CN104208679B - 一种抗猪圆环病毒病的组合物、混合冻干粉及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗猪圆环病毒病的组合物、混合冻干粉及制备方法，该组合物包括以下重量份数的组分：抗猪圆环病毒病卵黄抗体94～97份、抗猪圆环病毒病转移因子1～2份；混合冻干粉还包括防腐剂0.01～0.02份、灭活剂0.2～0.3份、硒0.05～0.1份、维生素C0.5～1份、聚乙烯吡咯烷酮1～2份、甘氨酸0.5～1份。本发明的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉，将抗猪圆环病毒病卵黄抗体与抗猪圆环病毒病转移因子进行复配，并辅以多种辅料，各组分相互配合，协调作用，可以显著提高其防治猪圆环病毒病的效果，具有针对性强、常温下保存时间长、抗体效价高、生物活性良好的优点，是一种具有广泛应用前景的强效生物制剂。

Description

一种抗猪圆环病毒病的组合物、混合冻干粉及制备方法

技术领域

本发明属于兽药技术领域，具体涉及一种抗猪圆环病毒病的组合物，同时还涉及一种抗猪圆环病毒病的混合冻干粉及该混合冻干粉的制备方法。

背景技术

生猪养殖在我国养殖业中占有较重的份额，仅河南省2009年产出的猪肉就达410.32万吨，由此可知，我国每年对于猪肉的需求量非常大。但是，随着猪肉需求的逐年递增及养殖规模的扩大，生猪养殖过程中也出现越来越多的问题，其中猪圆环病毒病是一种急性传染性疾病，给养猪业造成了巨大的经济损失。

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2，PCV2为致病性的病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)的主要病原。猪对PCV2具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。怀孕母猪感染PCV2后，可经胎盘垂直传播感染仔猪。

目前防治猪圆环病毒病的方法较多，主要是使用西药、接种免疫、中草药等进行防治。其中，西药使用的泛滥给猪肉类食品带来了极大的安全隐患，药物残留已经成为影响猪肉产品安全的主要因素之一。接种免疫早期效果较好，但是需要多次接种，操作麻烦，成本较高，容易造成应激反应；而且疫苗对于保藏条件要求较高，需要在2-8℃条件下冷藏，室温条件下一段时间则失去效果。中草药饲料添加剂也是目前的研究方向之一，但是由于中草药的种类较多，相同的中药材对不同的禽畜疾病的作用差异很大，且中草药对疾病的免疫效果极其有限，因此应用也具有一定的局限性。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗猪圆环病毒病的组合物，解决现有技术防治猪圆环病毒病存在的操作不便、药剂不易保存、效果较差的问题。

本发明的第二个目的是提供一种抗猪圆环病毒病的混合冻干粉。

本发明的第三个目的是提供一种抗猪圆环病毒病的混合冻干粉的制备方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种抗猪圆环病毒病的组合物，包括以下重量份数的组分：抗猪圆环病毒病卵黄抗体94～97份、抗猪圆环病毒病转移因子1～2份。

一种抗猪圆环病毒病的混合冻干粉，包括以下重量份数的组分：抗猪圆环病毒病卵黄抗体94～97份、抗猪圆环病毒病转移因子1～2份、防腐剂0.01～0.02份、灭活剂0.2～0.3份、硒0.05～0.1份、维生素C 0.5～1份、聚乙烯吡咯烷酮1～2份、甘氨酸0.5～1份。

所述灭活剂为甲醛。

所述防腐剂为硫柳汞。

一种上述的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉的制备方法，包括下列步骤：

a.采用猪圆环病毒标准株制备疫苗，免疫健康鸡群获得高免蛋，将高免蛋经过消毒、酸化处理、离心处理得到含有抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液；

b.将含有抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液与抗猪圆环病毒病转移因子、防腐剂、灭活剂、硒、维生素C、聚乙烯吡咯烷酮、甘氨酸混合，再冻干即得。

优选的，抗猪圆环病毒病的混合冻干粉的制备方法，包括下列步骤：

1)取猪圆环病毒标准株进行增殖，将其灭活制备成疫苗，每间隔7天对健康产蛋鸡群进行免疫，一共免疫三次，第二次免疫后开始检测抗体效价，当抗体效价达到1：256时，收集高免蛋，将收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用；

