CN104277137A - 区域选择性合成圆头蒿多糖磷酸酯的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种区域选择性合成多糖磷酸酯的方法，属生物高分子及化学合成技术领域。本发明利用空间位阻较大的保护基保护多糖伯羟基，区域选择性合成了高活性圆头蒿多糖磷酸酯，拓展了圆头蒿多糖作为天然活性物质的应用。动物活性试验表明，本发明合成的圆头蒿多糖磷酸酯对HepG2肝癌细胞具有显著的体外抑制HepG2细胞的作用（IC₅₀为12.41~25.56mg/mL），可作为HepG2肝癌细胞的抑制剂，用于制备抗癌药物。

Description

区域选择性合成圆头蒿多糖磷酸酯的方法及应用

技术领域

本发明属生物高分子及化学合成技术领域，涉及一种圆头蒿多糖磷酸酯的合成方法；本发明还涉及该圆头蒿多糖磷酸酯的医药用途——作为HepG2肝癌细胞的抑制剂应用于制备抗癌药物中。

背景技术

多糖磷酸酯具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和免疫调节等多种生物活性。多糖所具备的生物活性与其化学结构有极为密切的关系。为了提高多糖的生物活性，通过改变多糖的空间结构、分子量及取代基种类、数目和位置对其活性产生影响，已成为活性多糖研究和筛选的重要方向。在诸多多糖衍生物中，多糖磷酸酯由于其具有良好的生物学活性而受到广泛的关注。Williams等对β-(1-3)-D-葡聚糖进行了磷酸化后，活性大大提高（Carbohydrate Research, 1991, 219, 203-213）。陈茹玉等合成的N , N-二(2-氯乙基)果糖基磷酰胺酯的抗肿瘤活性实验结果表明其对L1210细胞和S180腹水癌有一定的抑制作用（高等学校化学学报, 1993,7, 963）。Suzuki等对酵母甘露聚糖进行硬脂酰化和磷酸化后能有效的抗S-180和艾氏腹水癌（Chemical & pharmaceutical bulletin, 1976, 24, 1100-1103）。薛胜霞以POCl₃为酯化试剂，合成的牛膝多糖磷酸酯对人肺癌诱导A549细胞的增殖有抑制作用，抑瘤活性高于未修饰前（中国生化药物杂志. 2007, 28, 6, 406-409）。

目前对于多糖的磷酸化中，使用磷酸化试剂主要是磷酸盐、酸酐等，直接对多糖进行衍生化。而多糖衍生物中取代基的取代位置和数目对其生物活性有着重要的作用。如天然硫酸化多糖卡拉胶中硫酸根的数目和位置也对其抗病毒、抗凝血活性有着显著影响，如λ-卡拉胶中α-D-半乳糖2，6位的两个硫酸根在其抗凝血活性中起决定作用（Miller. et al. Carbohydrate Research 1998, 309, 1, 39-43）。在对硫酸化甲壳质和硫酸化羧甲基甲壳质研究中发现，O-硫酸化壳聚糖具25%的肝素活性，N-硫酸化壳聚糖无活性；C-6-硫酸化-N-羧甲基化壳聚糖具45%的肝素活性，可见，C-6位上的硫酸根可显著提高其活性（Nie et al. International Journal of Biological Macromolecules, 2006, 39, 228-233）。因此，对多糖进行区域选择性修饰可能得到活性不同的多糖衍生物。然而，多糖的分子量一般较高，空间位阻效应较强，天然活性多糖的区域选择性修饰难度较大。

圆头蒿多糖来源于菊科蒿属植物圆头蒿（Artemisia sphaerocephala），其种子中多糖类胶体含量约为20％，具有不同于其他生物胶体的特殊性能：115℃以上高温不变性，粘度是明胶的1800倍，自身吸水60倍，不溶于热的稀酸、稀碱和一般溶剂，可均匀分散于水中呈有限吸水溶胀状态。专利ZL200510002228.5公开了一种降糖的沙蒿多糖制备方法及其应用，天然沙蒿多糖可用于治疗化学性糖尿病，降低血糖，显著减缓糖尿病引起的体重下降，并能减少糖尿病对肝、肾的损伤，降低血液中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、尿素氮的含量。因此，对圆头蒿多糖进行区域选择性修饰可改变其物理化学性质和生物活性。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种区域选择性合成圆头蒿多糖磷酸酯的方法；

