CN104212744A

CN104212744A - 一种原壁菌及其应用

Info

Publication number: CN104212744A
Application number: CN201410443051.1A
Authority: CN
Inventors: 赵晓祥; 张湾; 孙璐璐; 汪杏
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University; National Dong Hwa University
Priority date: 2014-09-02
Filing date: 2014-09-02
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2034-09-02
Also published as: CN104212744B

Abstract

本发明涉及一种原壁菌及其应用，菌种保藏编号为CGMCC NO.9400。应用：在无菌条件下，将原壁菌(Prototheca sp.)ZW-4菌株接种到富集培养基中，置于恒温摇床内培养，然后取富集培养的菌液进行离心，洗涤，配制成1％-15％的菌悬液；接种菌悬液于颜料红23脱色培养基中脱色，然后取菌液离心后在579nm处测上清液吸光度值，以颜料红23脱色培养基为空白对照，计算得到脱色率。菌株耐盐性良好，能在高达8％盐浓度下对染料进行有效脱色。

Description

一种原壁菌及其应用

技术领域

本发明属于菌种及其应用领域，特别涉及一种原壁菌及其应用。

背景技术

颜料红23作为一种色酚系偶氮有机颜料，偶氮颜料是指化学结构中含有偶氮基(-N＝N-)的有机颜料，是纺织品服装在印染工艺中应用最广泛的一类合成染料，用于多种天然和合成纤维的染色和印花，也用于油漆、塑料、橡胶等的着色。作为与人的生活息息相关的一种产品，它是广泛存在的全球性有机污染物，并且在特殊条件下，它能分解产生20多种致癌芳香胺，经过活化作用改变人体的DNA结构引起病变和诱发癌症，颜料工业是高污染行业，废水、废气，固体废物的排放量在石化行业也位居前列，早已成为环保部门重点监察对象，每年都有一些企业因为三废治理不达标而被环保部门实施经济处罚，并被限令停产或减产。可见保护环境、达标治理三废已成为决定企业生死存亡的关键，是稳定与和谐发展的第一要务。颜料企业必须在加强产业发展的同时，更要加大、加强对环保的投入，实现循环经济和可持续发展。偶氮颜料是有机颜料中品种最多和产量最大的一类，因此研究和解决偶氮颜料生产废水的处理方法可以解决大部分颜料化工厂的废水治理问题，具有很强的代表性。

目前，对颜料废水脱色方法的研究大多都集中在物化处理，这种处理工艺需要使用大量的混凝剂，或者造成用碱量过多，致使运行费用高，产泥量大，出水COD往往不能达标，随着近年来对颜料废水处理研究的增多，出现了光催化、吸附等新型物化处理材料，但对于颜料的物化法处理运行成本通常较高，且容易产生二次污染。从保护环境的角度来看，微生物具有繁殖速度快、适应性强等特点，利用高效脱色微生物进行环境污染治理不仅成本低，且可以减少二次污染的产生。因此，研究偶氮颜料的生物降解性对于评估其在生态环境中的滞留情况以及指导颜料的选用具有重要的现实意义，而且可以为选择合适的颜料生物处理方案提供理论依据。

由于微生物对环境的适应性强，且污染过程经历一段自然驯化期，因而可以通过驯化从自然环境中筛选到可降解某一污染物的微生物降解菌株。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种原壁菌及其应用，原壁菌(Prototheca sp.)菌在最适宜条件下：酵母粉浓度为1％，接种量为5％，pH为7.5，温度为35℃，盐度小于4％在此条件下，脱色率达到约92％；菌株耐盐性良好，能在高达8％盐浓度下对染料进行有效脱色。

本发明的一种原壁菌，原壁菌(Prototheca sp.)ZW-4的保藏编号为CGMCC NO.9400，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的一种原壁菌的应用，包括：

