CN104266984A - 一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，属于分析化学、食品安全检测技术领域。本发明将氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶构建了双酶偶联体系；氨基甲酸乙酯降解酶将氨基甲酸乙酯水解生成乙醇、水和氨，在谷氨酸脱氢酶催化下氨与共底物α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，同时伴随着还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化。从而该体系将氨基甲酸乙酯含量转化成NADH含量的变化，利用NADH在340nm处吸光值的变化，实现对液态体系中氨基甲酸乙酯含量的检测。该方法能够快速检测溶液及模拟黄酒体系中的氨基甲酸乙酯，检测限低至0.1μmol·L-1，为发酵食品和饮料中氨基甲酸乙酯的检测提供了有效的手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，属于分析化学、食品安全检测技术领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，简称EC），是一种具有遗传毒性及致癌性的物质，对啮齿类动物，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病。EC广泛存在于发酵食品（如酱油、腐乳等）、酿造酒（如黄酒、清酒、葡萄酒、苹果酒等）和蒸馏酒（如白兰地、威士忌等）中，主要通过酒精类饮料的摄入进入人体内。研究表明氨基甲酸乙酯在生物体内约有0.5%被细胞色素P450氧化为乙酰基氨基甲酸乙酯，再进一步形成乙酰基氨基甲酸乙酯环氧化物，此种物质能够在生物体内形成DNA加聚物，导致DNA结构的双链被破坏，进而导致细胞癌变；另有0.1%左右的氨基甲酸乙酯被细胞色素P450氧化为N-羟基氨基甲酸乙酯，这种物质诱导Cu2+调控的DNA损伤，引起癌变。
早在1985年，加拿大卫生与预防部门对酒精类饮料中的氨基甲酸乙酯含量做了强制性限量标准，随后世界其他国家也先后制定了各种饮料酒中的限量标准。同时，采取减少和去除食品中EC前体物质、选用选择性强和特性良好的能降低发酵过程中尿素排泄量的菌株、对发酵过程和蒸馏过程进行工艺改良、对发酵酒进行脲酶和EC降解酶酶法后处理等方法降低成品中EC的含量。各种检测饮料酒以及其他发酵食品中氨基甲酸乙酯含量的方法也不断发明和改善。
现阶段检测氨基甲酸乙酯含量的方法主要有：薄层分析法、傅立叶变换近红外光谱法(FTIR)，近红外光谱技术(NIR)，气相色谱分析法(GC)，气相色谱-质谱联用法(GC-MS)，气相色谱-串联质谱法(GC/MS/MS)，气相二维或多维色谱-稳定同位素稀释质谱联用技术(GC/GC/CIMS)，气相色谱/热离子检测器法(GC/TSD)，高效液相色谱(HPLC)以及高效液相-荧光法(HPLC-FLD)，液相色谱-串联质谱法(HPLC/MS/MS)等。以上检测方法虽然能够在一定范围内对氨基甲酸乙酯含量进行检测和定量，但大多需要对样品进行预处理、操作繁琐费时、重现性差、操作系统误差较大、方法的准确度和精确度较差、特异性低、容易受到发酵基体中其他物质的干扰，特别是气相色谱以及各种萃取方法需要有毒有机溶剂不利于分析人员的身体健康，在萃取过程及溶剂回收过程中会伴随着严重的污染问题；往往需要精密昂贵的检测仪器如质谱、电子捕获检测器、原子发射光谱检测器等，并且维护成本高，只能在具有大型、贵重仪器的专业实验室内进行检测，难以推广使用，不能满足我国发酵食品及酒精饮料中氨基甲酸乙酯快捷、简便、经济、环保的检测要求和限制标准。因此，研发和建立方便实用的快速检测方法是对发酵食品和饮料中EC含量检测所迫切需要解决的问题。
随着生物传感器的发展，双酶和多酶联用的生物传感器逐渐引起人们关注并得到了广泛的应用。现阶段已有许多酶传感器用于水体中氨、尿素、重金属离子、过氧化氢、苯酚、有机磷杀虫剂、坏血酸、谷氨酸以及其他氨基酸的检测。但目前还没有报道用于检测EC含量的酶传感器。
在2012年，本课题组的专利ZL201210125030.6《一种黄酒用氨基甲酸乙酯降解酶产生菌》，已公开了一种黄酒用氨基甲酸乙酯EC降解酶产生菌，其分类命名为变幻青霉（Penicillium variabile）JN-A525，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.5763。
本发明在前期筛选出产氨基甲酸乙酯降解酶的菌株的基础上，构建了氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶双酶体系实现对EC的快速检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于快速检测溶液中氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，要解决的技术问题是构建检测氨基甲酸乙酯所需要的双酶偶联体系。该体系中氨基甲酸乙酯降解酶将氨基甲酸乙酯水解生成乙醇、水和氨，在谷氨酸脱氢酶催化下氨与共底物α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，同时伴随着还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH被氧化。从而该体系将氨基甲酸乙酯含量转化成NADH含量的变化，利用NADH在340 nm处吸光值的变化，实现对液态体系中氨基甲酸乙酯含量的检测，原理图如图1所示。
