CN104185634A - 制备螺旋吲哚酮和其中间体的化学工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产螺旋吲哚酮化合物如(1'R,3'S)-5,7'-二氯-6'-氟-3'-甲基-2',3',4',9'-四氢螺[二氢吲哚-3,1'-吡啶并[3,4-b]吲哚]-2-酮及其盐和水合物及溶剂合物的方法和中间体。

Description

制备螺旋吲哚酮和其中间体的化学工艺
引用序列表、表格或计算机程序
序列表的正式文本作为ASCII格式化文本文件与本说明书经EFS-Web同时提交，文件名为“PAT055051_seql2.txt”，创建日期是2013年3月22日，大小为447千字节。经EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分并通过引用全文纳入本文。
现有技术：
已知(1'R,3'S)-5,7'-二氯-6'-氟-3'-甲基-2',3',4',9'-四氢螺[二氢吲哚-3,1'-吡啶并[3,4-b]吲哚]-2-酮(如式(IV)的化合物，其包括螺旋吲哚酮部分)和用于制备的6步合成法，包括已知的手性胺中间化合物(IIA)(WO 2009/132921)：
发明：
本发明涉及合成螺旋吲哚酮化合物，特别是(1'R,3'S)-5,7'-二氯-6'-氟-3'-甲基-2',3',4',9'-四氢螺[二氢吲哚-3,1'-吡啶并[3,4-b]吲哚]-2-酮的改良方法，以及所述改良方法中使用的中间体。
在第一个实施方式中，本发明是制备式(II)化合物、或者其盐或溶剂合物或水合物的方法，
包括使式(I)化合物转化成(II)化合物或其盐、溶剂合物或水合物，
其中：虚线是键或缺失；A选自C＝O和C＝NH；或当虚线是双键时，A-R8是：
Ra是C1-6烷基；R1是H、-CH3,
R4和R7各自独立是H或-Cl；R5是H、-OH、-CH3、-OCH3、-F、-Cl、-CF3或-CN；R6是H、-OH、-OCH3、-F或-Cl；R8是H、-CH3、-CH2CH3、-CH2OH、-CO2H、-CO2CH3、-CO2CH2CH3或-CF3；且n是1或2。
在第二个实施方式中，本发明是制备式(IIA)化合物或者其盐或水合物或溶剂合物的方法，
包括使式(IA)化合物或者其盐或溶剂合物或水合物发生酶促转氨，
以提供式(IIA)化合物。
在第三个实施方式中，本发明是制备式(IV)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物的方法，
包括使式(III)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物
与式(II)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物反应，
其中式(II)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物制备自式(I)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物，
其中：虚线是键或缺失；A选自C＝O和C＝NH；或当虚线是双键时，A-R8是：
Ra是C1-6烷基；R1是(C1-C6)烷基，可选取代有氨基、(C1-C6)烷基氨基、(C1-C6)烷基二烷基氨基或(C1-C6)烷基C(O)NH(C1-6)烷基；R4和R7各自独立是H或卤素；R5和R6各自独立是氢、卤素、羟基、(C1-C6)烷基、三卤(C1)烷基、氰基或(C1-C6)烷氧基；R8是(C1-C6)烷基，可选取代有羟基；n是1或2；R1’是氢或(C1-C6)烷基；且R4’、R5’、R6’和R7’各自独立是氢、卤素、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、(C1-C6)烷基和(C1-C6)烷氧基。
在第四个实施方式中，本发明是制备式(IVA)化合物、或者其盐或溶剂合物或水合物的方法，
包括：使式(IIIA)化合物或者其盐或溶剂合物或水合物
与式(II)化合物或者其盐或溶剂合物或水合物反应，
以提供式(IVA)化合物、或者其盐或溶剂合物或水合物，
其中式(IIA)化合物制备自式(IA)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物，
在第五个实施方式中，本发明是式(IC)化合物：
其中：R1是(C1-C6)烷基，可选取代有氨基、(C1-C6)烷基氨基、(C1-C6)烷基二烷基氨基或(C1-C6)烷基C(O)NH(C1-6)烷基；R5和R6各自独立是氢、卤素、羟基、(C1-C6)烷基、三卤(C1)烷基、氰基或(C1-C6)烷氧基；R8是(C1-C6)烷基，可选取代有羟基；n是1或2；或其药学上可接受盐或水合物或溶剂合物。
在第六个实施方式中，本发明是选自以下的化合物：
其药学上可接受盐、溶剂合物或水合物。
技术领域
本发明涉及用于治疗寄生虫病的螺旋吲哚酮化合物制备的新方法、新方法步骤和新型中间体，所述化合物包括例如螺旋吲哚酮部分，如(1'R,3'S)-5,7'-二氯-6'-氟-3'-甲基-2',3',4',9'-四氢螺[二氢吲哚-3,1'-吡啶并[3,4-b]吲哚]-2-酮。
发明背景
本发明涉及制备螺旋吲哚酮化合物的方法，如(1'R,3'S)-5,7'-二氯-6'-氟-3'-甲基-2',3',4',9'-四氢螺[二氢吲哚-3,1'-吡啶并[3,4-b]吲哚]-2-酮。
(1'R,3'S)-5,7'-二氯-6'-氟-3'-甲基-2',3',4',9'-四氢螺[二氢吲哚-3,1'-吡啶并[3,4-b]吲哚]-2-酮用于治疗和/或预防感染如由镰状疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)和利什曼原虫(Leishmania)属寄生虫如杜氏利什曼虫(Leishmania donovani.)引起的感染，且其具有下列结构：
(1'R,3'S)-5,7'-二氯-6'-氟-3'-甲基-2',3',4',9'-四氢螺[二氢吲哚-3,1'-吡啶并[3,4-b]吲哚]-2-酮和其合成描述于WO 2009/132921Al，特别是其中的实施例49。
需要提供制备(1'R,3'S)-5,7'-二氯-6'-氟-3'-甲基-2',3',4',9'-四氢螺[二氢吲哚-3,1'-吡啶并[3,4-b]吲哚]-2-酮的新方法以改善总体合成效率从而使其适于生产。特别需要增加合成手性胺中间体(IIA)的效率：
发明详述
方案1概括了本发明所述方法，该方法用于生成螺旋吲哚酮化合物如式(IV)所述化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物，以及中间体，如本文所定义。
即，根据方法1、2、3、4、5或6将式(I)化合物或者其盐或水合物或溶剂合物转化成式(II)化合物或者其盐或水合物或溶剂合物，其中
-方法1包括
a)酶促转氨以使式(I)化合物或者其盐或水合物或溶剂合物转化成式(II)化合物或者其盐或水合物或溶剂合物
-方法2包括
a)化学不对称催化以使式(I)化合物或者其盐或水合物或溶剂合物转化成式(II)化合物或其盐；
-方法3包括
a)化学不对称还原以使式(I)化合物或者其盐或水合物或溶剂合物转化成式(II)化合物或者其盐或水合物或溶剂合物；
-方法4包括
a)还原然后手性拆分，以使式(I)化合物或者其盐或水合物或溶剂合物转化成式(II)化合物或者其盐或水合物或溶剂合物；
-方法5包括
a)脂肪酶拆分以使式(II)化合物或者其盐或水合物或溶剂合物的外消旋物转化成式(II)的单一对映体化合物或者其盐或水合物或溶剂合物；
诺维信(Novozyme)435：丙烯酸树脂上固定的南极假丝酵母(CandidaAntarctica)脂肪酶B
-方法6包括
a)方法1-5中2种或更多种的组合以使式(I)化合物或者其盐或水合物或溶剂合物转化成式(II)化合物或者其盐或水合物或溶剂合物。
式(II)化合物或其盐可转化成式(IV)化合物或其盐，如WO 2009/132921所述，特别如相关权利要求和实施例所述，所述专利通过引用纳入本文。
本发明特别涉及各部分所述方法。同样，本发明独立涉及对应部分内工艺顺序所述的各单独步骤。因此，本文所述由一系列步骤组成的任何方法的每个步骤其本身就是本发明的优选实施方式。因而，本发明还涉及这些方法的实施方式，根据其，任何方法步骤内可作为中间体获得的化合物用作起始材料。
同样，本发明涉及特定开发用于制备本发明所述化合物的新型起始材料、其应用和制备方法。
本发明还涉及特定开发用于制备本发明所述化合物的中间体、其应用和制备方法。
注意到本申请中，通常在一个部分内作出的解释也适用于其他部分，除非另有说明。例如，若式(I)出现在其他部分如B部分，A部分给出的式(I)中残基R1的解释也适用，除非另有说明。
A部分：制备式(I)化合物
式(I)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物可如下所述和/或如本文所含实施例1-3所述制备。
B部分：式(I)化合物转化成式(II)化合物
在第一个实施方式中，本发明是制备式(II)化合物、或者其盐或溶剂合物或水合物的方法，
包括使式(I)化合物转化成式(II)化合物或其盐、溶剂合物或水合物，
其中：虚线是键或缺失；A选自C＝O和C＝NH；或当虚线是双键时，A-R8是：
Ra是C1-6烷基；R1是H、-CH3、
R4和R7各自独立是H或-Cl；R5是H、-OH、-CH3、-OCH3、-F、-Cl、-CF3或-CN；R6是H、-OH、-OCH3、-F或-Cl；R8是H、-CH3、-CH2CH3、-CH2OH、-CO2H、-CO2CH3、-CO2CH2CH3或-CF3；且n是1或2。
在第一个替代的实施方式中，本发明是使式(I)化合物转化成式(II)化合物的方法，其中当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氟。
在第二个替代的实施方式中，本发明是使式(I)化合物转化成式(II)化合物的方法，其中当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氟和氯。
在第三个替代的实施方式中，本发明是使式(I)化合物转化成式(II)化合物的方法，其中当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氢。
在第四个替代的实施方式中，本发明是使式(I)化合物转化成式(II)化合物的方法，其中当n是1且R6是氢时，R5是氟。
在第六个替代的实施方式中，本发明是使式(I)化合物转化成式(II)化合物的方法，其中式(II)化合物具有式(IIA)、或其盐或溶剂合物或水合物，
在第七个替代的实施方式中，本发明是使式(I)化合物转化成式(II)化合物的方法，其中式(II)化合物在选自以下的条件下转化自式(I)化合物：酶促转氨、化学不对称催化、不对称还原和手性拆分、或2种或更多种条件的组合。
在第八个替代的实施方式中，本发明是使式(I)化合物转化成式(II)化合物的方法，其中A是C＝O。
在第九个替代的实施方式中，本发明是使式(I)化合物转化成式(II)化合物的方法，其中式(I)化合物是式(IA)化合物或者其盐或水合物溶剂合物。
在一个示例性实施方式中，所述酶是SEQ ID NO:134。
在第二个实施方式中，本发明是制备式(IIA)化合物或者其盐或水合物或溶剂合物的方法，
包括使式(IA)化合物或者其盐或溶剂合物或水合物发生酶促转氨，
以提供式(IIA)化合物。
通常，将酮化合物(I)溶于有机溶剂如乙二醇，并加入异丙胺HCL和磷酸吡哆醛的水性混合物，然后加入TEA缓冲液。随后用合适碱如NaOH调整pH至中性，接着升温并加入转氨酶。所述反应能在室温搅拌约24小时。所述固体手性胺产物(式(II)化合物)通过本领域技术人员已知的方式、和/或根据实施例10-12来分离。
在一个示例性实施方式中，所述酶是SEQ ID NO:134。
C部分：式(II)化合物转化成式(IV)化合物
在第三个实施方式中，本发明是制备式(IV)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物的方法，
包括使式(III)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物
与式(II)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物反应，
其中式(II)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物制备自式(I)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物，
其中：虚线是键或缺失；A选自C＝O和C＝NH；或当虚线是双键时，A-R8是：
Ra是C1-6烷基；R1是(C1-C6)烷基，可选取代有氨基、(C1-C6)烷基氨基、(C1-C6)烷基二烷基氨基或(C1-C6)烷基C(O)NH(C1-6)烷基；R4和R7各自独立是H或卤素；R5和R6各自独立是氢、卤素、羟基、(C1-C6)烷基、三卤(C1)烷基、氰基或(C1-C6)烷氧基；R8是(C1-C6)烷基，可选取代有羟基；n是1或2；R1’是氢或(C1-C6)烷基；且R4’、R5’、R6’和R7’各自独立是氢、卤素、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、(C1-C6)烷基、和(C1-C6)烷氧基。
在第十个替代的实施方式中，本发明是制备式(IV)化合物的方法，其中当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氟。
在第十一个替代的实施方式中，本发明是制备式(IV)化合物的方法，其中当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氟和氯。
