CN104267183B - 一种可用于肿瘤标志物检测的光电两用生物传感器的制作 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可用于肿瘤标志物检测的光电两用生物传感器的制作方法，属于生物传感器领域。它包括在ITO衬底沉积一薄层稳定的金膜，金膜上固定能特异性识别肿瘤标志物的抗体/纳米金复合物膜，这种抗体/纳米金/ITO器件能特异性的识别待测物中的肿瘤标志物并产生可检测的光电信号变化。这种光电两用生物传感器兼具肿瘤标志物检测试纸条和肿瘤标志物的检测试剂盒的优点。

Description

一种可用于肿瘤标志物检测的光电两用生物传感器的制作
技术领域
本发明属于生物传感器领域，具体涉及一种可用于肿瘤标志物检测的光电两用生物传感器的制作方法。
背景技术
肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的病变。肿瘤标志物是反映肿瘤存在的化学、生物类物质。它们可能在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，也可能只存在于胚胎组织而正常成人组织中不存在。它们的量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。目前，有对肿瘤标志物进行定性检测的方法，如多种临床上使用的检测肿瘤标志物试纸条，还有对肿瘤标志物进行定量检测的方法，如多种检测肿瘤标志物的试剂盒。本发明提供一种可用于定量检测肿瘤标志物的光电两用生物传感器的制作方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于肿瘤标志物检测的光电两用生物传感器的制作方法。本发明提供的用于肿瘤标志物检测的光电两用生物传感器结构侧视图如图1所示，它的制作包含以下步骤：
1)制备纳米金。对一定浓度的氯金酸水溶液加热至沸腾，并在一定搅拌速度下加入一定质量比的还原剂，添加完成后冷却至室温并以蒸馏水恢复到原来的体积，置于冰箱中一定温度下保存备用。
2)以纳米金为载体连接肿瘤标志物抗体，制备结合纳米金的抗体复合物。常温下，调整纳米金溶液的pH值，加入一定量的肿瘤标志物抗体，摇匀后，加入一定量的聚乙二醇(PEG)溶液后进行低温离心，吸去上清液，在沉淀中加入PBS缓冲溶液，除去未结合的抗体和PEG，重复操作1-3次，将沉淀溶于PBS溶液中，置于冰箱中一定温度下冷藏保存备用。
3)氧化铟锡(ITO)导电玻璃的制备和清洗。将ITO导电玻璃按检测条件要求用玻璃刀裁割成一定的形状，再依次放入丙酮，无水乙醇和二次蒸馏水中，利用超声波清洗器清洗以除去玻片表面的杂质，清洗完成后，将玻片置于设定一定温度的恒温干燥箱中进行干燥。
4)ITO导电玻璃的镀金处理。镀金的方法是离子溅射法，直接将清洗好的ITO导电玻璃置于装有金靶的小型离子溅射仪样品台上。溅射一定的时间得到一定厚度的金膜，并把沉积上金膜的ITO导电玻璃投入二次蒸馏水中以检测所沉积金膜的稳定性。
5)抗体在金膜的ITO导电玻璃上的固定。在多孔板中加入结合纳米金的抗体复合物溶液，选择稳定性好的镀金ITO导电玻璃投入到多孔板中，在一定温度下孵育一定时间，孵育完成后清洗备用。
6)肿瘤标志物在固定有抗体的敷金ITO导电玻璃上的结合，包含下列步骤：
(1)取6个10ml清洗干净的小烧杯，分别贴上标签1，2，3，4，5，6；然后在6个小烧杯中依次加入一定体积不同浓度的肿瘤标志物样品后，随即加入一定体积的酶标记物溶液，混匀后在每个小烧杯中加入1片固定有抗体的敷金ITO导电玻璃。
(2)把(1)中溶液已混匀的6个小烧杯置于一定温度干燥箱中温育几十分钟。