2)将步骤1)所得高免蛋分离得到高免蛋卵黄，加入等体积的无菌水，充分搅拌，得到卵黄抗体溶液，在卵黄抗体溶液中加入酸化水溶液，混匀、静置沉淀，取上清液备用；

3)在步骤2)所得上清液中加入钠盐使钠盐体积占总体积的0.8％，离心分离，得含有抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液；

4)取步骤3)所得的含有94～97重量份的抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液，加入1～2重量份抗猪圆环病毒病转移因子，过滤，留滤液备用；

5)将步骤4)所得滤液浓缩至2.5ml/500羽份，加入防腐剂0.01～0.02重量份、灭活剂0.2～0.3重量份、硒0.05～0.1重量份、维生素C 0.5～1重量份、聚乙烯吡咯烷酮1～2重量份、甘氨酸0.5～1重量份进行混合，先-20℃预冷，再在-80℃条件下冻干，即得。

步骤2)中所述酸化水溶液的pH为4.9～5.2；酸化水溶液的加入量为卵黄抗体溶液体积的8倍。所述酸化水溶液可为盐酸化水溶液。

步骤3)中所述钠盐为NaCl与Na₂SO₄的质量比为4:1的混合物。

步骤3)中所述离心分离的转速为15000rpm，时间为20min。

步骤4)中所述过滤是先用0.45μm的滤膜进行过滤，截留分子量大于200KD的大分子，再将滤液用0.22μm的滤膜过滤。

卵黄抗体是一种免疫球蛋白，由于机体受到外界抗原的刺激而产生的一种应激产物，可以和相应抗原结合，消除病因。本发明将猪圆环病毒病的疫苗免疫接种健康的鸡群，可以使获得的鸡蛋蛋黄中产生有效的抗猪圆环病毒病卵黄抗体，同时减少了毒株返祖的可能性。

转移因子携带有致敏淋巴细胞的特异性免疫信息，能够将特异性免疫信息呈递给受体淋巴细胞，使受体无活性的淋巴细胞转变为特异性致敏淋巴细胞，从而激发受体细胞介导的免疫反应。

本发明的抗猪圆环病毒病的组合物中，抗猪圆环病毒病卵黄抗体是一种免疫球蛋白，对猪圆环病毒病有很好的防治效果；抗猪圆环病毒病转移因子本身是一种特异抗病毒因子，将两者结合使用，可极大地提高预防和治疗猪圆环病毒病的效果。

本发明的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉，将抗猪圆环病毒病卵黄抗体与抗猪圆环病毒病转移因子进行复配，并辅以防腐剂、灭活剂、硒、维生素C、聚乙烯吡咯烷酮和甘氨酸制备混合冻干粉，各组分相互配合，协调作用，可以显著提高其防治猪圆环病毒病的效果，具有针对性强、常温下保存时间长、抗体效价高、生物活性良好的优点，是一种具有广泛应用前景的强效生物制剂；经动物试验证明，本发明的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉，对猪圆环病毒病的防治效果要明显优于抗猪圆环病毒病卵黄抗体、抗猪圆环病毒病转移因子中任意一种单独使用的情况。

本发明的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉，使用时，可作为饲料添加剂按质量分数2％～3％混入饲料中；发病时采用肌注方式给药，每100ml注射液中含有混合冻干粉2g，注射液的使用量为每次0.1～0.2ml/kg体重；首次用药加倍，治疗效果更好。

本发明的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉的制备方法，将抗猪圆环病毒病卵黄抗体、抗猪圆环病毒病转移因子和多种辅料进行复配，并通过调整辅料的成分、控制其用量，进一步延长了卵黄抗体的保存时间，保证了卵黄抗体在常温下较长时间内的活性，降低了冻干粉制剂的保存和运输成本，使用方便，具有广泛的应用前景；制备方法工艺简单，操作方便，极大的降低了生产成本，适合大规模工业化生产。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

本发明的具体实施方式中，所用猪圆环病毒为国家标准毒株。

本发明的具体实施方式中，所用抗猪圆环病毒病转移因子，是由以下方法制备的：

1)用猪圆环病毒抗原对猪脾脏进行免疫后，去其表面筋、脂肪，再用灭菌后的生理盐水冲洗；

2)将冲洗后的猪脾脏破碎后，加入2倍体积的预冷后的PBS缓冲液，用组织匀浆仪将其匀质，得匀浆液；

3)将匀浆液用超声破碎仪处理5～10min后，调节pH为5.5，在5000～6000rpm转速下离心30min，收集上清液；

4)将步骤3)所得上清液用微滤膜过滤，截留分子量为7000道尔顿以上的物质，将所得滤液用除菌滤膜过滤，即得抗猪圆环病毒病转移因子原液，在4℃条件下保存备用。

实施例1

本实施例的抗猪圆环病毒病的组合物，包括以下重量份数的组分：抗猪圆环病毒病卵黄抗体94份、抗猪圆环病毒病转移因子2份。

本实施例的使用上述组合物制成的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉，包括以下重量份数的组分：抗猪圆环病毒病卵黄抗体94份、抗猪圆环病毒病转移因子2份、硫柳汞0.02份、甲醛0.2份、硒0.05份、维生素C 1份、聚乙烯吡咯烷酮2份、甘氨酸0.5份。

