阳镇一农户草莓大棚，大棚宽度6.3m,长度70m，共441m2，土壤黄壤土，草莓大棚连作五年，草莓品种为红颊，自繁育草莓苗，上年大棚草莓田间枯萎病发生率20％左右。夏季施肥鸡粪肥1500kg/666.7m2后，翻耕并地面农膜覆盖并上水保湿，进行太阳能高温处理。定植前15天基肥施用发酵菜饼200kg/666.7m2，45％含量三元复合肥60kg/666.7m2，翻拌开沟作垄。畦面宽0.6m，沟宽0.4m，沟深0.3m，垄面栽种两行，行距20cm，株距20cm，定植6500株左右/666.7m2。栽种成活后20d、40d分别追三元复合肥15kg左右。定植时间9月13日，定植后1d药剂灌根处理。
共设1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6(江苏省绿盾植保农药实验有限公司生产)1000倍液，250g/L吡唑醚菌酯乳油(巴斯夫欧洲公司生产)2000倍液，20％吡唑醚菌酯·200亿cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6可湿性粉剂(江苏省绿盾植保农药实验有限公司加工生产)分别1000倍液、2000倍液和3000倍液三种浓度(以下分别为高浓度、中浓度和低浓度)，以清水对照。共6个处理,两次重复，每小区100株，随机区组排列，灌根药液量为250ml。
药后30d每小区定点10株，调查草莓植株株高、最大叶的叶柄长、中心小叶叶片长度和宽度，并于药后30d和80d，调查每小区全部植株枯萎病发病情况，统计发病株率和防治效果。
2、田间促生防病效果
2.1对草莓生长性状的影响
药后30d对各处理区草莓生长情况进行了调查，通过调查结果表明：20％吡唑醚菌酯·200亿CFU/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂三种浓度及其各单剂均有促进草莓生长的作用，表现为株高增加，叶柄拉长和叶片增大，株径增大，其中20％吡唑醚菌酯·200亿CFU/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂以高浓度>中浓度>低浓度，而低浓度促生效果稍次于25％吡唑醚菌酯乳油2000倍液，但比1000亿CFU/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂1000倍液效果好些。高浓度与清水对照对比，株高增加2.89cm，最大叶叶柄长、中心小叶长和宽度分别高增加3.55cm、2.86、2.08，株径增加4.5cmX7.1cm，生长性状测定各指标分别比其他各处理均高。中浓度与清水对照对比，株高增加1.79cm，最大叶叶柄长、中心小叶长和宽度分别高增加3.26cm、2.38cm、1.89cm，株径增加3.7cmX6.0cm。除低于高浓度外，生长性状测定各指标也均高于其他各处理。低浓度与清水对照相比，株高增加0.72cm，最大叶叶柄长、中心小叶长和宽度分别高增加2.56cm、1.96cm、1.38cm，株径增加2.4cmX3.6cm，但生长性状测定各指标低于25％吡唑醚菌酯乳油2000倍液，而高于1000亿CFU/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂1000倍液。
表4 20％吡唑醚菌酯·200亿cfu/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂不同浓度灌根对草莓生长性状的影响
2.2对草莓枯萎病的防治效果
药后30d和80d田间调查结果表明，对照发病株率分别为7.19％和18.13％，20％吡唑醚菌酯·200亿CFU/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂药剂高浓度防效最高分别为100％和93.11％，均高于其他各处理,其次为中浓度防效分别为92.64％和86.49％，高于低浓度和各单剂，低浓度防效分别为82.61％和72.42％，高于1000亿CFU/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂1000倍液(防效分别为77.85％和55.16％)，但低于250g/L吡唑醚菌酯乳油2000倍液(防效分别为89.15％和76.78％)。因此20％吡唑醚菌酯·200亿CFU/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂1000～3000倍液均有较好的防治效果。
表5 20％吡唑醚菌酯·200亿cfu/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂不同浓度对草莓枯萎病田间防效
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述生物复配杀菌组合物含有5～40％吡唑醚菌酯和40~2000亿CFU/g的枯草芽孢杆菌DJ-6两种活性组分。
2.根据权利要求1所述的一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌DJ-6与吡唑醚菌酯重量比为1:1~1:5。
3.根据权利要求1所述的一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述生物复配杀菌组合物为20%吡唑醚菌酯·200亿CFU/g枯草芽孢杆菌DJ-6的可湿性粉剂。
4.根据权利要求1所述的一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述生物复配杀菌组合物还包括助剂和填料。
5.根据权利要求4所述的一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物的剂型为可湿性粉剂、水乳剂、悬浮剂或水分散粒剂中的一种。
6.根据权利要求4所述的一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述助剂为表面活性剂和分散剂。
7.根据权利要求6所述的一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，分散剂为NNO。
8.根据权利要求4所述的一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述填料为白炭黑或高岭土中的一种或几种。
9.权利要求1所述的一种生物复配杀菌组合物在防治草莓枯萎病中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在连作重茬的草莓田，草莓苗定植时将所述的杀菌组合物稀释1000-3000倍液，每株灌根250ml。
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