(3)依次取出6个小烧杯中的ITO玻片，用磷酸盐缓冲液充分洗涤后放在滤纸上干燥。
(4)再取6个10ml清洗干净的小烧杯，分别在6个小烧杯中依次一定体积的底物和显色剂，混匀后依次在6个小烧杯中放入(3)中得到的ITO玻片，并让体系在避光条件下反应一定时间。
(5)在(4)的小烧杯中分别加入一定体积的浓度为2N的硫酸溶液终止(4)的反应，依次取出在(4)中6个小烧杯中得到的玻片，用PBS溶液清洗后放在滤纸上干燥，
放入四个小滤纸袋中便于携带，纸袋上标记好。置于4℃冰箱中保存。
7)通过上述步骤即完成可用于肿瘤标志物检测的光电两用生物传感器的制作。
附图说明
图1可用于肿瘤标志物检测的光电两用生物传感器侧视结构示意图。1：ITO导电玻璃，2：金膜，3：纳米金，4：抗体，5：与抗体特异性结合的抗原。
具体实施方式
1)取质量分数为0.01％的氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾搅动下准确加入质量分数为1％的柠檬酸三钠2ml，继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复到原来的体积,置于4℃冰箱保存备用。
2)取5mL纳米金粒子溶液，用Na2CO3调pH值为9，加入25μg的CEA抗体，摇匀后，迅速加入250μL质量分数为l％的聚乙二醇(PEG)溶液，在常温下放置2～3h，在4℃低温下 离心30min，一万转5分钟，五千转24分钟，吸去上清液，在沉淀中加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，除去未结合的抗体和PEG，重复操作2次后，将样品溶于5mL 0.05％的PEG(pH＝7.0的PBS和0.05％的叠氮钠)溶液，于4℃下冷藏保存备用。
3)将ITO导电玻璃按检测条件要求用玻璃刀裁割成1cm×3cm的长方形，再依次放入丙酮，无水乙醇和二次蒸馏水中，利用超声波清洗器依次清洗5min后，取出玻片置于设定100℃恒温干燥箱中进行干燥。
4)将干燥好的ITO导电玻璃置于离子溅射仪工作台上，打开机器，抽真空，并利用调节阀调节真空度的大小，真空度可以直接影响放电电流的大小，当放电电流在10mA以内并接近于10mA时，固定调节阀的大小，真空度就可以保持稳定，之后进行溅射镀金，时间为30S。
5)镀金完成后，取出玻片浸入5ml的二次蒸馏水中30min，并除去金膜有脱落的ITO玻片。
6)在24孔板的每个孔中加入1ml 2)所得的溶液，并在每孔溶液中放入1片金膜没有脱落的ITO玻片，盖上24孔板盖板放到在4℃冰箱中孵育48小时，孵育完成后取出玻片用PBS清洗备用。
7)肿瘤标志物结合到固定有抗体的敷金ITO导电玻璃上步骤如下：
(1)取6个10ml清洗干净的小烧杯，分别贴上标签1，2，3，4，5，6；然后在6个小烧杯中依次加入100μl不同浓度的肿瘤标志物样品，随即加入100μl酶标记物溶液，混匀后在每个小烧杯中加入1片固定有抗体的敷金ITO导电玻璃。
(2)把(1)中溶液已混匀的6个小烧杯置于37℃干燥箱中温育60分钟。
(3)依次取出6个小烧杯中的ITO玻片，用磷酸盐缓冲液充分洗涤后放在滤纸上干燥。
(4)再取6个10ml清洗干净的小烧杯，分别在6个小烧杯中依次的50μl底物和50μl显色剂，混匀后依次在6个小烧杯中放入(3)中得到的ITO玻片，并让体系在避光条件下反应10分钟。
(5)在(4)的小烧杯中分别加入50μl浓度为2N的硫酸溶液终止(4)的反应，依次取出在(4)中6个小烧杯中得到的玻片，用PBS溶液清洗后放在滤纸上干燥，放入四个小滤纸袋中便于携带，纸袋上标记好。置于4℃冰箱中保存。