在第十二个替代的实施方式中，本发明是制备式(IV)化合物的方法，其中当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氢。
在第十四个替代的实施方式中，本发明是制备式(IV)化合物的方法，其中当n是1且R6是氢时，R5是氟。
R1是H、-CH3,
R4和R7各自独立是H或-Cl；R5是H、-OH、-CH3、-OCH3、-F、-Cl、-CF3或-CN；R6是H、-OH、-OCH3、-F或-Cl；R8是H、-CH3、-CH2CH3、-CH2OH、-CO2H、-CO2CH3、-CO2CH2CH3或-CF3；且n是1或2。
在第十五个替代的实施方式中，本发明是制备式(IV)化合物的方法，其中式(II)化合物具有式(IIA)、或者其盐或溶剂合物或水合物，
在第十六个替代的实施方式中，本发明是制备式(IV)化合物的方法，其中R5’是卤素。
在第十七个替代的实施方式中，本发明是制备式(IV)化合物的方法，其中R5’是氯且R1’、R4’、R6’和R7’各自是氢。
在第十八个替代的实施方式中，本发明是制备式(IV)化合物的方法，其中式(III)化合物具有式(IIIA)、或者其盐或水合物或溶剂合物，
在一个示例性实施方式中，所述酶是SEQ ID NO:134。
在第四个实施方式中，本发明是制备式(IVA)化合物、或者其盐或溶剂合物或水合物的方法，
包括：使式(IIIA)化合物或者其盐或溶剂合物或水合物
与式(II)化合物或者其盐或溶剂合物或水合物反应，
以提供式(IVA)化合物、或者其盐或溶剂合物或水合物，
其中式(IIA)化合物制备自式(IA)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物，
在第十九个替代的实施方式中，本发明是制备式(IVA)化合物的方法，其中式(IIA)化合物转化成式(IIB)的盐：
然后与式(IIIA)化合物反应。
在一个示例性实施方式中，所述酶是SEQ ID NO:134。
在第二十个替代的实施方式中，本发明是制备式(IVA)化合物的方法，其中所述反应在碱性条件下完成。
在第二十一个替代的实施方式中，本发明是制备式(IVA)化合物的方法，其中所述反应在三乙胺存在下完成。
在第二十二个替代的实施方式中，本发明是制备式(IVA)化合物的方法，其中式(IVA)化合物作为式(IVB)的盐形式分离：
在第二十三个替代的实施方式中，本发明是制备式(IVA)化合物的方法，其中式(IVB)的盐转化成游离碱形式的式(IVA)化合物。
在第二十四个替代的实施方式中，本发明是制备式(IVA)化合物的方法，其中式(IVB)的盐转化成有碳酸钠的游离碱形式的式(IVA)化合物。
在第二十五个替代的实施方式中，本发明是制备式(IVA)化合物的方法，其中式(IVA)化合物是水合物。
在第二十六个替代的实施方式中，本发明是制备式(IVA)化合物的方法，其中式(IVA)化合物是1/2水合物。
在第二十七个替代的实施方式中，本发明是制备式(IVA)化合物1/2水合物的方法，其中式(IVA)化合物1/2水合物在分离后磨碎。
D部分：新型和创造性式(IC)化合物的应用。
在第五个实施方式中，本发明是式(IC)化合物：
其中：R1是(C1-C6)烷基，可选取代有氨基、(C1-C6)烷基氨基、(C1-C6)烷基二烷基氨基或(C1-C6)烷基C(O)NH(C1-6)烷基；R5和R6各自独立是氢、卤素、羟基、(C1-C6)烷基、三卤(C1)烷基、氰基或(C1-C6)烷氧基；R8是(C1-C6)烷基，可选取代有羟基；n是1或2；或其药学上可接受盐或水合物或溶剂合物。
在第二十八个替代的实施方式中，本发明是式(IC)化合物，其中当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氟。
在第二十九个替代的实施方式中，本发明是式(IC)化合物，其中当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氟和氯。
在第三十个替代的实施方式中，本发明是式(IC)化合物，其中当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氢。
在第三十一个替代的实施方式中，本发明是式(IC)化合物，其中当n是1且R6是氢时，R5是氟。
在第三十二个替代的实施方式中，本发明是式(IC)化合物
其中、R1是H、-CH3,
R5是H、-OH、-CH3、-OCH3、-F、-Cl、-CF3或-CN；R6is H、-OH、-OCH3、-F或-Cl；R8是H、-CH3、-CH2CH3、-CH2OH、-CO2H、-CO2CH3、-CO2CH2CH3或-CF3；且n是1或2。
在第三十三个替代的实施方式中，本发明是式(I)化合物，其中所述化合物具有式(IA)：
或其药学上可接受盐或水合物或溶剂合物。
在第六个实施方式中，本发明是选自以下的化合物：
其药学上可接受盐、溶剂合物或水合物。
I部分：一般术语
以下所列是用于描述本发明新型中间体和合成步骤的多个术语的定义。这些定义(通过取代本公开所用的一个、大于一个或所有通式或符号并因而产生本发明实施方式)特别是应用于所述术语，因为它们在说明书中通篇使用，除非其在特定示例中单独或作为更大组群一部分另外定义。因此，除非有不同定义，上下文所用的一般定义具有以下含意：
术语“C1-C20-”定义多至且含最多20个，特别是多至且含最多7个碳原子的部分，所述部分为分支(一次或多次)或直链并经末端或非末端碳连接。
作为基团或基团一部分的烷基是直或分支(一次或(若需要且可能的话)多次)碳链，且尤其是C1-C7-烷基，如C1-C4-烷基，特别是分支C1-C4-烷基如异丙基。术语“低级”或“C1-C7-”定义多至且含最多7个，特别是多至且含最多4个碳原子的部分，所述部分为分支(一次或多次)或直链并经末端或非末端碳连接。例如，低级或C1-C7-烷基是正戊基、正己基或正庚基，或优选C1-C4-烷基，尤其作为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基，特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基；优选甲基。
烷基氨基和二烷基氨基分别指烷基-NH-和(烷基)2N-，其中烷基可为直链或支链。例如，烷基包括1-7个且特别是1-4个C原子。一些示例是甲氨基、二甲氨基、乙氨基和二乙氨基；优选甲氨基。
卤代或卤素优选是氟、氯、溴或碘，优选氟或氯；其中卤代作为取代基提及，可能的情况下，一个或多个(如多至3或1个)卤素原子可存在于例如卤代-C1-C7-烷基，如三氟甲基、2,2-二氟乙基或2,2,2-三氟乙基。
卤代-C1-C7-烷基可为直链或支链且特定包括1-4个C原子，例如1或2个C原子。示例是氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、2-氯乙基和2,2,2-三氟乙基；优选三氟甲基。
作为基团或基团一部分的烷氧基指烷基-O-，其中术语烷基如本文所定义，包括例如C1-C20-烷氧基(-O-C1-C20烷基)，优选C1-C7-烷氧基(–O-C1-C7烷基)。例如，烷氧基特定包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基和己氧基团；优选甲氧基。
例如，术语“可选活性碱”描述手性胺，优选手性叔胺，更优选金鸡纳属生物碱如奎尼丁(quinidine)和奎宁，最优选修饰的金鸡纳属生物碱。例如，这类修饰的金鸡纳属生物碱示例详细描述于Tian,S.-K.；Chen,Y.；Hang,J.；Tang,L.；McDiad,P.；Deng,L.Acc.Chem.Res.2004、37、621-631和其中所引用的参考文献。
本文所用术语“相转移催化剂”指提高位于不同相(如不混溶液体或固体和液体)的化学物质之间反应速率的催化量化学剂，这是通过提取所述反应物之一(最常是阴离子)穿越界面进入另一相。这些催化剂包括季铵或盐(如四烷基铵盐，其中烷基可相同或不同)，或络合无机阳离子的试剂(如冠醚或其它穴状配体)。所述催化剂阳离子在反应中不被消耗，尽管阴离子交换确实发生。特别地，根据本发明使用的合适相转移催化剂是季铵盐，例如具有式RmRnRlRkNX，其中RmRnRlRk是相同或不同烷基，X是卤素(如氯化物、溴化物、碘化物)或氢氧化物，例如四正丁基氢氧化铵。
本文所用“异质”催化剂指支撑于载体上的催化剂，尽管通常不一定是包括无机材料的底物，例如多孔材料如碳、硅和/或氧化铝。
本文所用“均质”催化剂指未支撑于载体上的催化剂。
术语“手性”指对其镜像伴侣具有不重叠性的分子，而术语“非手性”指对其镜像伴侣可重叠的分子。
术语“催化剂”指通过降低化学反应活化能来影响化学反应速率的任何物质。
术语“粉末催化剂”指含水量为0-30质量％的某一催化剂。
术语“底物与催化剂比例”(S/C)指起始化合物或其盐与“过渡金属催化剂”的摩尔比。
术语“后处理”指一旦反应结束即进行的分离和/或纯化工作。
除非另有说明，本文所用术语“室温”或“环境温度”指15-30℃的温度，如20-30℃，如20-25℃。
本申请通篇所用术语“惰性”指与任何反应物、溶剂或反应混合物的其它组分不反应。这种惰性条件一般通过使用惰性气体如二氧化碳、氦、氮、氩和其它气体来完成。
带星号(*)的键表示结合该分子其余部分的点。
本发明化合物可具有一个或多个不对称中心。优选的绝对构型如本文特别所示。然而，本发明包括任何可能的纯对映体、纯的非对映异构体、或其混合物，例如对映体如外消旋物。
本申请公式中，术语C-sp3上的代表共价键，其中键的立体化学未定义。这表示术语C-sp3上的包括各手性中心的(S)构型以及(R)构型。此外，本发明还包括混合物，例如对映体的混合物如外消旋物。
本申请公式中，术语C-sp2上的代表共价键，其中键的立体化学或几何学未定义。这表示术语C-sp2上的包括各双键的顺(Z)构型以及反(E)构型。此外，本发明还包括混合物，例如双键异构体的混合物。
本申请公式中，术语指示Csp3–Csp3键或Csp2-Csp2键。
本发明化合物可具有一个或多个不对称中心。优选的绝对构型如本文特别所示。
本申请公式中，术语C-sp3上的指示(R)或(S)的绝对立体化学。
本申请公式中，术语C-sp3上的指示(R)或(S)的绝对立体化学。
采用给定百分比的术语“立体异构纯度”指立体异构体混合物中以给定百分比的指定立体异构体为主。
术语“立体异构体”指有至少一个不对称碳原子的单一有机分子的绝对构型之一。所述立体异构体定义包括对映体和非对映体。
术语“拆分”指一种分子立体异构体的分离或浓缩或耗尽。
盐特别是药学上可接受盐或一般是本文所示任何中间体的盐，其中出于本领域技术人员易理解的化学原因不排除盐。盐形成基团如碱性或酸性基团存在时，其能形成，所述基团可以，例如在pH范围为4-10的水溶液内，至少部分以解离形式存在，或可特定以固体尤其是晶体形式分离。
这类盐从有碱性氮原子(如亚氨基或氨基)的本文所示化合物或任何中间体作为例如酸加成盐形成，优选用有机或无机酸，特别是药学上可接受盐。例如，合适的无机酸是氢卤酸如盐酸、硫酸或磷酸。例如，合适的有机酸是羧酸、膦酸、磺酸或氨基磺酸如乙酸、丙酸、乳酸、富马酸、琥珀酸、柠檬酸、氨基酸如谷氨酸或天冬氨酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、苯甲酸、甲磺酸或乙磺酸、1,2-乙二磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、1,5-萘-二磺酸、N-环己基氨基磺酸、N-甲基-、N-乙基-或N-丙基-氨基磺酸，或其它有机质子酸如抗坏血酸。
存在带负电基团如羧基或磺基时，盐也可用碱形成，如金属或铵盐如碱金属或碱土金属盐，例如钠、钾、镁或钙盐，或有氨或合适有机胺的铵盐例如三乙胺或三(2-羟乙基)铵、N-乙基-哌啶、N,N'-二甲基哌嗪、叔丁胺、正丁胺、苯乙胺、二环己基胺或环己胺。
碱性基团和酸性基团存在于同一分子时，本文所示任何中间体还可形成内盐。
出于分离或纯化本文所示任何中间体的目的，还能使用药学上不可接受盐，例如苦味酸盐或高氯酸盐。
优选的盐形式包括例如酸加成盐。具有至少一个酸性基团(如COOH或5-四唑基)的化合物也能与碱形成盐。例如，有碱基的合适盐是金属盐如碱金属或碱土金属盐，例如钠、钾、钙或镁盐，或有氨或有机胺的盐如吗啉、硫代吗啉、哌啶、吡咯烷、单-、二-或三-低级烷基胺例如乙基-、叔丁基-、二乙基-、二异丙基-、三乙基-、三丁基-或二甲基正丙胺，或单-、二-或三羟基低级烷基胺如单-、二-或三-乙醇胺。还可形成对应内盐。还包括不适合药物用途但能采用的盐，例如用于分离或纯化游离化合物I或其药学上可接受盐。式(IV)的盐最优选是樟脑磺酸盐。
特别地，术语“式(IV)化合物的盐”指例如其胺盐、其碱金属盐或其碱土金属盐(如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等)。特别地，表述“其胺盐”中的术语“胺”例如指式(IV)化合物的胺盐时，表示式NR9R10R11的叔胺、式NHR9R10R的仲胺或式NH2R9的伯胺，其中R9、R10和R11独立来自另一本文所定义烷基、芳基、环烷基或杂环基，优选烷基或环烷基。例如，术语“胺”是二苯胺、二异丙胺、二甲胺、三乙胺、二异丙基乙胺、二环己基胺、叔丁胺、正丁胺或环己胺，特别是叔丁胺、正丁胺或环己胺，更优选正丁胺或环己胺。
如本说明书和所附权利要求所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“多肽”包括一种以上多肽。
类似地，“包含”、“包括”、“含有”、“含”等可互换且不意在限制。
还应理解多个实施方式的描述使用术语“包含”时，本领域技术人员会理解在一些特定示例中，实施方式能用语言“基本由…组成”或“由…组成”替代描述。
应理解包括附图的上述一般描述和下列详细描述仅是示例性和解释性的，且不限制本公开。
本文所用节标题仅用于组织目的且不构成对所述主题的限制。