(1)在无菌条件下，将Prototheca sp.菌株接种到富集培养基中，置于恒温摇床内培养，然后取富集培养的菌液进行离心，洗涤，配制成1％-15％的菌悬液；

(2)接种菌悬液于颜料红23脱色培养基中脱色,取10mL反应液，10000r/min，离心6min，取上清液于颜料最大吸收波长λmax＝579nm处测定吸光度A_t,以不接菌的含相同浓度颜料的培养基的吸光度A₀为对照，计算得到脱色率η＝(A₀-At)/A₀×100％。

所述步骤(1)中富集培养基为10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/LNaCl，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.2。

所述步骤(1)中培养条件为：温度为30℃，摇床转速为150rpm，培养时间为48h。

所述步骤(1)中离心洗涤为用无菌生理盐水反复洗涤并离心2～3次，离心速率为5000-6000r/min。

所述步骤(2)中颜料红23脱色培养基为0.1g/LCaCl₂、0.5g/L MgSO₄·7H₂O、1g/LNaCl、1g/LKH₂PO₄、1g/LNa₂HPO₄、10g/L酵母粉、100mg/L颜料红23，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2。所述步骤(2)中脱色条件为酵母粉浓度为0.2-2％，接种量为1-15％，pH为4.5-9.5，温度为10-50℃，盐度小于16％。

所述步骤(2)中脱色条件为酵母粉浓度为1％，接种量为5％，pH为7.5，温度为35℃，盐度小于4％。

本发明的原壁菌(Prototheca sp.)ZW-4，已于2014年6月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.9400。

有益效果

原壁菌(Prototheca sp.)ZW-4在最适宜条件下：酵母粉浓度为1％，接种量为5％，pH为7.5，温度为35℃，盐度小于4％在此条件下，脱色率达到约92％；菌株耐盐性良好，能在高达8％盐浓度下对染料进行有效脱色。

附图说明

图1 Prototheca sp.菌株16S rDNA基因序列所属种群系统进化树；

图2 Prototheca sp.菌株的生长曲线及颜料红23的脱色曲线；

图3 营养源种类对颜料红23废水的脱色效果的影响；

图4 酵母粉浓度对颜料红23废水的脱色效果的影响；

图5 接种量对颜料红23废水的脱色效果的影响；

图6 温度对颜料红23废水的脱色效果的影响；

图7 pH对颜料红23废水的脱色效果的影响；

图8 盐度对颜料红23废水的脱色效果的影响；

图9 Prototheca sp.菌株对颜料红23废水脱色后产物的紫外光谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1、菌株的分离

(1)采集污水处理厂的活性污泥，置于一个长31.2cm，宽22.0cm，高22.5cm的玻璃驯化装置，在不加营养物质，没有进水出水交换的基础上用空压机不间断曝气3天。然后进行换水，排出装置中大约10L的泥水混合物，加入营养液并进行不间断曝气。在培养了10天后在加入营养液的同时开始加入颜料红23溶液，保持装置中颜料红23浓度在10mg/L左右，并按照SBR工艺(进水、曝气、静置、排水和闲置)进行驯化培养，隔天换水，培养驯化一个月。培养液的配制：400mg/L葡萄糖、80mg/L无水乙酸钠、125mg/L NaHCO3、4.75mg/LKCl、2.5mg/L无水CaCl₂、120mg/L、24 mg/L KH₂PO₄、27.5 mg/L MgSO₄·7H₂O、矿物盐配方1mL。矿物盐配方：375 mg/L FeCl₃、37.5 mg/L H₃BO₃、7.5 mg/LCuSO4·5H₂O、45 mg/L KI、30 mg/LMnCL₂·4H₂O、30 mg/L ZnSO₄·7H₂O、2500mg/LEDTA,配制成大约10升左右的营养液。

(2)取1mLSBR混合废水上清液，加入100mlLB液体培养基的250mL的三角瓶中，于30℃恒温振荡培养12h。采用相同的方法接种一代培养液1mL至新鲜的LB培养基中进行振荡培养，使样品中的好氧菌群得到富集和活化。富集培养基EM(Enrichment Medium)的主要成分为：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/LNaCl，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.2。