本发明的另一目的是提供一种圆头蒿多糖磷酸酯的新的医药活性及用途——作为HepG2肝癌细胞的抑制剂用于制备抗癌药物。

一、圆头蒿多糖磷酸酯的合成

本发明区域选择性合成多糖磷酸酯的方法，包括以下工艺步骤：

（1）圆头蒿多糖溶液的制备：将圆头蒿多糖充分溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺中（室温下以500~1200转/分钟搅拌6~8小时），得到圆头蒿多糖溶液；圆头蒿多糖与无水N,N-二甲基甲酰胺的重量体积为0.04~0.08g/mL。

（2）圆头蒿多糖伯羟基的保护：将三苯基氯甲烷溶解于吡啶后加入到上述圆头蒿多糖溶液中，于60℃~80℃反应12~24h；反应结束降至室温，依次用蒸馏水、无水乙醇洗涤后，抽滤（0.06~0.08MPa的条件下抽滤），滤饼干燥（40~60℃干燥12~16小时），得到伯羟基保护的圆头蒿多糖。三苯基氯甲烷与吡啶的重量体积比为0.3~0.6 g/mL；三苯基氯甲烷与圆头蒿多糖的质量比为1:0.28~1:0.55。

（3）伯羟基保护的圆头蒿多糖的磷酸化：将伯羟基保护的圆头蒿多糖溶于无水N,N-二甲基甲酰胺（伯羟基保护的圆头蒿多糖与N,N-二甲基甲酰胺的重量体积比为0.04～0.08g/mL），加入磷酸化试剂，N₂保护下，于40~60℃反应1~3小时，冷却至0~5℃，用碱液（浓度1~2 mol/L的氢氧化钠溶液）中和至pH=7~8；于室温、0.06~0.08MPa下抽滤；滤液装入透析袋（截流量为8000~12000道尔顿）中，先于流水中透析36~72小时，再于去离子中透析18~36小时；然后将透析袋内液体减压浓缩（在50~60℃、0.06~0.08MPa下）至原体积的1/20~1/40；用乙醇进行沉淀（乙醇含量占总体积的75~80%），离心（3500~4500转/分钟下离心10~15分钟），固体冷冻干燥（在-60~-50℃、1~5Pa的条件下冷冻干燥30~36小时），得磷酸化伯羟基保护的圆头蒿多糖。

上述磷酸化试剂的制备：在0~5℃下，将三氯氧磷滴加到吡啶中（滴加速度为0.4～0.6 mL/min）反应20～30min，得到磷酸化试剂；三氯氧磷与吡啶的体积比为1:10~1:15。

磷酸化试剂与伯羟基保护的圆头蒿多糖的体积质量比为1:0.2~1:0.4 mg/mL。

（4）圆头蒿多糖保护基的脱除：将磷酸化伯羟基保护的圆头蒿多糖加入到二氯乙酸中（磷酸化伯羟基保护的圆头蒿多糖与二氯乙酸的重量体积比为0.01~0.03 g/mL），在室温下搅拌反应30~60min，用无水乙醇沉淀（无水乙醇的用量为二氯乙酸体积的2~6倍），离心（在3500~4500转/分钟的条件下离心10~15分钟）；固体冷冻干燥（在-60~-50℃、1~5Pa的条件下冷冻干燥30~36小时）得区域选择性取代的圆头蒿多糖磷酸酯。

二、圆头蒿多糖磷酸酯的结构性能

下面通过红外光谱图、¹³C NMR谱图、磷含量测定、分子量及其分布及对HepG2肝癌细胞的抑制作用对本发明合成的区域选择性取代的圆头蒿多糖磷酸酯的结构、性能等进行分析说明。