用于基因编码氨基酸的缩写是常规的且如下所示：
使用三字母缩写时，除非前面特定有“L”或“D”或从使用缩写的上下文中明确，所述氨基酸关于α-碳(Cα)可以是L-或D-构型。例如，“Ala”指定丙氨酸而没有具体说明关于α-碳的构型，“D-Ala”和“L-Ala”分别指定D-丙氨酸和L-丙氨酸。使用单字母缩写时，大写字母指定α-碳的L-构型中的氨基酸，而小写字母指定α-碳的D-构型中的氨基酸。例如“A”指定L-丙氨酸而“a”指定D-丙氨酸。多肽序列呈现为一串单字母或三字母缩写(或其混合物)时，所述序列根据常规以氨基(N)到羧基(C)方向表示。
用于基因编码核苷的缩写是常规的且如下所示：腺苷(A)；鸟苷(G)；胞苷(C)；胸苷(T)；和尿苷(U)。除非专门描述，缩写的核苷酸可以是核糖核苷或2’-脱氧核糖核苷。核苷可在个体基础或聚合基础上规定为核糖核苷或2’-脱氧核糖核苷。核酸序列呈现为一串单字母缩写时，所述序列根据常规以5’到3’方向表示，没有指出磷酸。
参考本公开，本文中说明书所用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义，除非另有明确定义。因此，下列术语意在具有以下含义：
“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用以指示至少2个由酰胺键共价连接的氨基酸的聚合物，而无论长度或翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、脂化、豆蔻酰化、泛素化等)如何。此定义包括D-和L-氨基酸以及D-和L-氨基酸的混合物。
“多核苷酸”或“核酸”指共价连接在一起的2个或更多核苷。所述多核苷酸可完全包括核糖核苷(即RNA)，完全由2’脱氧核糖核苷(即DNA)或核糖-和2’脱氧核糖核苷的混合物构成。所述核苷通常经标准磷酸二酯键连接在一起，所述多核苷酸可包括一个或多个非标准键。所述多核苷酸可以是单链或双链，或可包括单链区和双链区。此外，尽管多核苷酸通常由自然产生的编码核酸碱基(即腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)构成，其可包括一个或多个经修饰和/或合成的核酸碱基如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤等。这类经修饰或合成的核酸碱基优选是编码核酸碱基。
“氨基转移酶”和“转氨酶”在本文中可互换使用以指示具有将氨基(NH2)从伯胺转移到受体分子羰基(C＝O)的酶能力的多肽。本文所用的转氨酶包括自然产生的(野生型)转氨酶以及由人类操作产生的非自然存在的工程多肽。
“氨基受体”和“胺受体”、“酮基底物”、“酮基”和“酮”在本文中可互换使用以指示从供体胺接受氨基的羰基(酮基或酮)化合物。在一些实施方式中，氨基受体是具有下列通式的分子，
其中各Rα和Rβ单独来看，是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其可未取代或用一个或多个酶学上可接受基团取代。Rα的结构或手性可与Rβ相同或不同。在一些实施方式中，Rα和Rβ一起可形成未取代、取代的环或与其它环稠合。氨基受体包括酮羧酸和烷酮(酮)。典型的酮羧酸是α-酮羧酸如乙醛酸、丙酮酸、草酰乙酸等，以及这些酸的盐。氨基受体还包括通过其它酶或全细胞过程转化成氨基受体的物质，如富马酸(能转化成草酰乙酸)、葡萄糖(能转化成丙酮酸)、乳酸盐、马来酸等。可使用的氨基受体包括例如但不限于3,4-二氢萘-1(2H)-酮、1-苯基丁-2-酮、3,3-二甲基丁-2-酮、辛-2-酮、3-氧代丁酸乙酯、4-苯基丁-2-酮、1-(4-溴苯)乙酮、2-甲基-环己酮、7-甲氧基-2-萘满酮、1-羟基丁烷-2-酮、丙酮酸、乙酰苯、3’-羟苯乙酮、2-甲氧基-5-氟苯乙酮、乙酰丙酸、1-苯丙-1-酮、1-(4-溴苯)丙-1-酮、1-(4-硝基苯)丙-1-酮、1-苯丙-2-酮、2-氧代-3-甲基丁酸、1-(3-三氟甲基苯)丙-1-酮、羟丙酮、甲氧基氧丙酮、1-苯丁-1-酮、1-(2,5-二甲氧基-4-甲基苯)丁-2-酮、1-(4-羟基苯)丁-3-酮、2-乙酰萘、苯丙酮酸、2-酮戊二酸和2-酮丁二酸，可能的情况下包括(R)和(S)单一异构体。
“氨基供体”或“胺供体”指向氨基受体贡献氨基，从而成为羰基类物质的氨基化合物。在一些实施方式中，氨基供体是具有下列通式的分子，
其中各Rε和Rδ单独来看，是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，其未取代或用一个或多个酶学上非抑制基团取代。Rε的结构或手性可与Rδ相同或不同。在一些实施方式中，Rε和Rδ一起可形成未取代、取代的环或与其它环稠合。能使用的典型氨基供体包括手性和非手性氨基酸以及手性和非手性胺。可使用的氨基供体包括例如但不限于异丙胺(也称为2-氨基丙烷)、α-苯乙胺(也称为1-苯乙胺)和其对映体(S)-1-苯乙胺和(R)-1-苯乙胺、2-氨基-4-苯丁烷、甘氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酸盐、谷氨酸一钠、L-丙氨酸、D-丙氨酸、D,L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、D,L-鸟氨酸、β-丙氨酸、牛磺酸、n-辛胺、环己胺、1,4-丁二胺(也称为腐胺)、1,6-己二胺、6-氨基已酸、4-氨基丁酸、酪胺和苄胺、2-氨基丁烷、2-氨基-1-丁醇、1-氨基-1-苯乙烷、1-氨基-1-(2-甲氧基-5-氟苯基)乙烷、1-氨基-1-苯丙烷、1-氨基-1-(4-羟苯基)丙烷、1-氨基-1-(4-溴苯)丙烷、1-氨基-1-(4-硝基苯)丙烷、1-苯基-2-氨基丙烷、1-(3-三氟甲基苯)-2-氨基丙烷、2-氨基丙醇、1-氨基-l-苯丁烷、1-苯基-2-氨基丁烷、1-(2,5-二甲氧基-4-甲苯基)-2-氨基丁烷、1-苯基-3-氨基丁烷、1-(4-羟苯基)-3-氨基丁烷、1-氨基-2-甲基环戊烷、1-氨基-3-甲基环戊烷、1-氨基-2-甲基环己烷、1-氨基-1-(2-萘基)乙烷、3-甲基环戊胺、2-甲基环戊胺、2-乙基环戊胺、2-甲基环己胺、3-甲基环己胺、1-氨基萘满、2-氨基萘满、2-氨基-5-甲氧基萘满和1-氨基茚满，可能的情况下包括(R)和(S)单一异构体且包括所有可能的胺盐。
“手性胺”指具有通式R1-CH(NH2)-R1的胺并在本文中以最广泛含义使用，包括各种脂肪族和脂环族化合物，所述化合物具有不同且混合的官能团类型，特征在于存在结合仲碳原子的伯氨基，其除了氢原子外还载有(i)形成手性环结构的二价基团或(ii)彼此在结构或手性方面不同的2个取代基(氢以外)。形成手性环结构的二价基团包括例如2-甲基丁烷-1,4-二基、戊烷-1,4-二基、己烷-1,4-二基、己烷-1,5-二基、2-甲基戊烷-1,5-二基。仲碳原子上的2个不同取代基(上面的R1和R2)也能广泛变化且包括烷基、芳烷基、芳基、卤素、羟基、低级烷基、低级烷氧基、低级硫烷基、环烷基、羧基、烷酯基(carbalkoxy)、氨甲酰、单-和二-(低级烷基)取代的氨甲酰、三氟甲基、苯基、硝基、氨基、单-和二-(低级烷基)取代的氨基、烷基磺酰、芳基磺酰、烷基甲酰胺(alkylcarboxamido)、芳基甲酰胺(arylcarboxamido)等，以及由上述取代的烷基、芳烷基或芳基。
“磷酸吡哆醛”、“PLP”、“5’-磷酸吡哆醛”、“PYP”和“P5P”在本文中可互换使用以表示用作转氨酶反应中辅酶的化合物。在一些实施方式中，磷酸吡哆醛由以下结构定义：1-(4'-甲酰-3'-羟基-2'-甲基-5'-吡啶)甲氧基膦酸、CAS号[54-47-7]，5’-磷酸吡哆醛能通过吡哆醇(也称为维生素B6)磷酸化和氧化来体内生成。在用转氨酶的转氨反应中，氨基供体的胺基转移至所述辅酶以生成酮基产物，同时5’-磷酸吡哆醛转化成磷酸吡哆胺。5’-磷酸吡哆醛通过与不同酮基化合物(氨基受体)反应来再生。胺基从磷酸吡哆胺转至氨基受体可生成手性胺并使辅酶再生。在一些实施方式中，5’-磷酸吡哆醛能由其它维生素B6家族成员取代，包括吡哆醇(PN)、吡哆醛(PL)、吡哆胺(PM)和其磷酸化对应物；磷酸吡哆醇(PNP)和磷酸吡哆胺(PMP)。
“编码序列”指编码蛋白的氨基酸序列的核酸部分(如基因)。
“自然产生”或“野生型”指天然发现的形式。例如，自然产生或野生型多肽或多核苷酸序列是生物体中存在的序列，其能分离自自然来源且未经人类操作来有意修饰。
“重组”或“工程”或“非自然产生”涉及例如细胞、核酸或多肽使用时，指某一材料、或对应于天然或自然材料形式的材料，所述材料以其它情况下天然不存在的方式进行修饰，或与其相同但从合成材料和/或用重组技术通过操作而生成或衍生。非限制性示例包括表达基因的重组细胞，所述基因在天然(非重组)细胞形式内未发现或表达其它情况下以不同水平表达的天然基因。
“序列同一性百分比”和“同源性百分比”在本文中可互换使用以表示多核苷酸和多肽之间的比较，并通过在比较窗口对比2种最优比对序列来确定，其中相较用于最优比对2种序列的参考序列，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列部分可包括添加或缺失(即缺口)。所述百分比可如下计算：确定2种序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，将所述匹配位置数除以比较窗口中的总位置数并将结果乘以100，从而产生序列同一性百分比。或者，所述百分比可如下计算：确定2种序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数或者将核酸碱基或氨基酸残基用缺口进行比对以产生匹配位置数，将所述匹配位置数除以比较窗口中的总位置数并将结果乘以100，从而产生序列同一性百分比。本领域技术人员应理解有许多可用的已确立算法来比对2种序列。可进行用于比较的最优序列比对，例如通过Smith和Waterman的局部同源算法、1981、Adv.Appl.Math.2:482，Needleman和Wunsch的同源性比对算法、1970、J.Mol.Biol.48:443，Pearson和Lipman的相似性搜索法、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444，这些算法的计算机化实现(GCG Wisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过目测(一般参见《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in MolecularBiology)、F.M.Ausubel等编,选自《实验室指南》(Current Protocols),格林出版联合公司(Greene Publishing Associates、Inc.)与约翰威尔利父子公司(JohnWiley&Sons、Inc.)的合资公司(1995增刊)(Ausubel))。适于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法示例是BLAST和BLAST 2.0算法，所述算法分别描述于Altschul等、1990、J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等、1977、Nucleic Acids Res.3389-3402。用于实施BLAST分析的软件在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站上公开可得。此算法包括首先通过在查询序列中鉴定长度W的短字来识别高得分序列对(HSP)，该高得分序列对与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某一正值阈值得分T。T被称为相邻字得分阈值(Altschul等，同上)。这些初始邻近字采样作为种子启动搜索以发现含有这些字采样的更长HSP。只要累积对比得分可以增加，该字采样随后在两个方向沿着每个序列延伸。就核苷酸序列而言，累积得分用参数M(匹配残基对的奖励得分；总是>0)和N(残基错配的罚分；总是<0)计算。就氨基酸序列而言，采用得分矩阵来计算累积得分。当：累积对比得分从最大实现值下降的量为X；由于一个或多个负得分残基对比的积累，累积得分达到0或以下；或者到达任一序列的末端时，停止字采样在每个方向的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定对比的灵敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默认值为：字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认值为：字长(W)为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff和Henikoff、1989、Proc Natl Acad Sci USA 89:10915)。可采用GCG Wisconsin软件包中的BESTFIT或GAP程序(威斯康星州麦迪逊的Accelrys)示例性确定序列比对和％序列同一性，使用提供的默认参数。
“参比序列”指用作序列比较基础的定义序列。参比序列可以是更大序列的子集，例如全长基因或多肽序列的区段。一般，参比序列长度为至少20个核苷酸或氨基酸残基，至少25个残基长度，至少50个残基长度，或全长核酸或多肽。由于2种多核苷酸或多肽可各自(1)包括在所述2种序列间相似的序列(即完整序列的一部分)和(2)还可包括在所述2种序列间不同的序列，2种(或更多)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常如下进行：在“比较窗口”上对比2种多核苷酸或多肽的序列以鉴定并比较具有序列相似性的局部区域。在一些实施方式中，“参比序列”能基于一级氨基酸序列，其中参比序列是可具有一个或多个一级序列变化的序列。例如，“基于SEQ ID NO：4在对应X14的残基上具有缬氨酸的参比序列”或X14V指其中SEQ ID NO：4的X14处对应残基从酪氨酸变为缬氨酸的参比序列。