(3)分装颜料红23筛选培养基100mL于250mL的锥形瓶中，在无菌条件下，接种第一代活化菌液1mL进行筛选培养。采用此方法对混合菌液连续筛选培养5代，利用颜料红23作为碳源进行以3天为一个周期的逐渐增加污染物浓度的驯化方法进行驯化培养。摇床转速为150r/min，温度为30℃，培养时间为半个月。在无机盐培养基MSM(0.1g/LCaCl₂、0.5g/LMgSO₄·7H₂O、1g/LNaCl、1g/LKH₂PO₄、1g/LNa₂HPO₄，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2)中加入颜料红23溶液，配制颜料红23浓度梯度为20、40、60、80、100mg/L的驯化培养基。

(4)取驯化最后一个周期的驯化培养基1mL，按10倍稀释法，用无菌水将菌液作10^-1～10^-7 梯度稀释。每种稀释浓度分别取0.1mL菌液均匀涂布于固体培养基上，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养。固体培养基的主要成分为：10g/L鱼粉蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/LNaCl、100mg/L颜料红23、20g/L琼脂，蒸馏水1000mL，pH 6.8～7.2。

(5)待长出独立菌落后，观察各菌落形态，挑取形态清晰的单一菌落，在分离培养基上划线分离，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，再观察结果。反复5～7次，并在电子显微镜下观察，确保是纯的单一菌株后，将其命名为ZW 4，并将其接种到固体斜面培养基上，4℃下保存于冰箱中，待后续进行脱色试验。固体分离培养基SM(Separate Medium)的主要成分为：10g/L鱼粉蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/LNaCl、100mg/L颜料红23、20g/L琼脂，蒸馏水1000mL，pH 6.8～7.2。固体斜面培养基的主要成分：10g/L鱼粉蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/LNaCl、20g/L琼脂，蒸馏水1000mL，pH 6.8～7.2。

2、菌株的鉴定

(1)菌体及菌落形态特征

ZW-4菌株个体为球状，革兰氏染色阳性；其菌落为圆形，边缘整齐，乳白色，光滑，干燥，凸起。

通过对ZW-4菌株的16S rDNA序列测定和分析比较，该菌为新菌株，将该菌株命名为原壁菌(Prototheca sp.)ZW-4，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2

在无菌条件下，将ZW-4菌株接种到装有100mL富集培养基的250mL灭菌锥形瓶中，置于恒温摇床内，30℃，150 rpm，培养48h。富集培养基EM(Enrichment Medium)的主要成分为：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/LNaCl，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.2。

取富集培养的菌液于10mL灭菌离心管中，在以6000r/min的转速离心10min。之后用无菌生理盐水反复洗涤并离心2～3次，配成一定浓度的菌悬液，按10％的量接种于颜料红23的脱色培养基中进行脱色实验，18h后取10mL的培养基的物质于10000r/min的转速，离心6min，上清液经紫外分光光度计测定吸光度A，分析该菌对颜料红23的脱色效果。颜料红23脱色培养基主要成分为：0.1g/LCaCl₂、0.5g/L MgSO₄·7H₂O、1g/LNaCl、1g/LKH₂PO₄、1g/LNa₂HPO₄、10g/L酵母粉、100mg/L颜料红23，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2。