    1、红外光谱图分析

图1为本发明制备的伯羟基保护的圆头蒿多糖及磷酸化反应之后的红外光谱图。图1中，伯羟基保护的圆头蒿多糖中糖环母体吸收峰并未发生变化。3058.4 cm^-1处的为单取代芳环=C-H的特征伸缩振动峰。1752.2 cm^-1处为芳环=C-H面外弯曲振动，由于此处的吸收强度较基频弱得多，无法估计取代类型。1626.2 cm^-1、1488.0 cm^-1和1449.6 cm^-1这一区域是芳环C=C整体的伸缩振动产生的，是归属芳环骨架振动的特征峰，说明伯羟基保护的圆头蒿多糖中确实存在苯核。1597.2 cm^-1处说明苯振动骨架有偶极矩的改变，属于单取代。767.1 cm^-1和704.4 cm^-1处为苯环C-H面外弯曲振动，都属于单取代。由此说明，糖环上部分羟基已被三苯甲基所取代。在磷酸化圆头蒿多糖的红外图谱中可以看到，除了上述苯环相关的吸收峰外，在1268.9 cm^-1和909.6 cm^-1处出现的新的吸收峰，分别对应P=O和C-O-P的特征吸收，说明圆头蒿多糖的部分-OH被磷酸根取代，已被磷酸酯化。图2为伯羟基保护的圆头蒿多糖和区域选择性合成的圆头蒿多糖磷酸酯的红外光谱图。图2 中，经二氯乙酸脱保护后，区域选择性合成的圆头蒿多糖磷酸酯已没有任何苯基的特征吸收，说明三苯甲基已完全从多糖分子中除去，而有关磷酸酯的特征吸收仍然存在。

2、¹³C NMR谱图分析

图3为圆头蒿多糖（A）和区域选择性合成的圆头蒿多糖磷酸酯（B）的¹³C NMR谱图。图中，区域选择性合成的圆头蒿多糖磷酸酯主要的变化在δ 70-80左右C-2至C-5区，δ75.9处甘露糖单元的C-2峰强度明显降低，新的碳化学位移出现在δ77.7处和δ75.8处，为被取代的甘露糖单元的C-3信号和C-2信号。葡萄糖单元和半乳糖单元的C-2峰由于分裂的较为严重而难以准确归属。从δ 60-70处的化学位移看，在δ62.3、δ62.9和δ63.7处C-6的化学位移未发生变化。由以上可以推断，区域选择性合成的圆头蒿多糖磷酸酯中发生了非C-6取代。

3、磷含量测定

采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）测定磷含量，本发明中区域选择性合成的圆头蒿多糖磷酸酯的取代度为0.41~0.62，说明多糖磷酸酯已成功合成。

4、分子量分析

采用凝胶色谱-动静态光散射联用测定，本发明中区域选择性合成的圆头蒿多糖磷酸酯的重均分子量为8.963×10⁴ Da ~11.66×10⁴Da，分子量分布为2.78~3.38。说明本发明中多糖磷酸酯的分子量可根据反应条件进行调节。

5、体外对HepG2肝癌细胞的抑制作用

取对数生长期的HepG-2细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，并用含15%新生牛血清的DMEM培养基制成浓度3×10⁵个/mL的单细胞悬液，不断摇动细胞悬液使细胞数均匀，以0.2 ml/孔接种于96孔培养板（板边缘封无菌水，空白组加3孔不含细胞的培养基），置CO₂培养箱内在37℃、饱和湿度、5%CO₂条件下培养。

培养24 h后细胞贴壁，换含药培养基，每孔加190 μL培养基和10 μL样品液（空白组和对照组加10 μl PBS液），药物终浓度为20，50，100，200，500，1000，5000 μg/ml，每浓度重复6孔，并设不加样品的对照组和空白调零组。置CO₂培养箱内在37℃、饱和湿度、5%CO₂条件下培养。

样品处理48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL，37℃下继续培养4 h。小心弃去孔内上清液，并加入150 μL DMSO，振荡10 min，使紫色结晶完全溶解。用酶标仪在490 nm处测吸光值，对照组以空白组调零，并按下列公式计算抑制率，并根据不同浓度样品的抑制率计算半数抑制浓度（IC₅₀）。

抑制率（%）=（1-实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%       

实验结果表明，对HepG2肝癌细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）为12.41~25.56 mg/mL，说明本发明制备的圆头蒿多糖磷酸酯具有显著的体外抑制HepG2细胞的作用，可作为HepG2肝癌细胞的抑制剂，用于制备抗癌药物。

综上所述，本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、本发明通过圆头蒿多糖酸化制备了具有显著的体外抑制HepG2细胞的圆头蒿多糖磷酸酯，拓展了圆头蒿多糖磷酸酯作为天然活性物质的应用范围；

2、本发明利用基团保护技术，区域选择性合成的圆头蒿多糖磷酸酯具有更高的取代度，活性更高，对HepG2细胞的体外抑制率也更强，有利于圆头蒿多糖作为天然活性物质的应用；