“比较窗口”指具有至少约20个连续核苷酸位置或氨基酸残基的概念区段，其中序列可与具有至少20个连续核苷酸或氨基酸的参比序列作比较且其中比较窗口内的序列部分可包括相较参比序列(其不包括添加或缺失)20％或更少的添加或缺失(如缺口)以最优比对所述2种序列。比较窗口能长于20个连续残基，且可选包括30个、40个、50个、100个或更长的窗口。
“基本同一性”指在具有至少20个残基位置的比较窗口上，通常至少30-50个残基的窗口，相较参比序列有至少80％序列同一性、至少85％同一性和89-95％序列同一性，更通常至少99％序列同一性的多核苷酸或多肽序列，其中序列同一性的百分比通过在比较窗口上对比参比序列与含缺失或添加的序列(总计20％或更少的参比序列)来计算。在应用于多肽的特定实施方式中，术语“基本同一性”指例如通过程序GAP或BESTFIT用默认缺口权重进行最优比对时，2种多肽序列共有至少80％序列同一性，优选至少89％序列同一性，至少95％序列同一性或更高(如90％序列同一性)。不同的残基位置优选差异为保守氨基酸取代。
“对应于”、“关于”或“相对于”用于给定氨基酸或多核苷酸序列编号的上下文时，指给定氨基酸或多核苷酸序列与参比序列作对比时特定参比序列的残基编号。换言之，给定聚合物的残基号或残基位置相对参比序列指定，而不是给定氨基酸或多核苷酸序列内残基的实际数字位置。例如，通过引入缺口以优化2种序列间的残基匹配，给定氨基酸序列如工程转氨酶的氨基酸序列能与参比序列比对。这些情况下，尽管存在缺口，给定氨基酸或多核苷酸序列中的残基编号相对于进行比对的参比序列作出。
“氨基酸差异”或“残基差异”指相对于参比序列中对应位置处的氨基酸残基，多肽序列某一位置的氨基酸残基变化。具有氨基酸差异的位置一般在本文中称为“Xn”，其中n指参比序列中的对应位置，残基差异即基于此。例如，“与SEQ ID NO:4相比，X14位的残基差异”指与SEQ ID NO:4中14位对应的多肽位置处的氨基酸残基变化。因此，如果SEQ ID NO:4的参比多肽在14位具有酪氨酸，则“与SEQ ID NO:4相比，X14位的残基差异”是与SEQ ID NO:4中14位对应的多肽位置处有酪氨酸以外的任何残基的氨基酸取代。在本文的大部分情况中，某一位置的特定氨基酸残基差异表示为“XnY”，其中“Xn”指定上述对应位置，“Y”是所述工程多肽中发现的单字母标识符(即不同于参比多肽的不同残基)。在一些实施方式中，出现在指定残基位置的氨基酸能大于1个，交替氨基酸可以形式XnY/Z列出，其中Y和Z代表交替氨基酸残基。一些情况中(如表2A和2B)，本公开还提供常规符号“AnB”表示的具体氨基酸差异，其中A是参比序列中残基的单字母标识符，“n”是参比序列中残基位置编号，B是所述工程多肽序列中残基取代的单字母标识符。此外，本公开的多肽可包括相对于参比序列的一个或多个氨基酸残基差异，这由相对于参比序列作出变化的指定位置列表指示。本公开包括含一个或多个氨基酸差异的工程多肽序列，所述差异包括保守和非保守氨基酸取代之一或两者。
“保守氨基酸取代”指用具有相似侧链的不同残基来取代某一残基，因而通常包括用相同或相似定义的氨基酸类内的氨基酸取代多肽中的氨基酸。例如但不限于，有脂肪族侧链的氨基酸可用另一脂肪族氨基酸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸取代；有羟基侧链的氨基酸用另一带羟基侧链的氨基酸如丝氨酸和苏氨酸取代；有芳香族侧链的氨基酸用另一具有芳香族侧链的氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸取代；有碱性侧链的氨基酸用另一带碱性侧链的氨基酸如赖氨酸和精氨酸取代；有酸性侧链的氨基酸用另一带酸性侧链的氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸取代；疏水或亲水氨基酸分别用另一疏水或亲水氨基酸取代。示例性保守取代如下表1所提供。
表1
“非保守取代”指多肽中的某一氨基酸用侧链特性显著不同的氨基酸取代。非保守取代可使用定义组之间而不是之内的氨基酸，并影响(a)取代区的肽主链结构(如用于甘氨酸的脯氨酸)、(b)电荷或疏水性或(c)大部分侧链。例如但不限于，示例性非保守取代可以是用碱性或脂肪族氨基酸取代酸性氨基酸；用小氨基酸取代芳香族氨基酸，用疏水氨基酸取代亲水氨基酸。
“缺失”指通过从参比多肽移出一个或多个氨基酸进行的多肽修饰。缺失可包括移出1个或更多氨基酸、2个或更多氨基酸、5个或更多氨基酸、10个或更多氨基酸、15个或更多氨基酸、或20个或更多氨基酸，多至10％的构成参比酶的氨基酸总数，或多至20％的氨基酸总数，而仍保留酶活性和/或保留工程转氨酶的改良特性。缺失能针对多肽内部和/或末端部分。在多个实施方式中，所述缺失能包括连续区段或可间断。
“插入”指通过从参比多肽加入一个或多个氨基酸进行的多肽修饰。在一些实施方式中，改良的工程转氨酶包括向自然产生的转氨酶多肽插入一个或多个氨基酸以及向其它改良转氨酶多肽插入一个或多个氨基酸。插入可以在多肽内部，或羧基或氨基末端。本文所用的插入包括本领域已知的融合蛋白。所述插入能是连续氨基酸区段或由所述自然产生多肽中的一个或多个氨基酸分开。
本文所用的“片段”指具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽，但其中剩余氨基酸序列与该序列中的对应位置相同。片段长度可为至少14个氨基酸、至少20个氨基酸、至少50个氨基酸或更长，且多至70％、80％、90％、95％、98％和99％的全长转氨酶多肽，例如SEQ ID NO:2的多肽或SEQ ID NO:34的工程转氨酶。
“分离多肽”指与天然伴随的其它污染物如蛋白、脂质和多核苷酸基本分开的多肽。所述术语涵盖从其自然存在环境或表达系统(如宿主细胞或体外合成)移出或纯化的多肽。改良的转氨酶可存在于细胞内，存在于细胞介质，或以多种形式制备如裂解物或分离制品。因此，在一些实施方式中，改良的转氨酶可以是分离多肽。
“基本纯的多肽”指其中所述多肽种类是当前优势种类(即在摩尔或重量基础上，其丰度高于组合物中的任何其它大分子种类)的组合物，且当目标种类包括至少约50％现有大分子种类(摩尔或％重量)时，一般为基本纯的组合物。通常，基本纯的转氨酶组合物会包括约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约95％或更多和约98％或更多的组合物中所存在全部大分子种类(摩尔或％重量)。在一些实施方式中，目标种类纯化至基本同质(即通过常规检测法不能检测到组合物中的污染种类)，其中所述组合物本质上由单一大分子种类组成。溶剂种类、小分子(<500道尔顿)和元素离子种类不视作大分子种类。在一些实施方式中，经分离的改良转氨酶多肽是基本纯的多肽组合物。
“立体选择性”指一种立体异构体相比另一种在化学或酶反应中优先形成。立体选择性可以是部分的，其中一种立体异构体的形成相比另一种更受偏爱，或可以是完全的，其中仅形成一种立体异构体。所述立体异构体是对映体时，立体选择性称为对映选择性，即一种对映体在两者之和中所占的分数(通常以百分比报告)。其在本领域通常替代性报告(常作为百分比)为对映体过量(e.e.)，根据公式[主要对映体-次要对映体]/[主要对映体+次要对映体]从中计算。所述立体异构体是非对映异构体时，立体选择性称为非对映立体选择性，即一种非对映异构体在2种非对映异构体混合物中所占的分数(通常以百分比报告)，通常替代性报告为非对映体过量(d.e.)。对映体过量和非对映体过量是立体异构过量的类型。
“高立体选择性”指能将底物如化合物(IA)转化成其对应手性胺产物如化合物(IIA)的化学或酶反应，有至少约85％立体异构过量。
“改良的酶特性”指相较参比转氨酶显示任何酶特性提高的转氨酶多肽。对于本文所述的工程转氨酶多肽，一般与野生型转氨酶进行比较，尽管在一些实施方式中，参比转氨酶可以是另一改良的工程转氨酶。需要改良的酶特性包括但不限于酶活性(能以底物转化百分比形式表示)、热稳定性、溶剂稳定性、pH活性概况、辅因子要求、抑制剂(如底物或产物抑制)无效、立体专一性和立体选择性(包括对映选择性)。
“增加的酶活性”指工程转氨酶多肽的改良特性，这可通过特异活性相较参比转氨酶增加(如生成的产物/时间/重量蛋白)或底物向产物的转化百分比增加(如特定时间段中起始量的底物向产物转化的百分比，用指定量的转氨酶)表示。实施例提供测定酶活性的示例性方法。涉及酶活性的任何特性可能受影响，包括Km、Vmax或kcat的经典酶特性，其变化能引起酶活性增加。酶活性提高可以是对应野生型转氨酶的酶活性比自然产生的转氨酶或从中可获得转氨酶多肽的另一工程转氨酶高约1.2倍，到多达2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍或更多。转氨酶活性可通过任何一种标准分析测定，如监测反应物或产物的分光光度特性变化。在一些实施方式中，测量所生成的产物量可通过高效液相色谱，联合衍生化后的UV吸光度或荧光检测，如用邻苯二甲醛(OPA)衍生化。酶活性比较用定义酶制品、设置条件下的定义分析以及一种或多种定义底物完成，如本文进一步详细描述。一般，比较裂解物时，测定分析的细胞数和蛋白量以及应用相同表达系统和相同宿主细胞以尽可能减少宿主细胞生成的以及裂解物中存在的酶量变化。
“转化”指底物向对应产物的酶促转化。“转化百分比”指规定条件下在一段时间内转化成产物的底物百分比。因此，转氨酶多肽的“酶活性”或“活性”可表示为底物向产物的“转化百分比”。
“热稳定”指暴露于高温(如40-80℃)一段时间(如0.5-24小时)后，相较野生型酶维持相似活性(例如大于60％-80％)的转氨酶多肽。
“溶剂稳定”指暴露于不同浓度(如5-99％)溶剂(乙醇、异丙醇、二甲亚砜(DMSO)、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、甲苯、乙酸丁酯、甲基叔丁醚等)一段时间(如0.5-24小时)后，相较野生型酶维持相似活性(例如大于60％-80％)的转氨酶多肽。
“热和溶剂稳定”指同时为热稳定和溶剂稳定的转氨酶多肽。
本文所用的“严谨杂交”指核酸稳定的条件。如本领域技术人员已知，杂交体的稳定性体现在该杂交体的解链温度(Tm)中。一般，杂交体的稳定性随着离子强度、温度、G/C含量和离液剂的存在而变化。多核苷酸的Tm值能用预测解链温度的已知方法计算(参见例如Baldino等,Methods Enzymology168:761-777；Bolton等,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:1390；Bresslauer等,1986,Proc.Natl.Acad.Sci USA 83:8893-8897；Freier等,1986,Proc.Natl.Acad.Sci USA 83:9373-9377；Kierzek等,Biochemistry 25:7840-7846；Rychlik等,1990,Nucleic Acids Res 18:6409-6412(勘误,1991,Nucleic Acids Res 19:698)；Sambrook等,同上)；Suggs等,1981,收录于《使用纯化基因的发育生物学》(Developmental Biology Using Purified Genes)(Brown等编),683-693页,学术出版社(Academic Press)；和Wetmur,1991,Crit Rev Biochem Mol Biol26:227-259。所有出版物通过引用纳入本文)。在一些实施方式中，所述多核苷酸编码本文所公开的多肽并在确定条件如中等严谨或高严谨条件下与编码本公开工程转氨酶的序列互补物杂交。
“杂交严谨性”涉及核酸杂交中的杂交条件，如洗涤条件。一般，杂交反应在较低严谨条件下进行，然后进行不同但严谨性更高的洗涤。术语“中等严谨杂交”指允许靶标-DNA结合互补核酸的条件，所述核酸与靶DNA有约60％同一性，优选约75％同一性、约85％同一性，与靶标-多核苷酸的同一性大于约90％。示例性中等严谨条件是等同于以下的条件：在50％甲酰胺、5×邓哈特溶液、5×SSPE、0.2％SDS中42℃杂交，然后在0.2×SSPE、0.2％SDS中42℃洗涤。“高严谨杂交”一般指如下条件：距离就确定多核苷酸序列在所述溶液条件下测定的热解链温度Tm约10℃或更小。在一些实施方式中，高严谨条件指仅允许在0.018M NaCl中65℃形成稳定杂交体的那些核酸序列杂交的条件(即，如果杂交体在0.018M NaCl、65℃下不稳定，其在高严谨条件下会不稳定，如本文所预期)。可提供高严谨条件，例如通过在等同于50％甲酰胺、5×邓哈特溶液、5×SSPE、0.2％SDS和42℃的条件下杂交，然后在0.1×SSPE和0.1％SDS中65℃洗涤。另一高严谨条件是在等同于以下的条件下杂交：在含0.1％(w:v)SDS的5X SSC中65℃杂交并在含0.1％SDS的0.1x SSC中65℃洗涤。其它高严谨杂交条件以及中等严谨条件如上面引用的参考文献所述。
“异源”多核苷酸指通过实验室技术引入宿主细胞的任何多核苷酸，且包括从宿主细胞移出、接受实验室操作然后再引入宿主细胞的多核苷酸。
“优化密码子”指编码蛋白的多核苷酸密码子变为特定生物中优选使用的那些，从而所编码蛋白在感兴趣生物中有效表达。尽管遗传密码是简并的，因为大部分氨基酸有称为“同义物”或“同义”密码子的数个密码子，但熟知特定生物的密码子使用是非随机的并偏向特定三联体密码子。该密码子使用偏好可能高于给定基因、具有共同功能或祖先起源的基因、高表达蛋白相比低拷贝数蛋白、以及生物基因组的聚集蛋白编码区。在一些实施方式中，编码转氨酶的多核苷酸可以是优化密码子以从选定用于表达的宿主生物中最优生成。