本实施例的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉的制备方法，包括下列步骤：

1)取猪圆环病毒标准毒株(2型)进行增殖，将其灭活制备成疫苗，每间隔7天对健康产蛋鸡群进行免疫，一共免疫三次，第一次免疫健康鸡群接种灭活疫苗1.5ml，第二次、第三次免疫接种加量1倍，第二次免疫后开始检测抗体效价，当抗体效价达到1：256时，收集高免蛋，将收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用；

2)将步骤1)所得高免蛋分离得到高免蛋卵黄，加入等体积的无菌水，充分搅拌，得到卵黄抗体溶液，在卵黄抗体溶液中加入pH为5.0的酸化水溶液，酸化水溶液加入量为卵黄抗体溶液体积的8倍，混匀、静置沉淀，取上清液备用；

3)在步骤2)所得上清液中加入由NaCl与Na₂SO₄按质量比为4:1的比例混合形成的混合钠盐，使混合钠盐体积占总体积的0.8％，以15000rpm的转速离心20min，得含有抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液；

4)取步骤3)所得的含有94重量份的抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液，加入2重量份抗猪圆环病毒病转移因子，用0.45μm的滤膜进行过滤，截流分子量大于200KD的大分子物质，再将滤液经0.22μm滤膜过滤，留滤液备用；

5)将步骤4)所得滤液浓缩至2.5ml/500羽份，加入硫柳汞0.02重量份、甲醛0.2重量份、硒0.05重量份、维生素C 1重量份、聚乙烯吡咯烷酮2重量份、甘氨酸0.5重量份进行混合，先-20℃预冷，再在-80℃条件下冻干，即得。

实施例2

本实施例的抗猪圆环病毒病的组合物，包括以下重量份数的组分：抗猪圆环病毒病卵黄抗体95份、抗猪圆环病毒病转移因子1.5份。

本实施例的使用上述组合物制成的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉，包括以下重量份数的组分：抗猪圆环病毒病卵黄抗体95份、抗猪圆环病毒病转移因子1.5份、硫柳汞0.01份、甲醛0.3份、硒0.1份、维生素C 0.5份、聚乙烯吡咯烷酮1.5份、甘氨酸1份。

本实施例的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉的制备方法，包括下列步骤：

1)取猪圆环病毒标准毒株(2型)进行增殖，将其灭活制备成疫苗，每间隔7天对健康产蛋鸡群进行免疫，一共免疫三次，第一次免疫健康鸡群接种灭活疫苗1.5ml，第二次、第三次免疫接种加量1倍，第二次免疫后开始检测抗体效价，当抗体效价达到1：256时，收集高免蛋，将收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用；

2)将步骤1)所得高免蛋分离得到高免蛋卵黄，加入等体积的无菌水，充分搅拌，得到卵黄抗体溶液，在卵黄抗体溶液中加入pH为5.0的酸化水溶液，酸化水溶液加入量为卵黄抗体溶液体积的8倍，混匀、静置沉淀，取上清液备用；

3)在步骤2)所得上清液中加入由NaCl与Na₂SO₄按质量比为4:1的比例混合形成的混合钠盐，使混合钠盐体积占总体积的0.8％，以15000rpm的转速离心20min，得含有抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液；

4)取步骤3)所得的含有95重量份的抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液，加入1.5重量份抗猪圆环病毒病转移因子，用0.45μm的滤膜进行过滤，截流分子量大于200KD的大分子物质，再将滤液经0.22μm滤膜过滤，留滤液备用；

5)将步骤4)所得滤液浓缩至2.5ml/500羽份，加入硫柳汞0.01重量份、甲醛0.3重量份、硒0.1重量份、维生素C 0.5重量份、聚乙烯吡咯烷酮1.5重量份、甘氨酸1重量份进行混合，先-20℃预冷，再在-80℃条件下冻干，即得。