本发明的技术方案，一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，步骤为：
（1）构建双酶偶联催化体系
a、酶源：氨基甲酸乙酯降解酶，对氨基甲酸乙酯EC降解酶产生菌菌株CGMCC NO.5763细胞培养后经超声破碎、离心、浓缩、凝胶层析、超滤浓缩后所得；谷氨酸脱氢酶则为市售商品酶；
b、酶液以及其他溶液的制备：用25mmol·L-1 PBS缓冲液溶解氨基甲酸乙酯降解酶以及谷氨酸脱氢酶，使得二者酶活分别为16U·mL-1和10U·mL-1；配制540mmol·L-1α-酮戊二酸溶液；7.5mmol·L-1NADH以及不同浓度的氨基甲酸乙酯标准溶液；
c、双酶偶联体系的构建：向反应体系中分别加入20μL上述氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶溶解液，66μL的α-酮戊二酸溶液，20μL NADH溶液，20μL 1mmol·L-1氨基甲酸乙酯溶液和454μL PBS缓冲液，使得总反应体系体积为600μL，置于石英比色皿中混合均匀；然后将此反应体系置于分光光度计中用动力学方法监测溶液中NADH在340nm处吸光值的变化情况；
（2）双酶偶联体系对氨基甲酸乙酯含量的快速测定：
d、用纯度大于99%的氨基甲酸乙酯配制浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5和1 mmol·L-1的母液；
e、向双酶偶联体系中加入适当体积和浓度的氨基甲酸乙酯母液使得反应体系中氨基甲酸乙酯浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50 μmol·L-1；将所得的溶液体系混合均匀后置于分光光度计中用动力学方法监测NADH在340 nm处吸光值的变化，反应时间为5min；将EC的浓度与340nm处吸光值在5min内的变化制作得到标准曲线，如图2所示；
f、向模拟黄酒样品（通过向pH 6.0，25 mmol·L-1PBS缓冲液中添加无水乙醇制备模拟黄酒，酒精度为15%）中添加一定量的氨基甲酸乙酯母液，在双酶偶联反应体系中反应5 min后检测NADH在340nm处的吸光值变化，通过对比标准曲线计算模拟酒样中氨基甲酸乙酯含量。
建立的方法能够快速检测并准确定量溶液样品中的氨基甲酸乙酯含量。在模拟黄酒样品中的检测限为0.1 μmol·L-1，线性相关系数为0.995，样品回收率为95.54%-100.01%，相对标准差为1.634%-4.611%（表1）。
表1检测模拟黄酒样品中氨基甲酸乙酯的回收率以及相对标准差
本发明的有益效果：本发明通过对双酶偶联体系中最适缓冲体系、氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶最适添加量、α-酮戊二酸最适反应浓度等多个实验条件进行优化，建立了快速实时检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法。该方法具有灵敏、快速、简捷、无需昂贵的仪器和复杂繁琐的操作工序等优点，克服了以往方法中的诸多不足。
附图说明
图1 双酶偶联检测氨基甲酸乙酯原理图。
图2 分光光度法氨基甲酸乙酯浓度标准曲线。
图3 双酶偶联体系最适反应缓冲液的确定。
具体实施方式
实施例1 双酶偶联体系最适反应缓冲体系的确定
在利用双酶偶联体系对氨基甲酸乙酯含量检测之前，首先对氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶双酶体系的最适反应缓冲体系进行优化。本发明中所采用的氨基甲酸乙酯降解酶在酸性环境下能够最大发挥催化活性，而谷氨酸脱氢酶在偏中碱性条件下催化活性较高。二者在同一反应体系中催化两步级联反应，缓冲液种类和pH不同，酶活性中心的微环境和催化反应速率均会发生变化。
首先配制浓度为25mmol·L-1的柠檬酸缓冲液（pH 4.5、5.5）、磷酸缓冲液（pH 6.0、6.5、7.0）和Tris-HCl缓冲液（pH7.5、8.0），并用相应pH的缓冲液溶解氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶，使得二者酶活均为10U·mL-1，配制540mmol·L-1α-酮戊二酸，0.1mmol·L-1EC以及7.5mmol·L-1NADH溶液，之后在不同pH的缓冲体系中添加等量的氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶、EC、α-酮戊二酸、NADH，使反应体系总体积为600μL，并使溶液中各物质混合均匀。然后置于分光光度计中用动力学法检测NADH在340 nm处的吸光值变化情况。结果如图3所示，在pH为6.0时，NADH的氧化速率最快，即就是在此pH条件下，氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶能够相对最为协调地偶联共同完成催化反应。因此检测体系选择pH 6.0的PBS缓冲液为最适反应缓冲体系。