“优选的密码子、最优的密码子、高密码子使用偏好的密码子”可互换地指在蛋白编码区中使用频率高于编码同一氨基酸的其它密码子的密码子。可根据单一基因、具有共同功能或起源的基因组、高表达基因中的密码子使用以及整个生物体中聚集蛋白编码区的编码频率、相关生物体中聚集蛋白编码区的编码频率、或其组合来确定优选密码子。频率随着基因表达水平而增加的密码子通常是表达的最优密码子。已知多种方法用于测定具体生物中的密码子频率(如密码子使用、相对同义密码子使用)和密码子偏好，包括多变量分析，例如用聚类分析或对应分析，以及用于确定基因的有效密码子数(参见GCG密码子偏好，遗传学计算机组(Genetics Computer Group)Wisconsin软件包；CodonW,John Peden,诺丁汉大学；McInerney,J.O,1998,Bioinformatics14:372-73；Stenico等,1994,Nucleic Acids Res.222437-46；Wright,F.,1990,Gene87:23-29)。密码子使用表格可用于不断增加的生物名单(参见例如Wada等,1992,Nucleic Acids Res.20:2111-2118；Nakamura等,2000,Nucl.Acids Res.28:292；Duret等,同上；Henaut和Danchin,“大肠杆菌和沙门氏菌(Escherichia coli andSalmonella),”1996,Neidhardt等编,华盛顿特区的美国微生物学会出版社(ASMPress),2047-2066页)。用于获得密码子使用的数据资源可依赖于能够编码蛋白的任何可用的核苷酸序列。这些数据集包括实际上已知编码表达蛋白的核酸序列(例如，完整的蛋白编码序列-CDS)、表达序列标签(ESTS)、或基因组序列的预测编码区(参见例如Mount,D.,《生物信息学：序列和基因组分析》(Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis),第8章,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),,2001；Uberbacher,E.C.,1996,Methods Enzymol.266:259-281；Tiwari等,1997,Comput.Appl.Biosci.13:263-270)。
本文定义的“控制序列”包括对本公开的多核苷酸和/或多肽表达必要或有利的所有组分。每个控制序列可能对编码多肽的核酸序列是天然的或外来的。这些控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。在最小程度上，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于控制序列与编码多肽的核酸序列编码区连接的特定限制性位点的目的，可向控制序列提供接头。
“可操作连接”在本文定义为某一种构型，其中控制序列被适当安放(即有功能关系)在相对于感兴趣多核苷酸的某一位置，从而控制序列指导或调节感兴趣多核苷酸和/或多肽的表达。
“启动子序列”指由宿主细胞识别用于表达感兴趣多核苷酸如编码序列的核酸序列。启动子序列包含介导感兴趣多核苷酸表达的转录控制序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码胞外多肽或胞内多肽的与该宿主细胞同源或异源的基因中获得。
“合适反应条件”指生物催化反应溶液中的条件(如酶负载、底物负载、辅因子负载、温度、pH、缓冲液、共溶剂等的范围)，在所述条件下本公开的转氨酶多肽能将底物化合物转化成产物化合物(如化合物(IA)向化合物(IIA)的转化)。本公开中提供示例性“合适反应条件”并由实施例描述。
“负载”如“化合物负载”或“酶负载”或“辅因子负载”中的“负载”指反应开始时反应混合物中某一组分的浓度或量。
生物催化剂所介导过程情况下的“底物”指通过生物催化剂作用的化合物或分子。例如，本文所公开过程中转氨酶生物催化剂的示例性底物是化合物(IA)。
生物催化剂所介导过程情况下的“产物”指由生物催化剂作用产生的化合物或分子。例如，本文所公开过程中转氨酶生物催化剂的示例性产物是化合物(IIA)。
本公开提供使用有转氨酶活性的多肽的方法，用于相比(R)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺为对映体过量情况下合成(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺。所述描述涉及多肽时，应理解其还描述编码该多肽的多核苷酸。
氨基转移酶也称为转氨酶，催化氨基从氨基供体底物的伯胺转至氨基受体分子的羰基(如酮基或醛基)。已从多种生物中鉴定出氨基转移酶，如反硝化产碱菌(Alcaligenes denitrificans)、支气管炎博德特菌(Bordetellabronchiseptica)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)、羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia malle)、假鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、青紫色素杆菌(Chromobacterium violaceum)、细粒海栖菌(Oceanicola granulosus)HTCC2516、海洋杆菌属(Oceanobacter sp.)RED65、海洋螺菌属(Oceanospirillumsp.)MED92、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)(菌株NGR234)、河流孤菌(Vibrio fluvialis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringensis)、和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(Shin等,2001,Biosci.Biotechnol,Biochem.65:1782-1788)。
转氨酶用于外消旋胺的手性拆分，这是通过利用转氨酶以立体专一方式完成反应的能力，即一种对映体优选转化成对应酮，从而产生另一对映体富集的混合物(参见例如Koselewski等,2009,Org Lett.11(21):4810-2)。转氨酶在酮转化成对应胺中的立体选择性也使这些酶用于从对应酮基化合物中不对称合成光学纯的胺(参见例如等,“光学活性胺的生物催化途径(BiocatalyticRoutes to Optically Active Amines),”Chem Cat Chem 1(1):42–51；Zua和Hua,2009,Biotechnol J.4(10):1420-31)。
来自河流孤菌ω-VfT的ω-转氨酶显示对手性胺(S)-对映体的高对映选择性且具有对手性芳香胺的独特底物特异性(Shin和Kim,2001,J.Org.Chem.67:2848-2853)。将ω-VfT的高对映选择性应用于胺的手性拆分(H.Yun,B.-K.Cho,B.-G.Kim,Biotechnol.Bioeng.2004,87,772–778；J.-S.Shin,B.-G.Kim,Biotechnol.Bioeng.1997,55,348–358；M.K.Robins,U.T.Bornscheuer,Adv.Synth.Catal.2008,350,802–807)。所述酶还用于不对称合成光学纯的胺，使用前手性酮基底物。然而，不对称合成的限制在于逆反应平衡不利(Shin和Kim,1999,Biotechnol.Bioeng.65,206–211)、胺产物抑制ω-VfT酶(Shin等,2001,Biotechnol Bioeng 73:179–187；Yun和Kim,2008,Biosci.Biotechnol.Biochem.72(11):3030-3033)；对具有庞大侧链的氨基受体如芳族基团的活性低(Shin和Kim,2002,J.Org.Chem.67:2848-2853)；以及酶稳定性低(Yun和Kim,同上)。
获自河流孤菌转氨酶、对脂肪酮抗性增加的工程转氨酶参见Yun等,2005,Appl Environ Micriobiol.,71(8):4220–4224，而氨基供体底物特异性扩大的ω-VfT参见Cho等,2008,Biotechnol Bioeng.99(2):275-84。专利公开WO2010081053和US20100209981描述的工程ω-VfT对温度和/或有机溶剂的稳定性提高以及针对不同结构氨基受体分子的酶活性增加，所述专利通过引用纳入本文。
本公开涉及使用获自河流孤菌(V.fluvialis)的工程转氨酶多肽的方法，所述转氨酶多肽有效介导1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺在对映体过量下转化成产物化合物(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺。显然，本公开鉴定转氨酶多肽中的氨基酸残基位置和对应突变，其增加酶活性、对映选择性、稳定性和对1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺向产物化合物(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺转化中产物抑制的不应性。
因此，一方面，本公开涉及使用多肽的方法，所述多肽能在氨基供体存在下将底物化合物(IA)即1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺转化成产物化合物(IIA)即(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺，
其中(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺以相比化合物(IIC)即(R)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺为对映体过量情况下生成。
在一些实施方式中，用于所述方法的多肽是非自然产生的转氨酶，所述转氨酶工程化以相较SEQ ID NO:2的野生型河流孤菌多肽或另一工程多肽如SEQID NO:4改良特性。这些工程转氨酶多肽适于将1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺有效转化成(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺，其相较SEQ ID NO:2的氨基酸序列或参比工程转氨酶多肽如SEQ ID NO:4的参比多肽具有一个或多个残基差异。残基差异与酶特性提高相关，包括酶活性、酶稳定性和对产物胺抑制的抗性。
在一些实施方式中，用于本公开的工程转氨酶多肽显示在底物1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺于定义时间内转化成对映体过量的产物(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺中活性相较野生型或参比工程酶增加，酶用量相同。在一些实施方式中，工程转氨酶多肽在合适反应条件下相较SEQ ID NO:4所示多肽具有至少约1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍或更高的活性。
在一些实施方式中，用于本公开的工程转氨酶多肽相较野生型或参比工程酶对转化反应所用温度和/或溶剂的稳定性提高。在一些实施方式中，工程转氨酶多肽在合适反应条件下相较SEQ ID NO:4的多肽具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更高的稳定性。
在一些实施方式中，用于本公开的工程转氨酶多肽相较野生型或参比工程酶对产物胺(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺的不应性或抗性增加。在一些实施方式中，工程转氨酶多肽在合适反应条件下相较SEQ ID NO:4所示多肽对1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺特别是(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺抑制具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更高的抗性，如下进一步所述。
在一些实施方式中，用于本公开的工程转氨酶多肽能在合适反应条件下将底物1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺转化成产物(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺，相比(R)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺，对映体过量超过90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5或更大。
在一些实施方式中，用于本公开的工程转氨酶多肽能在合适反应条件下将化合物(IA)转化成化合物(IIA)，相比SEQ ID NO:4的参比多肽对底物存在的耐受性增加。因此，在一些实施方式中，工程转氨酶多肽能在合适反应条件下将底物即化合物(IIA)转化成产物即化合物(IA)，底物负载浓度为至少约1g/L、约5g/L、约10g/L、约20g/L、约30g/L、约40g/L、约50g/L、约70g/L、约100g/L、约125g/L、约150g/L、约175g/L或约200g/L或更高，转化百分比为至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％，反应时间为约72h或更少、约48h或更少、约36h或更少或者约24h或更少。