实施例3

本实施例的抗猪圆环病毒病的组合物，包括以下重量份数的组分：抗猪圆环病毒病卵黄抗体97份、抗猪圆环病毒病转移因子1份。

本实施例的使用上述组合物制成的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉，包括以下重量份数的组分：抗猪圆环病毒病卵黄抗体97份、抗猪圆环病毒病转移因子1份、硫柳汞0.01份、甲醛0.25份、硒0.08份、维生素C 1份、聚乙烯吡咯烷酮1份、甘氨酸0.5份。

本实施例的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉的制备方法，包括下列步骤：

1)取猪圆环病毒标准毒株(2型)进行增殖，将其灭活制备成疫苗，每间隔7天对健康产蛋鸡群进行免疫，一共免疫三次，第一次免疫健康鸡群接种灭活疫苗1.5ml，第二次、第三次免疫接种加量1倍，第二次免疫后开始检测抗体效价，当抗体效价达到1：256时，收集高免蛋，将收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用；

2)将步骤1)所得高免蛋分离得到高免蛋卵黄，加入等体积的无菌水，充分搅拌，得到卵黄抗体溶液，在卵黄抗体溶液中加入pH为5.0的酸化水溶液，酸化水溶液加入量为卵黄抗体溶液体积的8倍，混匀、静置沉淀，取上清液备用；

3)在步骤2)所得上清液中加入由NaCl与Na₂SO₄按质量比为4:1的比例混合形成的混合钠盐，使混合钠盐体积占总体积的0.8％，以15000rpm的转速离心20min，得含有抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液；

4)取步骤3)所得的含有97重量份的抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液，加入1重量份抗猪圆环病毒病转移因子，用0.45μm的滤膜进行过滤，截流分子量大于200KD的大分子物质，再将滤液经0.22μm滤膜过滤，留滤液备用；

5)将步骤4)所得滤液浓缩至2.5ml/500羽份，加入硫柳汞0.01重量份、甲醛0.25重量份、硒0.08重量份、维生素C 1重量份、聚乙烯吡咯烷酮1重量份、甘氨酸0.5重量份进行混合，先-20℃预冷，再在-80℃条件下冻干，即得。

实验例1

本实验例对实施例1～3所得混合冻干粉进行性能检测，结果如表1、2所示。

常温效价检测实验方法：将实施例1～3所得混合冻干粉制剂保存在37℃培养箱中，保存24个月，分别在1周、2周、1月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后，用琼脂扩散(AGP)法，测定每个时间点所取样品的卵黄抗体效价变化。

表1实施例1～3所得混合冻干粉常温效价检测实验结果(项目：PRRS)

组别

1周

2周

1月

2月

4月

8月

12月

16月

20月

24月

实施例1

1：32

1：32

1：32

1：32

1：32

1：16

1；16

1：16

1：16

1：16

实施例2

1：32

1：32

1：32

1：32

1：32

1：32

1；16

1：16

1：16

1：16

实施例3

1：32

1：32

1：32

1：32

1：32

1：32

1；16

1：16

1：16

1：16

表2实施例1～3所得混合冻干粉常温放置性能检测结果

实验例2

本实验例对实施例1～3的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉防治猪圆环病毒病的效果进行临床实验。

实验方法：选取1.5月龄猪700只，其中100只作为攻毒组隔离饲养，100只作为空白组隔离饲养，200只作为对照组分为2组，每组100只，隔离饲养，分别用对比例1、2的制剂治疗，另外300只作为试验组分为3组，每组100只，分别用实施例1、2、3的制剂治疗。饲养方式为自由采食普通饲料，自由饮水，24h后，取试验组、对照组和攻毒组的猪肌注接种稀释后的猪圆环病毒液，接种量为2ml/只；感染后开始针对性治疗，肌肉注射，注射液给药量为0.2ml/kg体重；记录120h后的死亡情况，结果如表3所示。

表3实施例1～3所得混合冻干粉对猪圆环病毒病的防治效果实验结果

对比例1的药剂由以下重量份数的组分组成：抗猪圆环病毒病卵黄抗体97份、硫柳汞0.01份、甲醛0.25份、硒0.08份、维生素C 0.8份、聚乙烯吡咯烷酮1.5份、甘氨酸0.5份。

对比例2的药剂由以下重量份数的组分组成：抗猪圆环病毒病转移因子2份、硫柳汞0.01份、甲醛0.25份、硒0.08份、维生素C 0.8份、聚乙烯吡咯烷酮1.5份、甘氨酸0.5份。