8)通过上述步骤即完成可用于肿瘤标志物检测的光电两用生物传感器的制作。

Claims (6)

1.一种可用于肿瘤标志物检测的光电两用生物传感器的制作方法，其特征在于它包括在ITO衬底沉积一薄层稳定的金膜，在金膜上固定能特异性识别肿瘤标志物的抗体/纳米金复合物膜，再把待检测肿瘤标志物结合到抗体/纳米金复合物膜上,采用如下方式在ITO金膜上固定能特异性识别肿瘤标志物的抗体/纳米金复合物膜，具体的，它是在24孔板的每个孔中加入1ml-2ml能特异性识别肿瘤标志物的抗体/纳米金复合物溶液，并在每孔溶液中放入1片金膜没有脱落的ITO玻片，盖上24孔板盖板放到在4℃冰箱中孵育48小时，孵育完成后取出玻片用PBS清洗备用。
2.根据权利要求1所述的一种可用于肿瘤标志物检测的光电两用生物传感器的制作方法，其特征在于：在ITO衬底沉积一薄层稳定的金膜时，它直接将清洗好的ITO导电玻璃置于装有金靶的小型离子溅射仪样品台上，溅射一定的时间得到一薄层金膜。
3.根据权利要求1所述的一种可用于肿瘤标志物检测的光电两用生物传感器的制作方法，其特征在于：在ITO衬底沉积一薄层稳定的金膜时，它直接将沉积一薄层金膜ITO玻片浸入二次蒸馏水中半小时来检测所沉积金膜的稳定性。
4.根据权利要求1所述的一种可用于肿瘤标志物检测的光电两用生物传感器的制作方法，其特征在于：所述能特异性识别肿瘤标志物的抗体/纳米金复合物溶液的制备方法:它需要一定量纳米金粒子溶液，用Na2CO3调pH值，加入一定量的CEA抗体，摇匀后，迅速加入一定量聚乙二醇(PEG)溶液，在常温下放置2-3h，在低温下高速离心10-30min，再吸去上清液，在沉淀中加入中性的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，除去未结合的抗体和PEG，重复操作2-3次后，将样品溶于一定量聚乙二醇的叠氮钠溶液，于4℃冰箱中冷藏保存备用。
5.根据权利要求4所述的一种可用于肿瘤标志物检测的光电两用生物传感器的制作方法，其特征在于，所述纳米金粒子溶液采用如下制备方法：它的制备需要取一定量的氯金酸水溶液，加热至沸腾搅动下加入一定量的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸一段时间，冷却后以蒸馏水恢复到原来的体积,置于冰箱保存备用。
6.根据权利要求1所述的一种可用于肿瘤标志物检测的光电两用生物传感器的制作方法，其特征在于，把待检测肿瘤标志物结合到抗体/纳米金复合物膜上采用如下所述的方法实现，它包含以下步骤：
(1)需要取6个10ml清洗干净的小烧杯，分别贴上标签1，2，3，4，5，6；然后在6个小烧杯中依次加入一定体积不同浓度的肿瘤标志物样品，随即加入一定量的酶标记物溶液，混匀后在每个小烧杯中加入1片固定有抗体/纳米金复合物的敷金ITO导电玻璃；
(2)需要把步骤(1)中溶液已混匀的6个小烧杯置于37℃干燥箱中温育60分钟；
(3)需要依次取出6个小烧杯中的ITO玻片，用磷酸盐缓冲液充分洗涤后放在滤纸上干燥；
(4)需要再取6个10ml清洗干净的小烧杯，分别在6个小烧杯中依次的加入50μl底物和50μl显色剂，混匀后依次在6个小烧杯中放入步骤(3)中得到的ITO玻片，并让体系在避光条件下反应5-10分钟；
(5)需要在步骤(4)的小烧杯中分别加入50μl一定浓度的硫酸溶液终止步骤(4)的反应，依次取出在步骤(4)中6个小烧杯中得到的玻片，用PBS溶液清洗后放在滤纸上干燥，放入四个小滤纸袋中便于携带，纸袋上标记好,置于4℃冰箱中保存。
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