上述改良特性的工程多肽完成转化的合适反应条件能根据多肽、底物、辅因子、缓冲液、共溶剂、pH的浓度或量和/或包括温度及反应时间在内的条件确定，如以下和实施例进一步所述。
用于本公开的示例性工程多肽与其将化合物(IA)转化成化合物(IIA)的特性改良相关联且包括以下残基位置处相较SEQ ID NO:2的一个或多个残基差异：X9；X14；X18；X21；X26；X31；X33；X41；X45；X47；X57；X70；X86；X88；X107；X113；X132；X133；X146；X147；X148；X153；X163；X168；X173；X177；X203；X211；X233T；X235；X244；X250；X284；X294；X314；X315；X318；X323；X324；X324；X346；X383；X391；X395；X398；X400；X417；X419；X420；X423；X424；X427；X448；和X451。这些位置中每一个的特定氨基酸差异与表2A和表2B示例性多肽的特性改良相关联，包括：X9T；X14V；X18A；X21H；X26R；X31M；X31S；X33T；X41L；X45H；X47N；X57F；X57Y；X70A；X86D；X86Y；X88A；X88L；X107P；X113L；X113V；X132F；X133R；X146L；X147K；X148Q；X148R；X153S；X163F；X163I；X163L；X163R；X163V；X168K；X168S；X173A；X177L；X203S；X211K；X233T；X235P；X244T；X250A；X284A；X294V；X314N；X315G；X318D；X323T；X324G；X324H；X346L；X383V；X391A；X395P；X398L；X398V；X398W；X400G；X417M；X419S；X420N；X423I；X424V；X424A；X427Y；X448E；和X451D。
相较SEQ ID NO:4所示工程转氨酶的残基差异包括以下残基位置处的那些：X14；X26；X31；X33；X41；X47；X57；X70；X86；X88；X107；X113；X132；X148；X163；X168；X173；X203；X250；X284；X314；X315；X324；X346；X395；X398；X400；X417；X419；X420；X423；X424；X448；和X451。这些位置的特定氨基酸差异包括：X14V；X26R；X31S；X33T；X41L；X47N；X57F；X57Y；X70A；X86D；X88A；X88L；X107P；X113L；X113V；X132F；X148Q；X148R；X163I；X163L；X163R；X163V；X168K；X168S；X173A；X203S；X250A；X284A；X314N；X315G；X324H；X346L；X395P；X398L；X398V；X398W；X400G；X417M；X419S；X420N；X423I；X424V；X448E；和X451D。尽管相较SEQ ID NO:4的残基差异也出现在残基位置X153和X383，但这些差异代表逆转成SEQ ID NO:2野生型序列中存在的氨基酸残基，表明残基位置X153处氨基酸S和V之间以及残基位置X383处氨基酸A和V之间的互换现象对工程酶特性没有显著有害影响。
用于本公开方法的示例性非自然产生(或工程)转氨酶多肽的结构和功能信息如下表2A和2B所示。奇数序列标识符(如SEQ ID NO)指编码氨基酸序列(由偶数SEQ ID NO提供)的核苷酸序列，所述序列以本公开所附电子序列表文件形式提供，其在此通过引用纳入本文。氨基酸残基差异是基于和SEQ ID NO:4的参比序列比较，所述序列是获自野生型ω-VfT多肽的工程转氨酶，相对于SEQID NO:2具有下列24个氨基酸残基差异A9T；G18A；D21H；V31M；N45H；F86Y；A133R；R146L；W147K；V153S；K163F；V177L；R211K；P233T；A235P；P244T；M294V；P318D；A323T；S324G；A383V；T391A；C424A；F427Y。各工程多肽相对于SEQ ID NO:4参比多肽的活性可测定为规定时间段和温度下酮基底物1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺在高通量(HTP)分析中向产物胺化合物(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺的转化，这用作初级筛选。表2A的HTP分析值用大肠杆菌(E.coli.)澄清细胞裂解物在96孔板格式中测定，每孔～200μL体积，遵循表格和实施例所示的分析反应条件。一些情况下，摇瓶粉(SFP)和/或下游加工(DSP)粉测定用作评价工程转氨酶特性的二级筛选，结果示于表2B。SFP和DSP形式提供更纯化的工程多肽粉制品。例如，SFP制品中的工程转氨酶为约30％总蛋白，而DSP制品能包含约80％总蛋白的工程转氨酶。
活性水平(如“+”“++”等)如下定义：“+”表示就工程转氨酶多肽SEQID NO:6-14而言，相较SEQ ID NO:4的1.2倍或更高活性，就工程转氨酶多肽SEQ ID NO:16-154而言，相较SEQ ID NO:8的1.2倍或更高活性，“++”表示就工程转氨酶多肽SEQ ID NO:6-14而言，相较SEQ ID NO:4的5倍或更高活性，就工程转氨酶多肽SEQ ID NO:16-154而言，相较SEQ ID NO:8的5倍或更高活性。稳定性数据如下获得：在分析中包括以下量的产物(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺并在同一条件下比较其与参比酶的活性：14g/L用于分析SEQID NO:6-14的工程转氨酶多肽，16g/L用于分析SEQ ID NO:16-154的工程转氨酶多肽。通过比较2个不同温度即55℃和50℃下的活性来完成稳定性评价。
表2A：用HTP制品的工程多肽和相对酶改良
表2B：用摇瓶和DSP制品的工程多肽和相对酶改良
通过检查用于本发明方法的示例性多肽，酶特性改良与以下残基位置处相较SEQ ID NO:4的残基差异相关：X14；X26；X31；X33；X41；X47；X57；X70；X86；X88；X107；X113；X132；X148；X163；X168；X173；X203；X250；X284；X314；X315；X324；X346；X395；X398；X400；X417；X419；X420；X423；X424；X448；和X451。这些位置中每一个的特定残基差异与特性改良相关联，包括：X14V；X26R；X31S；X33T；X41L；X47N；X57F；X57Y；X70A；X86D；X88A；X88L；X107P；X113L；X113V；X132F；X148Q；X148R；X163I；X163L；X163R；X163V；X168K；X168S；X173A；X203S；X250A；X284A；X314N；X315G；X324H；X346L；X395P；X398L；X398V；X398W；X400G；X417M；X419S；X420N；X423I；X424V；X448E；和X451D。
因此，在一些实施方式中，用于本公开方法的工程转氨酶多肽能将底物化合物(IA)即1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺转化成产物化合物(IIA)即(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺，与SEQ ID NO:4相比特性改良，所述多肽包括与参比序列SEQ ID NO:2有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列以及在选自以下的残基位置处相较SEQ ID NO:4有一个或多个残基差异：X14；X26；X31；X33；X41；X47；X57；X70；X86；X88；X107；X132；X148；X163；X168；X173；X203；X250；X284；X314；X315；X324；X346；X395；X398；X400；X417；X419；X423；X448；和X451，其中残基位置X31；X57；X86；X163；X168；X314；X324；X398；和X417处的残基差异选自：X31S；X57Y；X86D；X163I；X163L；X163R；X163V；X168S；X314N；X324H；X398L；X398V；X398W；和X417M。
在一些实施方式中，用于本公开方法的工程转氨酶多肽能将底物化合物(IA)转化成产物化合物(IIA)，与SEQ ID NO:4相比特性改良，所述多肽包括与参比序列SEQ ID NO:4有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列以及在选自以下的残基位置处相较SEQ ID NO:4有一个或多个残基差异：X14；X26；X31；X33；X41；X47；X57；X70；X86；X88；X107；X132；X148；X163；X168；X173；X203；X250；X284；X314；X315；X324；X346；X395；X398；X400；X417；X419；X423；X448；和X451，其中残基位置X31；X57；X86；X163；X168；X314；X324；X398；和X417处的残基差异选自：X31S；X57Y；X86D；X163I；X163L；X163R；X163V；X168S；X314N；X324H；X398L；X398V；X398W；和X417M。在一些实施方式中，工程转氨酶多肽能以上述对映选择性如≥90％ee完成所述转化。
在一些实施方式中，用于本公开方法的转氨酶多肽能将底物化合物(IA)转化成产物化合物(IIA)，与SEQ ID NO:4相比特性改良，所述多肽包括与选自以下的参比序列有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列：SEQ IDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、和154，以及在选自以下的残基位置处相较SEQ ID NO:4有一个或多个残基差异：X14；X26；X31；X33；X41；X47；X57；X70；X86；X88；X107；X132；X148；X163；X168；X173；X203；X250；X284；X314；X315；X324；X346；X395；X398；X400；X417；X419；X423；X448；和X451，其中残基位置X31；X57；X86；X163；X168；X314；X324；X398；和X417处的残基差异选自：X31S；X57Y；X86D；X163I；X163L；X163R；X163V；X168S；X314N；X324H；X398L；X398V；X398W；和X417M。在一些实施方式中，所述参比序列选自SEQ ID NO:4、8、14、16、132、134和146。在一些实施方式中，所述参比序列是SEQ ID NO:4。在一些实施方式中，所述参比序列是SEQ ID NO:8。在一些实施方式中，所述参比序列是SEQ ID NO:134。在一些实施方式中，所述参比序列是SEQ IDNO:146。
在一些实施方式中，所述转氨酶多肽能将底物化合物(IA)转化成产物化合物(IIA)，与SEQ ID NO:4相比特性改良，所述多肽包括选自SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、和154的氨基酸序列，以及在选自以下的残基位置处相较SEQ ID NO:4有一个或多个残基差异：X14；X26；X31；X33；X41；X47；X57；X70；X86；X88；X107；X132；X148；X163；X168；X173；X203；X250；X284；X314；X315；X324；X346；X395；X398；X400；X417；X419；X423；X448；和X451，其中残基位置X31；X57；X86；X163；X168；X314；X324；X398；和X417的残基差异选自：X31S；X57Y；X86D；X163I；X163L；X163R；X163V；X168S；X314N；X324H；X398L；X398V；X398W；和X417M。在一些实施方式中，所述氨基酸序列选自SEQ IDNO:4、8、14、16、132、134和146。在一些实施方式中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:4。在一些实施方式中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:8。在一些实施方式中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:134。在一些实施方式中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:146。
在一些实施方式中，所述工程转氨酶多肽能将底物化合物(IA)转化成产物化合物(IIA)，与SEQ ID NO:4相比活性至少为1.2倍，所述多肽包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、22、24、28、30、32、48、52、56、62、64、66、68、86、88、90、92、98、100、104、106、108、110、112、114、116、118、124、126、128、132、134、136、142、144、148、和154。