从表3中可以看出，实施例1～3所得混合冻干粉可以有效防治猪圆环病毒病，且混合冻干粉效果要明显优于抗猪圆环病毒病卵黄抗体、抗猪圆环病毒病转移因子中任意一种单独使用的情况。

Claims (9)

1.一种抗猪圆环病毒病的混合冻干粉，其特征在于：包括以下重量份数的组分：抗猪圆环病毒病卵黄抗体94～97份、抗猪圆环病毒病转移因子1～2份、防腐剂0.01～0.02份、灭活剂0.2～0.3份、硒0.05～0.1份、维生素C 0.5～1份、聚乙烯吡咯烷酮1～2份、甘氨酸0.5～1份；

所述抗猪圆环病毒病的混合冻干粉是由以下方法制备的：

a.采用猪圆环病毒标准株制备疫苗，免疫健康鸡群获得高免蛋，将高免蛋经过消毒、酸化处理、离心处理得到含有抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液；

b.将含有抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液与抗猪圆环病毒病转移因子、防腐剂、灭活剂、硒、维生素C、聚乙烯吡咯烷酮、甘氨酸混合，再冻干即得；

其中，所用抗猪圆环病毒病转移因子，是由以下方法制备的：

1)用猪圆环病毒抗原对猪脾脏进行免疫后，去其表面筋、脂肪，再用灭菌后的生理盐水冲洗；

2)将冲洗后的猪脾脏破碎后，加入2倍体积的预冷后的PBS缓冲液，用组织匀浆仪将其匀质，得匀浆液；

3)将匀浆液用超声破碎仪处理5～10min后，调节pH为5.5，在5000～6000rpm转速下离心30min，收集上清液；

4)将步骤3)所得上清液用微滤膜过滤，截留分子量为7000道尔顿以上的物质，将所得滤液用除菌滤膜过滤，即得抗猪圆环病毒病转移因子原液，在4℃条件下保存备用。

2.根据权利要求1所述的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉，其特征在于：所述灭活剂为甲醛。

3.根据权利要求1所述的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉，其特征在于：所述防腐剂为硫柳汞。

4.一种如权利要求1所述的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：

a.采用猪圆环病毒标准株制备疫苗，免疫健康鸡群获得高免蛋，将高免蛋经过消毒、酸化处理、离心处理得到含有抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液；

b.将含有抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液与抗猪圆环病毒病转移因子、防腐剂、灭活剂、硒、维生素C、聚乙烯吡咯烷酮、甘氨酸混合，再冻干即得。

5.根据权利要求4所述的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：

1)取猪圆环病毒标准株进行增殖，将其灭活制备成疫苗，每间隔7天对健康产蛋鸡群进行免疫，一共免疫三次，第二次免疫后开始检测抗体效价，当抗体效价达到1：256时，收集高免蛋，将收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用；

2)将步骤1)所得高免蛋分离得到高免蛋卵黄，加入等体积的无菌水，充分搅拌，得到卵黄抗体溶液，在卵黄抗体溶液中加入酸化水溶液，混匀、静置沉淀，取上清液备用；

3)在步骤2)所得上清液中加入钠盐使钠盐体积占总体积的0.8％，离心分离，得含有抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液；

4)取步骤3)所得的含有94～97重量份的抗猪圆环病毒病卵黄抗体的上清液，加入1～2重量份抗猪圆环病毒病转移因子，过滤，留滤液备用；

5)将步骤4)所得滤液浓缩至2.5ml/500羽份，加入防腐剂0.01～0.02重量份、灭活剂0.2～0.3重量份、硒0.05～0.1重量份、维生素C 0.5～1重量份、聚乙烯吡咯烷酮1～2重量份、甘氨酸0.5～1重量份进行混合，先-20℃预冷，再在-80℃条件下冻干，即得。

6.根据权利要求5所述的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述酸化水溶液的pH为4.9～5.2；酸化水溶液的加入量为卵黄抗体溶液体积的8倍。

7.根据权利要求5所述的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述钠盐为NaCl与Na₂SO₄的质量比为4:1的混合物。

8.根据权利要求5所述的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述离心分离的转速为15000rpm，时间为20min。

9.根据权利要求5所述的抗猪圆环病毒病的混合冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤4)中所述过滤是先用0.45μm的滤膜进行过滤，截留分子量大于200KD的大分子，再将滤液用0.22μm的滤膜过滤。