先将一株ZW-4菌株接种于颜料红23的脱色培养基中，每隔2个小时测定其吸光度和OD₆₀₀，绘制细菌的生长曲线和颜料脱色曲线，确定最佳脱色时间是18h。选取营养源种类，营养源浓度，接种量，pH，温度，盐度，作为重要的影响因素进行单因素分析，将实验得到的最佳营养源添加到含颜料无机盐培养基中构成染料脱色用培养基，来研究其他各影响因素对颜料脱色效果的影响。在研究各因素对菌株脱色效果的影响实验中，每个因子设置不同的影响梯度，研究其中某一因素的影响时，仅对该因素设置不同影响水平，其他因素保持不变，后面因素以前面实验得到的各因素最适条件为前提进行。所有实验均设置3组平行实验。结果表明：菌株脱色染料的最佳营养源是酵母粉，染料脱色最适宜条件为酵母粉浓度为1％，接种量为5％，pH为7.5，温度为35℃，盐度小于4％在此条件下，脱色率达到约92％。菌株耐盐性良好，能在高达8％盐浓度下对染料进行有效的脱色。此外，紫外可见光分光光度计扫描脱色代谢产物的吸收图谱表明，染料脱色过程主要以生物降解为主。

具体实施如下：

(1)菌体生长曲线及染料降解曲线测定

接种10％的菌悬液于100mL脱色培养基的250mL灭菌锥形瓶中，置于恒温摇床内，30℃，150 rpm，培养18h。脱色培养基的主要成分为：0.1g/LCaCl₂、0.5g/L MgSO₄·7H₂O、1g/LNaCl、1g/LKH₂PO₄、1g/LNa₂HPO₄、10g/L酵母粉、100mg/L颜料红23，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2。每2 h取样测菌体在600 nm处的吸光值(以液体脱色培养基为空白对照)。重复3次并取平均值。取10mL菌液离心后在579 nm处测上清液吸光度,以含有100 mg/L颜料红23的脱色培养基作为空白对照,并计算出脱色率。重复3次并取平均值。

(2)营养源种类对颜料脱色的影响

接种10％的菌悬液于100mL脱色培养基的250mL灭菌锥形瓶中，置于恒温摇床内，30℃，150 rpm，培养18h。无机盐培养基的主要成分为：0.1g/LCaCl₂、0.5g/L MgSO₄·7H₂O、1g/LNaCl、1g/LKH₂PO₄、1g/LNa₂HPO₄、100mg/L颜料红23，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2。分别加入1％的各类营养源，营养源种类如下：葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、尿素。取10mL菌液离心后在579 nm处测上清液吸光度,以含有100 mg/L颜料红23的脱色培养基作为空白对照,并计算出脱色率。重复3次并取平均值。

(3)营养源浓度对颜料脱色的影响

在最佳营养源是酵母粉的前提下，接种10％的菌悬液于100mL脱色培养基的250mL灭菌锥形瓶中，置于恒温摇床内，30℃，150 rpm，培养18h。脱色培养基的主要成分为：0.1g/LCaCl₂、0.5g/L MgSO₄·7H₂O、1g/LNaCl、1g/LKH₂PO₄、1g/LNa₂HPO₄、100mg/L颜料红23，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2。分别投入0.1％、0.3％、0.5％.、0.7％、1.0％、1.5％、2.0％的酵母粉。取10mL菌液离心后在579 nm处测上清液吸光度,以含有100 mg/L颜料红23的脱色培养基作为空白对照,并计算出脱色率。重复3次并取平均值。

(4)接种量对颜料脱色的影响

在最佳营养源浓度即酵母粉浓度为1％，分别接种1％、2％、3％、4％、5％、7％、10％、 12％、15％菌悬液于100mL脱色培养基的250mL灭菌锥形瓶中，置于恒温摇床内，30℃，150rpm，培养18h。脱色培养基的主要成分为：0.1g/LCaCl₂、0.5g/L MgSO₄·7H₂O、1g/LNaCl、1g/LKH₂PO₄、1g/LNa₂HPO₄、10g/L酵母粉、100mg/L颜料红23，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2。取10mL菌液离心后在579 nm处测上清液吸光度,以含有100 mg/L颜料红23的脱色培养基作为空白对照,并计算出脱色率。重复3次并取平均值。