在一些实施方式中，所述工程转氨酶多肽能将底物化合物(IA)转化成产物化合物(IIA)，与SEQ ID NO:4相比活性至少为5倍，所述多肽包括的氨基酸序列具有一个或多个选自以下的残基差异：X14V、X26R；X33T；X88A/L；X163I/L；和X284A。
在一些实施方式中，用于本公开方法的工程转氨酶多肽能将底物化合物(IA)转化成产物化合物(IIA)，与SEQ ID NO:4相比活性至少为5倍，所述多肽包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、8、10、14、16、22、24、28、30、32、48、52、56、62、64、86、88、90、92、98、100、104、106、108、110、112、114、116、118、124、126、128、132、134、136、142、144、148、和154。
在一些实施方式中，所述工程转氨酶多肽相较SEQ ID NO:4所示多肽在化合物(IA)转化成化合物(IIA)中对1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺特别是(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺抑制有至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更高不应性。一般，对产物化合物的不应性或抗性增加能在14g/L或16g/L化合物(IIA)存在时于HTP分析条件下测量，如表2A和2B以及实施例所述。在一些实施方式中，所述工程转氨酶多肽对1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺抑制有至少1.2倍或更高不应性，所述多肽包括的氨基酸序列相较SEQ ID NO:4具有选自以下的一个或多个残基差异：X26R；X70A；X86D；X88A/L；X132F；X163L；X315G；X395P；X398L；和X419S。
在一些实施方式中，所述工程转氨酶多肽在化合物(IA)转化成化合物(IIA)中特性改良，所述多肽具有含选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、和154。
在一些实施方式中，所述工程转氨酶能在合适反应条件下将化合物(IA)转化成化合物(IIA)，所述酶包括与SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、和154之一有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％,或99％同一性的氨基酸序列，以及任意SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、和154中存在相较SEQ ID NO:4的氨基酸残基差异，如表2A和2B所提供。
在一些实施方式中，所述工程多肽可采用多种形式，例如作为分离制品、基本纯的酶、用编码该酶的基因转化的全细胞、和/或细胞提取物和/或所述细胞裂解物。所述酶能冻干、喷雾干燥、沉淀或采用粗糊剂形式，如下进一步讨论。
在一些实施方式中，所述转氨酶多肽能结合于物理底物上。所述转氨酶多肽可非共价或共价结合于物理底物上，从而其保留相对于SEQ ID NO:4参比多肽的改良活性、立体选择性、产物耐受性、稳定性和/或其它改良特性。在这类实施方式中，所述固定多肽能促进合适酮基底物如化合物(IA)或其结构类似物向对应胺产物如化合物(IIA)或对应结构类似物的生物催化转化，且在反应完全后易保留(如通过保留其中固定有多肽的珠)，然后在后续反应中重复利用或再生。这种固定酶过程能进一步提高效率并降低成本。酶固定化的方法为本领域熟知。用于偶联底物的多种方法如膜、珠、玻璃等描述于Hermanson、G.T.、《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques),第2版,学术出版社；(2008)、和《生物偶联实验指南：策略与方法》(Bioconjugation Protocols:Strategies andMethods),收录于《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)、C.M.Niemeyer编、胡马纳出版社(Humana Press)(2004)；其公开内容通过引用纳入本文。
编码工程转氨酶的多核苷酸、表达载体和宿主细胞
另一方面，本公开提供编码本文所述工程转氨酶多肽的多核苷酸。所述多核苷酸可操作地连接一个或多个异源调节序列，所述序列控制基因表达以产生能表达该多肽的重组多核苷酸。表达构建体能引入合适宿主细胞以表达对应的转氨酶多肽，所述构建体包含编码工程转氨酶的异源多核苷酸。
本领域技术人员清楚了解，蛋白序列的可用性和关于对应多种氨基酸的密码子知识提供了对所有能编码对象多肽的多核苷酸的描述。遗传密码的简并性(其中同一氨基酸由替代或同义密码子编码)能形成数量极大的编码改良转氨酶的核酸。因此，掌握关于特定氨基酸序列的知识后，本领域技术人员能通过简单修改一个或多个密码子序列而形成任意数目的不同核酸，所述方式不改变该蛋白的氨基酸序列。在此方面，本公开特别考虑到通过在可能密码子选择基础上选择组合而实现的每一种可能多核苷酸变化，所述多核苷酸编码本文所述多肽，且所有这些变化被认为特定公开用于任何本文所述多肽，包括表2A和2B所示氨基酸序列，并在通过引用纳入本文的序列表中公开为SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、和154。
在多个实施方式中，所述密码子优先选择成适合生成所述蛋白的宿主细胞。例如，将细菌使用的优选密码子用于在细菌中表达基因；将酵母使用的优选密码子用于酵母中表达；将哺乳动物使用的优选密码子用于哺乳动物细胞中表达。在一些实施方式中，不需要取代所有密码子以优化转氨酶的密码子使用，因为天然序列会包括优选密码子且并非所有氨基酸残基需要使用优选密码子。结果，编码转氨酶的密码子优化多核苷酸可在约40％、50％、60％、70％、80％或大于90％的全长编码区密码子位置包含优选密码子。
编码改良转氨酶多肽的经分离多核苷酸可以多种方式操作从而提供多核苷酸表达。在一些实施方式中，编码所述多肽的多核苷酸可作为表达载体提供，其中存在一个或多个控制序列以调节多核苷酸和/或多肽表达。根据表达载体，在经分离多核苷酸插入载体前对其进行操作可能是需要或必须的。用重组DNA方法修饰多核苷酸和核酸序列的技术为本领域熟知。指南参见Sambrook等、2001、《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、第3版、冷泉港实验室出版社；和《新编分子生物学实验指南》、Ausubel.F.编、格林出版联合公司(Greene Pub.Associates)、1998、2006年更新。
在本文的实施方式中，能用本领域技术人员采用的方法获得改良的多肽和对应多核苷酸。编码野生型河流孤菌多肽的亲本多核苷酸序列描述于Shin等、2003、Appl.Microbiol.Biotechnol.61(5-6):463-471，产生稳定性和底物识别性质提高的工程转氨酶多肽的方法公开于专利申请公开WO2010081053和US20100209981，所述专利通过引用纳入本文。
所述工程多肽的序列已知时，能通过标准固相法根据已知合成方法制备编码该酶的多核苷酸。在一些实施方式中，具有多至约100碱基的片段可单独合成，然后连接(如通过酶或化学连接方法，或聚合酶介导方法)形成任何所需连续序列。例如，本发明的多核苷酸和寡核苷酸可通过化学合成制备，如使用Beaucage等,1981,Tet Lett 22:1859-69所述经典亚磷酰胺法、或Matthes等,1984,EMBO J.3:801-05所述方法，例如其通常在自动合成方法中实施。根据亚磷酰胺法，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化，退火；连接并克隆到合适载体中。另外，可从任意多种商业来源获得基本任何核酸。
因此，在一些实施方式中，制备工程转氨酶多肽的方法可包括：(a)合成编码多肽的多核苷酸，所述多核苷酸含有选自SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、和154的氨基酸序列且在选自以下的残基位置处相较SEQ ID NO:4有一个或多个残基差异：X14；X26；X31；X33；X41；X47；X57；X70；X86；X88；X107；X132；X148；X163；X168；X173；X203；X250；X284；X314；X315；X324；X346；X395；X398；X400；X417；X419；X423；X448；和X451，其中残基位置X31；X57；X86；X163；X168；X314；X324；X398；和X417处的残基差异选自：X31S；X57Y；X86D；X163I；X163L；X163R；X163V；X168S；X314N；X324H；X398L；X398V；X398W；和X417M；和(b)表达由所述多核苷酸编码的转氨酶多肽。
在化合物(IA)向化合物(IIA)的转化中，可通过本文所述任何分析条件就所需改良特性如活性、对映选择性、稳定性和产物耐受性测量所表达的工程转氨酶。
在一些实施方式中，宿主细胞中表达的任何工程转氨酶能用任何一种或多种熟知的蛋白纯化技术从细胞和/或培养介质中回收，包括溶菌酶处理、超声处理、过滤、盐析、超速离心和色谱。用于裂解和从细菌如大肠杆菌高效提取蛋白的合适溶液市售可得，商品名CelLytic BTM，为来自密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。
用于分离转氨酶多肽的色谱技术包括反相高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳和亲和色谱等。用于纯化特定酶的条件部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性、分子量、分子形状等因素，且为本领域技术人员清楚了解。
在一些实施方式中，亲和技术可用于分离改良的转氨酶。对于亲和色谱纯化，可使用特异性结合转氨酶多肽的任何抗体。对于抗体生成，可通过注射转氨酶多肽或其片段来免疫多种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。转氨酶多肽或其片段可通过侧链官能团或结合侧链官能团的接头来连接合适载体如BSA。根据宿主物种，可采用多种佐剂增加免疫应答，包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)，矿物胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、多聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔虫戚血兰素、二硝基酚，以及潜在有用的人类佐剂如BCG(卡介苗(bacilli Calmette Guerin))和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
使用工程转氨酶的方法
另一方面，本文所述转氨酶能用于完成转氨酶反应的过程，其中来自氨基供体的氨基转至氨基受体如酮基底物以生成胺。使用前手性酮基受体能引起手性胺在对映体过量下生成。一般，实施转氨反应的过程包括在适合氨基受体转化成胺的反应条件下用本公开的工程转氨酶多肽接触或孵育氨基供体和氨基受体。
在一些实施方式中，所述转氨酶能用于式(I)的底物化合物向式(II)的产物化合物转化。因此，在一些实施方式中，在对映体过量下制备式(II)化合物的过程包括在氨基供体存在时于合适反应条件下将式(I)化合物接触本文所述工程转氨酶多肽。在所述过程的一些实施方式中，式(II)化合物能在至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高对映体过量下形成。
对于上述过程，可使用本文所述任何工程转氨酶。例如但不限于，在一些实施方式中，所述过程能使用工程转氨酶多肽，所述多肽包括与选自SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、和154的参比序列有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，以及在选自以下的残基位置处相较SEQ ID NO：4有一个或多个残基差异：X14；X26；X31；X33；X41；X47；X57；X70；X86；X88；X107；X132；X148；X163；X168；X173；X203；X250；X284；X314；X315；X324；X346；X395；X398；X400；X417；X419；X423；X448；和X451，其中残基位置X31；X57；X86；X163；X168；X314；X324；X398；和X417处的残基差异选自：X31S；X57Y；X86D；X163I；X163L；X163R；X163V；X168S；X314N；X324H；X398L；X398V；X398W；和X417M。在一些实施方式中，所述参比序列选自SEQ ID NO:4、8、14、16、132、134和146。在一些实施方式中，所述参比序列是SEQ ID NO:4。在一些实施方式中，所述参比序列是SEQ ID NO:8。在一些实施方式中，所述参比序列是SEQ IDNO:134。在一些实施方式中，所述参比序列是SEQ ID NO:146。
在一些实施方式中，能完成本文所述过程的示例性转氨酶可以是含选自以下的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、和154。选择和使用所述工程转氨酶的指南参见本文描述，例如表2和实施例。