3、本发明制备的圆头蒿多糖磷酸酯的取代度和分子量可以通过磷酸化试剂的比例调节优化，以满足不同领域要求；

3、本发明不需要特殊设备，简单可控，成本低，适合推广应用。

附图说明

   图1为本发明制备的伯羟基保护的圆头蒿多糖及磷酸化反应之后的红外光谱图；

   图2为伯羟基保护的圆头蒿多糖和区域选择性合成的圆头蒿多糖磷酸酯的红外光谱图；

   图3为圆头蒿多糖（A）和区域选择性合成的圆头蒿多糖磷酸酯（B）的¹³C NMR谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明合成圆头蒿多糖磷酸酯的方法及产品作进一步的说明。

实施例1

（1）圆头蒿多糖溶液的制备：称取0.60g圆头蒿多糖，室温下加入到15mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，在磁力搅拌器上以800转/分钟的转速搅拌7小时，得到圆头蒿多糖溶液；

（2）圆头蒿多糖伯羟基的保护：称取2g三苯基氯甲烷，室温下溶于5mL吡啶中；然后加入到上述圆头蒿多糖溶液中，于80℃下反应9小时；反应结束降至室温后，加蒸馏水50mL洗涤，再用100mL无水乙醇洗涤3遍，然后在0.06MPa下抽滤，滤饼在50℃干燥10小时，得到伯羟基保护的圆头蒿多糖； 

（3）磷酸化试剂的制备：将附有冷凝、搅拌和恒压漏斗装置的反应器置于0℃冰盐浴中，先将30 mL吡啶加入到反应器中，再将3mL三氯氧磷用有恒压漏斗的活塞以以0.5mL/分钟加速度滴加到反应器中；滴加完毕再反应25分钟，得到磷酸化试剂；

（4）磷酸化反应：称取干燥滤饼0.6g，在室温下加入10mL无水N,N-二甲基甲酰胺，以800转/分钟的转速搅拌3小时，得伯羟基保护的圆头蒿多糖溶液；取30mL磷酸化试剂加入到上述10mL伯羟基保护的圆头蒿多糖溶液中，N₂保护下、50℃反应2小时；冷却至5℃，用0℃的2mol/L的氢氧化钠溶液中和至pH=7后，于室温、0.06MPa下抽滤；再将滤液装入截流量为8000~12000道尔顿的透析袋中，依次于流水中透析36小时、去离子水透析36小时（每5小时换水一次），然后将透析袋内液体在50℃、0.07MPa下减压浓缩至原体积的1/20，加入乙醇进行沉淀（乙醇含量占总体积的80％），最后在3500转/分钟的条件下离心15分钟，下层固体在-55℃、5Pa的条件下冷冻干燥36小时，得磷酸化伯羟基的保护圆头蒿多糖；

（5）磷酸化圆头蒿多糖保护基的脱除：称取0.3g磷酸化伯羟基保护的圆头蒿多糖加入20mL二氯乙酸，在室温下搅拌反应30分钟，加入100mL无水乙醇进行沉淀，然后在4000转/分钟的条件下离心10分钟，下层固体在-60℃、2Pa的条件下冷冻干燥32小时，得区域选择性合成的圆头蒿多糖磷酸酯。

该多糖磷酸酯的取代度为0.62，重均分子量为9.962×10⁴Da，分子量分布为2.98。对HepG2肝癌细胞的IC₅₀为12.41mg/mL。

实施例2

（1）圆头蒿多糖溶液的制备：称取1.2g圆头蒿多糖，室温下加入到15mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，在磁力搅拌器上以1200转/分钟的转速搅拌6小时，得圆头蒿多糖溶液；

（2）圆头蒿多糖伯羟基的保护：称取3g三苯基氯甲烷，室温下溶于5mL吡啶中，然后加入到上述圆头蒿多糖溶液中，于70℃下反应12小时；反应结束降至室温后，加蒸馏水50mL洗涤，再用150mL无水乙醇洗涤3遍，然后在0.08MPa下抽滤，滤饼在50℃干燥12小时，得伯羟基保护的圆头蒿多糖；