实施例2 双酶偶联体系中氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶最适添加量的确定
在最适反应缓冲体系中，保持谷氨酸脱氢酶和其他反应底物的添加量不变的情况下，向体系中添加酶活分别为4、8、12及16 U·mL-1的氨基甲酸乙酯降解酶，而后将混合溶液置于340 nm处检测吸光值随时间变化情况。随着反应体系中氨基甲酸乙酯降解酶酶活的增加，分解EC产生氨的速率加快，谷氨酸脱氢酶利用氨转化α-酮戊二酸的速率同时加快，所以NADH的氧化速率也逐渐加快，表现为340 nm处吸光值的变化增大。酶活达到16 U·mL-1后，340 nm处吸光值的变化已经能在较短时间内达到平衡。基于现有氨基甲酸乙酯降解酶的水平，选用16 U·mL-1作为最适添加量。
在确定氨基甲酸乙酯降解酶的最适添加量后，用同样的方法，向反应体系中添加不同酶活的谷氨酸脱氢酶。同样的，随着反应体系中谷氨酸脱氢酶量的增加，NADH的氧化速率也逐渐加快。在谷氨酸脱氢酶添加量达到10 U·mL-1时，NADH的氧化速率达到最快，此后继续增加谷氨酸脱氢酶酶活，反应速率不再提高。因此确定在此反应体系中，谷氨酸脱氢酶的最适添加量为10 U·mL-1。
实施例3分光光度法氨基甲酸乙酯浓度标准曲线的建立
在最适反应缓冲体系中，确定的最适氨基甲酸乙酯降解酶及谷氨酸脱氢酶添加量的双酶偶联体系中，540mmol·L-1α-酮戊二酸，以及7.5mmol·L-1NADH溶液时，测得其A340为0.46733，添加氨基甲酸乙酯浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50 μmol·L-1后的A340分别为0.46733、0.48167、0.48567、0.49133、0.493、0.49767、0.502、0.5095、0.51233、0.55167、0.59833、0.63633、0.67633、0.737，由此ΔA340分别为0、0.01434、0.01834、0.024、0.02567、0.03034、0.03467、0.04217、0.045、0.08434、0.131、0.169、0.209、0.26967，以氨基甲酸乙酯浓度（μmol·L-1）为横坐标，以对应的ΔA340为纵坐标，作图即得分光光度法氨基甲酸乙酯浓度标准曲线。
Claims (1)
1.一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，其特征在于步骤为：
（1）构建双酶偶联催化体系
a、酶源：氨基甲酸乙酯降解酶，对氨基甲酸乙酯EC降解酶产生菌菌株CGMCC No.5763细胞培养后经超声破碎、离心、浓缩、凝胶层析、超滤浓缩后所得；谷氨酸脱氢酶则为市售商品酶；
b、酶液以及其他溶液的制备：用25mmol·L-1 PBS缓冲液溶解氨基甲酸乙酯降解酶以及谷氨酸脱氢酶，使得二者酶活分别为16U·mL-1及10U·mL-1；配制540mmol·L-1α-酮戊二酸溶液；7.5mmol·L-1NADH以及不同浓度的氨基甲酸乙酯标准溶液；
c、双酶偶联体系的构建：向反应体系中分别加入20μL上述氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶溶解液，66μL的α-酮戊二酸溶液，20μL NADH溶液，20μL 1mmol·L-1 氨基甲酸乙酯溶液和454μL PBS缓冲液，使得总反应体系体积为600μL，置于石英比色皿中混合均匀；然后将此反应体系置于分光光度计中用动力学方法监测溶液中NADH在340nm处吸光值的变化情况；
（2）双酶偶联体系对氨基甲酸乙酯含量的快速测定：
d．用纯度大于99%的氨基甲酸乙酯配制浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5和1 mmol·L-1的母液；
e、向双酶偶联体系中加入适当体积和浓度的氨基甲酸乙酯母液使得反应体系中氨基甲酸乙酯浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50 μmol·L-1；将所得的溶液体系混合均匀后置于分光光度计中用动力学方法监测NADH在340 nm处吸光值的变化，反应时间为5min；将EC的浓度与340nm处吸光值在5min内的变化制作得到标准曲线；
f、向黄酒样品中添加氨基甲酸乙酯母液使得样品中EC含量为5、10、20μmol·L-1，在双酶偶联反应体系中反应5min后检测NADH在340nm处的吸光值变化，通过对比标准曲线计算模拟酒样中氨基甲酸乙酯含量。
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