(5)温度对颜料脱色的影响

在酵母粉浓度为1％，接种量为5％的前提下，pH为7.5，置于恒温摇床内，30℃，150 rpm，培养18h。脱色培养基的主要成分为：0.1g/LCaCl₂、0.5g/L MgSO₄·7H₂O、1g/LNaCl、1g/LKH₂PO₄、1g/LNa₂HPO₄、10g/L酵母粉、100mg/L颜料红23，蒸馏水1000mL。设置以下温度梯度10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃。取10mL菌液离心后在579nm处测上清液吸光度,以含有100 mg/L颜料红23的脱色培养基作为空白对照,并计算出脱色率。重复3次并取平均值。pH对颜料脱色的影响

(6)pH对颜料脱色的影响

在酵母粉浓度为1％，接种量为5％的前提下，置于恒温摇床内，30℃，150 rpm，培养18h。脱色培养基的主要成分为：0.1g/LCaCl₂、0.5g/L MgSO₄·7H₂O、1g/LNaCl、1g/LKH₂PO₄、1g/LNa₂HPO₄、10g/L酵母粉、100mg/L颜料红23，蒸馏水1000mL，分别调pH为3.5、4.5、5.5、6.5、7.0、7.5、8.5、9.5。取10mL菌液离心后在579 nm处测上清液吸光度,以含有100 mg/L颜料红23的脱色培养基作为空白对照,并计算出脱色率。重复3次并取平均值。

(7)盐度对颜料脱色的影响

在酵母粉浓度为1％，接种量为5％的前提下，pH为7.5，温度为35℃，置于恒温摇床内，30℃，150 rpm，培养18h。脱色培养基的主要成分为：0.1g/LCaCl₂、0.5g/L MgSO₄·7H₂O、1g/LNaCl、1g/LKH₂PO₄、1g/LNa₂HPO₄、10g/L酵母粉、100mg/L颜料红23，蒸馏水1000mL。设置以下盐度梯度0、0.5％、1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、15％取10mL菌液离心后在579 nm处测上清液吸光度,以含有100 mg/L颜料红23的脱色培养基作为空白对照,并计算出脱色率。重复3次并取平均值。

Claims

1.一种原壁菌，其特征在于：原壁菌(Prototheca sp.)ZW-4的保藏编号为CGMCC NO.9400，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种原壁菌的应用，包括：

(1)在无菌条件下，将原壁菌(Prototheca sp.)ZW-4接种到富集培养基中，置于恒温摇床内培养，然后取富集培养的菌液进行离心，洗涤，配制成1％-15％的菌悬液；

(2)接种菌悬液于颜料红23脱色培养基中脱色。

3.根据权利要求2所述的一种原壁菌的应用，其特征在于：所述步骤(1)中富集培养基为10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/LNaCl，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.2。

4.根据权利要求2所述的一种原壁菌的应用，其特征在于：所述步骤(1)中培养条件为：温度为30℃，摇床转速为150rpm，培养时间为48h。

5.根据权利要求2所述的一种原壁菌的应用，其特征在于：所述步骤(1)中离心洗涤为用无菌生理盐水反复洗涤并离心2～3次，离心速率为5000-6000r/min。

6.根据权利要求2所述的一种原壁菌的应用，其特征在于：所述步骤(2)中颜料红23脱色培养基为0.1g/LCaCl₂、0.5g/L MgSO₄·7H₂O、1g/LNaCl、1g/LKH₂PO₄、1g/LNa₂HPO₄、10g/L酵母粉、100mg/L颜料红23，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.2。

7.根据权利要求2所述的一种原壁菌的应用，其特征在于：所述步骤(2)中脱色条件为酵母粉浓度为0.2-2％，接种量为1-15％，pH为4.5-9.5，温度为10-50℃，盐度小于16％。

8.根据权利要求7所述的一种原壁菌的应用，其特征在于：所述脱色条件为酵母粉浓度为1％，接种量为5％，pH为7.5，温度为35℃，盐度小于4％。