（3）磷酸化试剂的制备：将附有冷凝、搅拌和恒压漏斗装置的反应器置于5℃冰盐浴中，先将30 mL吡啶加入到反应器中，再将2mL三氯氧磷用带有恒压漏斗的活塞以0.5mL/分钟加速度滴加到反应器中；滴加完毕再反应30分钟，得到磷酸化试剂；

（4）磷酸化反应：称取干燥滤饼0.4g，在室温下加入10mL无水N,N-二甲基甲酰胺，以600转/分钟的转速搅拌4小时，得伯羟基保护的圆头蒿多糖溶液；取20mL磷酸化试剂加入到10mL伯羟基保护的圆头蒿多糖溶液中，N₂保护下，60℃下反应1小时；冷却至3℃，用5℃的1mol/L的氢氧化钠溶液中和至pH=7，室温、0.08MPa下抽滤，再滤液装入截流量为8000~12000道尔顿的透析袋中，依次于流水中透析48小时、去离子水透析24小时（每4小时换水一次）；然后将透析袋内液体在60℃、0.06MPa下减压浓缩至原体积的1/30，加入乙醇进行沉淀（乙醇含量占总体积的75％），最后在4500转/分钟的条件下离心12分钟，固体在-60℃、1Pa的条件下冷冻干燥36小时，得磷酸化伯羟基保护的圆头蒿多糖；

（5）磷酸化圆头蒿多糖保护基的脱除：称取0.2g磷酸化伯羟基保护的圆头蒿多糖，加入20mL二氯乙酸，在室温下搅拌反应60分钟后，加入50mL无水乙醇进行沉淀，在4500转/分钟的条件下离心12分钟，下层固体在-50℃、2Pa的条件下冷冻干燥30小时，得区域选择性合成的圆头蒿多糖磷酸酯。

该多糖磷酸酯的取代度为0.41，重均分子量为11.662×10⁴Da，分子量分布为3.38。对HepG2肝癌细胞的IC₅₀为25.56mg/mL。

实施例3

（1）圆头蒿多糖溶液的制备：称取0.8g圆头蒿多糖，室温下加入到15mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，在磁力搅拌器上以500转/分钟的转速搅拌8小时，得圆头蒿多糖溶液；

（2）圆头蒿多糖伯羟基的保护：称取1.5g三苯基氯甲烷，室温下溶于5mL吡啶中，然后加入到上述圆头蒿多糖溶液中，于75℃下反应16小时；反应结束降至室温，加蒸馏水50mL洗涤，再用120mL无水乙醇洗涤3遍，然后在0.07MPa下抽滤，滤饼在40℃干燥16小时，得伯羟基保护的圆头蒿多糖； 

（3）磷酸化试剂的制备：将附有冷凝、搅拌和恒压漏斗装置的反应器置于2℃冰盐浴中，先将24mL吡啶加入到反应器中，再将2mL三氯氧磷用带有恒压漏斗的活塞以0.6mL/分钟的速度滴加到反应器中；滴加完毕再反应30分钟，得到磷酸化试剂；

（4）磷酸化反应：称取干燥滤饼0.8g，在室温下加入10mL无水N,N-二甲基甲酰胺，以500转/分钟的转速搅拌3小时，得伯羟基保护的圆头蒿多糖溶液；取40mL磷酸化试剂加入到10mL伯羟基的保护的圆头蒿多糖溶液中，N₂保护下，40℃下反应2小时；冷却至4℃，用2℃的1.5mol/L的氢氧化钠溶液中和至pH=8，室温下0.07MPa下抽滤，滤液装入截流量为8000~12000道尔顿的透析袋中，依次于流水中透析72小时、去离子水透析36小时（每2小时换水一次）；再将透析袋内液体在55℃、0.08MPa下减压浓缩至原体积的1/40，然后在浓缩液中加入乙醇进行沉淀（乙醇含量占总体积的75％），最后在4000转/分钟的条件下离心15分钟，下层固体在-50℃、2Pa的条件下冷冻干燥32小时，得磷酸化伯羟基保护的圆头蒿多糖；

（5）磷酸化圆头蒿多糖保护基的脱除：称取0.25g磷酸化圆头蒿多糖，加入20mL二氯乙酸，在室温下搅拌反应60分钟，再加入50mL无水乙醇进行沉淀，然后在3000转/分钟的条件下离心15分钟，下层固体在-60℃、1Pa的条件下冷冻干燥30小时，得区域选择性合成的圆头蒿多糖磷酸酯。

该多糖磷酸酯的取代度为0.48，重均分子量为8.963×10⁴Da，分子量分布为2.78。对HepG2肝癌细胞的IC₅₀为20.75mg/mL。

实施例4

（1）圆头蒿多糖溶液的制备：称取0.7g圆头蒿多糖，室温下加入到15mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，在磁力搅拌器上以1000转/分钟的转速搅拌7小时，得圆头蒿多糖溶液；

（2）圆头蒿多糖伯羟基的保护：称取2.5g三苯基氯甲烷，室温下溶于5mL吡啶中，然后加入到上述圆头蒿多糖溶液中，于80℃下反应18小时；反应结束降至室温后，加蒸馏水50mL洗涤，再用130mL无水乙醇洗涤3遍，然后在0.07MPa下抽滤；滤饼在55℃干燥13小时，得伯羟基保护的圆头蒿多糖；

（3）磷酸化试剂的制备：在3℃下，将附有冷凝、搅拌和恒压漏斗装置的反应器置于3℃冰盐浴中，先将26mL吡啶加入到反应器中，再将2mL三氯氧磷用带有恒压漏斗的活塞以0.4mL/分钟加速度滴加到反应器中；滴加完毕再反应30分钟，得到磷酸化试剂；

（4）磷酸化反应：称取干燥滤饼0.5g，在室温下加入10mL无水N,N-二甲基甲酰胺，以1000转/分钟的转速搅拌2小时，得伯羟基保护的圆头蒿多糖溶液；取30mL磷酸化试剂加入到10mL伯羟基的保护的圆头蒿多糖溶液中，N₂保护下，55℃下反应3小时；冷却至0℃，用0℃的2mol/L的氢氧化钠溶液中和至pH=7，室温、0.06MPa下抽滤，并将滤液装入截流量为8000~12000道尔顿的透析袋中，依次于流水中透析36小时、去离子水透析36小时（每4小时换水一次）；然后将透析袋内液体在60℃、0.06MPa下减压浓缩至原体积的1/30，加入乙醇进行沉淀（乙醇含量占总体积的80％），最后在4500转/分钟的条件下离心10分钟，下层固体在-60℃、5Pa的条件下冷冻干燥36小时，得磷酸化伯羟基保护的圆头蒿多糖；

（5）磷酸化圆头蒿多糖保护基的脱除：称取0.2g磷酸化圆头蒿多糖，加入20mL二氯乙酸，在室温下搅拌反应45分钟后，加入50mL无水乙醇进行沉淀，然后在3500转/分钟的条件下离心10分钟，取下层固体在-55℃、2Pa的条件下冷冻干燥36小时，得区域选择性合成的圆头蒿多糖磷酸酯。

该多糖磷酸酯的取代度为0.58，重均分子量为10.442×10⁴Da，分子量分布为3.16。对HepG2肝癌细胞的IC₅₀为16.33mg/mL。

比较例

（1）圆头蒿多糖溶液的制备：称取0.60g圆头蒿多糖，室温下加入到15mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，在磁力搅拌器上以800转/分钟的转速搅拌7小时，得到圆头蒿多糖溶液；

（2）磷酸化试剂的制备：将附有冷凝、搅拌和恒压漏斗装置的反应器置于0℃冰盐浴中，先将30mL吡啶加入到反应器中，再将3mL三氯氧磷用代理有恒压漏斗的活塞以0.5mL/分钟加速度滴加到反应器中；滴加完毕再反应25分钟，得到磷酸化试剂； 

（3）磷酸化反应：取30mL磷酸化试剂加入到10mL圆头蒿多糖溶液中，N₂保护下、50℃反应2小时，冷却至5℃，用0℃的2mol/L的氢氧化钠溶液中和至pH=7，室温、0.06MPa下抽滤，并将滤液装入截流量为8000~12000道尔顿的透析袋中，依次于流水中透析36小时、去离子水透析36小时（每5小时换水一次），然后将透析袋内液体在50℃、0.07MPa下减压浓缩至原体积的1/20；加入乙醇进行沉淀（乙醇含量占总体积的80％），最后在3500转/分钟的条件下离心15分钟，下层固体在-55℃、5Pa的条件下冷冻干燥36小时，得磷酸化圆头蒿多糖；该多糖磷酸酯的取代度为0.59，重均分子量为13.898×10⁴Da，分子量分布为3.26。对HepG2肝癌细胞的IC₅₀为26.65mg/mL。

比较例的参数与实施例1对应。通过比较例说明本发明制备的多糖磷酸酯样品取代度更高，对细胞的抑制率更高。通过与其它实施例对应的比较例作比较，发现本发明方法合成的多糖磷酸酯样品均具有取代度更高，对HepG2肝癌细胞的抑制率更强等特点，有利于圆头蒿多糖作为天然活性物质的应用。

Claims (10)

1.区域选择性合成圆头蒿多糖磷酸酯的方法，包括以下工艺步骤：

（1）圆头蒿多糖溶液的制备：将圆头蒿多糖充分溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺中，得到圆头蒿多糖溶液；

（2）圆头蒿多糖伯羟基的保护：将三苯基氯甲烷溶解于吡啶后加入到上述圆头蒿多糖溶液中，于60℃~80℃反应12~24h；反应结束降至室温，依次用蒸馏水、无水乙醇洗涤后，于0.06~0.08MPa下抽滤，滤饼干燥后，得到伯羟基保护的圆头蒿多糖；

（3）伯羟基保护的圆头蒿多糖的磷酸化：将伯羟基保护的圆头蒿多糖溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入磷酸化试剂，N₂保护下，于40~60℃反应1~3小时，冷却至0~5℃，用碱液中和至pH=7~8；于室温、0.06~0.08MPa下抽滤；滤液装入截流量为8000~12000道尔顿的透析袋中，先于流水中透析36~72小时，再于去离子中透析18~36小时；然后将透析袋内液体减压浓缩至原体积的1/20~1/40；用乙醇进行沉淀，离心，固体冷冻干燥，得磷酸化伯羟基保护的圆头蒿多糖；

（4）圆头蒿多糖保护基的脱除：将磷酸化伯羟基保护的圆头蒿多糖加入到二氯乙酸中，在室温下搅拌反应30~60min，用无水乙醇沉淀后离心；固体冷冻干燥，得区域选择性取代的圆头蒿多糖磷酸酯。

2.如权利要求1所述区域选择性合成圆头蒿多糖磷酸酯的方法，其特征在于：步骤（2）中，三苯基氯甲烷与吡啶的重量体积比为0.3~0.6 g/mL；三苯基氯甲烷与圆头蒿多糖的质量比为1:0.28~1:0.55。

3.如权利要求1所述区域选择性合成圆头蒿多糖磷酸酯的方法，其特征在于：步骤（3）中，磷酸化试剂是由以下工艺制备而成：在0~5℃下，将三氯氧磷滴加到吡啶中反应20～30min即得磷酸化试剂；三氯氧磷与吡啶的体积比为1:10~1:15。

4.如权利要求1所述区域选择性合成圆头蒿多糖磷酸酯的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述三氯氧磷与伯羟基保护的圆头蒿多糖的体积质量比1:0.2~1:0.4 mg/mL。

5.如权利要求1所述区域选择性合成圆头蒿多糖磷酸酯的方法，其特征在于：步骤（3）中，减压浓缩是在50~60℃、0.06~0.08MPa下进行。

6.如权利要求1所述区域选择性合成圆头蒿多糖磷酸酯的方法，其特征在于：步骤（3）中，用乙醇进行沉淀时，乙醇含量占总体积的75~80%。

7.如权利要求1所述区域选择性合成圆头蒿多糖磷酸酯的方法，其特征在于：步骤（4）中，磷酸化伯羟基保护的圆头蒿多糖与二氯乙酸的重量体积比为0.01~0.03 g/mL；无水乙醇的用量为二氯乙酸体积的2~6倍。

8.如权利要求1所述区域选择性合成圆头蒿多糖磷酸酯的方法，其特征在于：步骤（3）、（4）中，离心是在3500~4500转/分钟下离心10~15分钟。

9.如权利要求1所述区域选择性合成圆头蒿多糖磷酸酯的方法，其特征在于：步骤（3）、（4）中，冷冻干燥是在-60~-50℃、1~5Pa的条件下冷冻干燥30~36小时。

10.如权利要求1所述方法合成的圆头蒿多糖磷酸酯作为HepG2肝癌细胞的抑制剂应用在抗癌药物的制备中。