在本文的实施方式中且如实施例所述，不同范围的合适反应条件可用于所述过程，包括但不限于一定范围的氨基供体、pH、温度、缓冲液、溶剂系统、底物负载、多肽负载、辅因子负载、压力和反应时间。用本文所述工程转氨酶多肽完成底物化合物向产物化合物生物催化转化过程的更多合适反应条件可根据本文所提供指南通过常规实验方便优化，包括但不限于将该工程转氨酶多肽在浓度、pH、温度、溶剂条件的实验反应条件下接触底物化合物并检测产物化合物。
在本文所述的实施方式中，所述转氨酶多肽使用氨基供体形成产物化合物。在一些实施方式中，所述反应条件中的氨基供体能选自异丙胺(本文也称为“IPM”)、腐胺、L-赖氨酸、α-苯乙胺、D-丙氨酸、L-丙氨酸或D,L-丙氨酸或D,L-鸟氨酸。在一些实施方式中，所述氨基供体选自IPM、腐胺、L-赖氨酸、D-或L-丙氨酸。在一些实施方式中，所述氨基供体是IPM。在一些实施方式中，合适反应条件包括氨基供体特别是IPM，存在浓度为至少约0.1-约3.0M、0.2-约2.5M、约0.5-约2M或约1-约2M。在一些实施方式中，所述氨基供体存在的浓度为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1、1.5、2、2.5或3M。更高浓度的氨基供体如IPM能用于使平衡移向胺产物形成。
用工程转氨酶多肽的合适反应条件通常还包括辅因子。对用工程转氨酶多肽的过程有用的辅因子包括但不限于5’-磷酸吡哆醛(也称为磷酸吡哆醛、PLP、P5P)、吡哆醇(PN)、吡哆醛(PL)、吡哆胺(PM)和其磷酸化对应物；磷酸吡哆醇(PNP)和磷酸吡哆胺(PMP)。在一些实施方式中，辅因子PLP在细胞提取物中天然存在且不需要补充。在所述方法的一些实施方式中，例如用部分纯化或纯化的转氨酶时，合适反应条件包括加入酶反应混合物的辅因子。在一些实施方式中，合适反应条件可包括存在选自PLP、PN、PL、PM、PNP和PMP的辅因子，浓度为约0.1g/L-约10g/L、约0.2g/L-约5g/L、约0.5g/L-约2.5g/L。在一些实施方式中，反应条件包括约0.1g/L或更小、0.2g/L或更小、0.5g/L或更小、1g/L或更小、2.5g/L或更小、5g/L或更小、或10g/L或更小的PLP浓度。在一些实施方式中，所述辅因子能在反应开始时加入和/或在反应中加入额外辅因子。
反应混合物中的底物化合物可变化，考虑例如所需量的产物化合物、底物浓度对酶活性的影响、反应条件下的酶稳定性以及底物向产物的转化百分比。在一些实施方式中，合适反应条件包括至少约0.5-约200g/L、1-约200g/L、5-约150g/L、约10-约100g/L、20-约100g/L或约50-约100g/L的底物化合物负载。在一些实施方式中，合适反应条件包括至少约0.5g/L、至少约1g/L、至少约5g/L、至少约10g/L、至少约15g/L、至少约20g/L、至少约30g/L、至少约50g/L、至少约75g/L、至少约100g/L、至少约150g/L或至少约200g/L、或甚至更高的底物化合物负载。
本文所公开的活性和/或立体选择性提高的工程转氨酶多肽可提供能用较低浓度的工程多肽实现较高的转化百分比的工艺过程。在所述过程的一些实施方式中，合适反应条件包括约0.01-约50g/L；约0.05-约50g/L；约0.1-约40g/L；约1-约40g/L；约2-约40g/L；约5-约40g/L；约5-约30g/L；约0.1-约10g/L；约0.5-约10g/L；约1-约10g/L；约0.1-约5g/L；约0.5-约5g/L；或约0.1-约2g/L的工程多肽浓度。在一些实施方式中，所述转氨酶多肽的浓度为约0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40或50g/L。
转氨反应进程中，反应混合物的pH可变化。反应混合物的pH可维持于所需pH或在所需pH范围内。这可通过在反应进程前和/或期间加入酸或碱来完成。或者，pH可用缓冲液控制。因此，在一些实施方式中，所述反应条件包括缓冲液。维持所需pH范围的合适缓冲液为本领域已知且包括(例如但不限于)硼酸盐、碳酸盐、磷酸盐、三乙醇胺缓冲液等。在一些实施方式中，所述缓冲液是硼酸盐。在所述过程的一些实施方式中，合适反应条件包括三乙醇胺缓冲溶液，其中三乙醇胺浓度为约0.01-约0.4M、0.05-约0.4M、0.1-约0.3M、或约0.1-约0.2M。在一些实施方式中，所述反应条件包括约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.07、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.3或0.4M的三乙醇胺浓度。在一些实施方式中，所述反应条件包括水作为合适溶剂，不存在任何缓冲液。
在所述过程的实施方式中，所述反应条件可包括合适pH。所需pH或在所需pH范围能用酸或碱、合适缓冲液、或缓冲液和酸或碱添加的组合来维持。反应混合物的pH能在反应进程前和/或期间加以控制。在一些实施方式中，合适反应条件包括溶液pH，含有约6-约12的pH、约6-约10的pH、约6-约8的pH、约7-约10的pH、约7-约9的pH、或约7-约8的pH。在一些实施方式中，所述反应条件包括约6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10.10.5、11、11.5或12的溶液pH。
在本文所述过程的实施方式中，合适温度能用于反应条件，例如考虑较高温度下反应速率增加以及反应时间段中的酶活性。例如，本公开的工程多肽相对于自然产生的转氨酶多肽如SEQ ID NO:2野生型多肽稳定性增加，这使所述工程多肽能在较高温度下使用，用于就所述反应而言增加的转化率和改良的底物溶解度特性。因此，在一些实施方式中，合适反应条件包括约10℃-约70℃、约10℃-约65℃、约15℃-约60℃、约20℃-约60℃、约20℃-约55℃、约30℃-约55℃、或约40℃-约50℃的温度。在一些实施方式中，合适反应条件包括约10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃的温度。在一些实施方式中，酶反应中的温度能在整个反应进程中维持于某一温度。在一些实施方式中，酶反应中的温度可在反应进程期间根据温度分布调整。
本公开的方法一般在溶剂中完成。合适溶剂包括水、水性缓冲溶液、有机溶剂、聚合溶剂、和/或共溶剂体系，所述体系一般包括水溶剂、有机溶剂和/或聚合溶剂。水溶剂(水或水性共溶剂体系)可以是pH-缓冲或非缓冲。在一些实施方式中，用工程转氨酶多肽的所述过程一般在水性共溶剂体系中完成，所述体系一般包括有机溶剂(如乙醇、异丙醇(IPA)、二甲亚砜(DMSO)、乙酸乙酯、乙酸丁酯、1-辛醇、庚烷、辛烷、甲基叔丁基醚(MTBE)、甲苯等)、离子或极性溶剂(如1-乙基-4-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、甘油、聚乙二醇等)。在一些实施方式中，所述共溶剂可以是极性溶剂，如多元醇、二甲亚砜、DMSO或低级醇。如果是单一液相，水性共溶剂体系的非水性共溶剂组分可与水性组分混溶，如果有2个液相，水性共溶剂体系的非水性共溶剂组分可与水性组分部分混溶或不混溶。示例性水性共溶剂体系能包括水和一种或多种选自有机溶剂、极性溶剂及多元醇溶剂的共溶剂。一般，水性共溶剂体系的共溶剂组分选择成在所述反应条件下不会不利地灭活转氨酶活性。合适的共溶剂体系能如下容易鉴定：测量候选溶剂体系中特定工程转氨酶的酶活性，有确定的感兴趣底物，采用酶活性测定如本文所述的那些。
在所述过程的一些实施方式中，合适反应条件包括水性共溶剂，其中所述共溶剂包括多元醇溶剂，特别是乙二醇。合适多元醇溶剂的示例包括(例如但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇甲醚、二乙二醇二甲醚、三乙二醇二甲醚和聚丙二醇。在一些实施方式中，所述水性共溶剂包括聚乙二醇，其有不同分子量可用。特别有用的是低分子量乙二醇，如PEG200-PEG600。因此，在一些实施方式中，所述水性共溶剂包括约1％-约40％v/v；约1％-约40％v/v；约2％-约40％v/v；约5％-约40％v/v；2％-约30％v/v；5％-约30％v/v；1-约20％v/v；约2％-约20％v/v；约5％-约20％v/v；约1％-约10％v/v；约2％-约10％v/v的PEG200。在一些实施方式中，合适反应条件包括水性共溶剂，所述水性共溶剂含约1％、2％、5％、10％、15％、20％；25％；30％；35％；35％或约40％v/v的PEG200。
在所述过程的一些实施方式中，合适反应条件包括水性共溶剂，其中所述水性共溶剂含约1％-约80％(v/v)、约1-约70％(v/v)、约2％-约60％(v/v)、约5％-约40％(v/v)、10％-约40％(v/v)、10％-约30％(v/v)、或约10％-约20％(v/v)的DMSO。在所述过程的一些实施方式中，合适反应条件包括水性共溶剂，所述水性共溶剂含约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％(v/v)的DMSO。
转氨反应所用的反应物量一般根据所需产物量和同时采用的转氨酶底物量而变化。本领域普通技术人员易理解如何改变这些量以使其适合所需生产力水平和生产规模。
在一些实施方式中，加入反应物的顺序不重要。所述反应物可一起同时加入溶剂(如单相溶剂、双相水性共溶剂体系等)，或者，一些反应物可分开加入，且一些在不同时间点共同加入。例如，辅因子、转氨酶和转氨酶底物可首先加入溶剂。
可向反应提供不同形式的固体反应物(如酶、盐等)，包括粉末(如冻干、喷雾干燥等)、溶液、乳剂、悬液等。所述反应物能用本领域普通技术人员已知的方法和设备容易冻干和喷雾干燥。例如，蛋白溶液可分成小的等分液体于-80℃冷冻，然后加入预冷的冻干室，接着应用真空。
为了提高混合效率，使用水性共溶剂体系时，可首先加入转氨酶和辅因子并混合到水相中。然后可加入有机相并混合，接着加入转氨酶底物。或者，转氨酶底物可在有机相中预混，然后加入水相。
转氨反应一般能推进，直到酮基底物向胺产物的进一步转化不会随着反应时间而显著改变，如少于10％底物转化、或少于5％底物转化。在一些实施方式中，所述反应能推进，直到底物酮基向产物胺的转化完全或接近完全。底物转化成产物能用已知方法通过检测底物和/或产物来监测。合适的方法包括气相色谱分析、HPLC等。反应混合物中所产生手性胺产物的转化产率一般大于约50％，还可大于约60％，还可大于约70％，还可大于约80％，还可大于90％，且通常大于约97％。在一些实施方式中，用工程转氨酶多肽在合适反应条件下制备式(II)化合物的方法引起至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的酮基底物如式(I)化合物在约48h或更少、约36h或更少、约24h或更少、或甚至更少时间内转化成胺产物化合物如式(II)化合物。
在所述过程的一些实施方式中，合适反应条件包括至少约20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、100g/L或更高的底物化合物底物负载，且其中所述方法引起至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的底物化合物在约48h或更少、约36h或更少、或者约24h或更少时间内转化成产物化合物。
本公开的工程转氨酶多肽在合适反应条件下用于所述过程时，产生对映体过量的手性胺，对映体过量为至少97％、98、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％e.e.。
在用工程转氨酶多肽将底物化合物转化成胺产物化合物的方法的另一个实施方式中，合适反应条件包括先将底物加载到反应溶液中，随后使其接触所述多肽。向此反应溶液进一步补充额外化合物底物，以至少约1g/L/h、至少约2g/L/h、至少约4g/L/h、至少约6g/L/h或更高的速度随着时间连续加入。因此，根据这些合适反应条件，将多肽加入初始底物负载为至少约20g/L、30g/L或40g/L的溶液。所述多肽加入之后，以约2g/L/h、4g/L/h或6g/L/h的速度向所述溶液连续添加更多底物，直至达到至少约30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、100g/L、150g/L、200g/L或更多的高许多的最终底物负载。因此，在一些实施方式中，合适反应条件包括向初始底物负载为至少约20g/L、30g/L或40g/L的溶液加入所述多肽，然后以约2g/L/h、4g/L/h或6g/L/h的速度向溶液加入更多底物，直至达到至少约30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、100g/L或更多的最终底物负载。此底物补充反应条件能实现更高底物负载而同时维持酮基底物向胺产物的高转化率，转化率为至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在此方法的一些实施方式中，溶液中加入的更多底物包括异丙胺或异丙胺乙酸盐，浓度为至少约0.5M、至少约1.0M、至少约2.5M、至少约5.0M、至少约7.5M、至少约10.0M。
在所述过程的一些实施方式中，用工程转氨酶多肽的转氨反应可包括下列合适反应条件：(a)约5g/L-200g/L的底物负载；(b)约0.1-50g/L转氨酶多肽；(c)约0.1-4M异丙胺(IPM)；(d)约0.1-10g/L磷酸吡哆醛(PLP)辅因子；(e)约6-9的pH；和(f)约30-60℃的温度。
在所述过程的一些实施方式中，用工程转氨酶多肽的转氨反应可包括下列合适反应条件：(a)约5-约20g/L的底物负载；(b)约0.05-2g/L转氨酶多肽；(c)约1-10％v/v的PEG200；(d)约1-2M异丙胺(IPM)；(e)约0.1-1g/L磷酸吡哆醛(PLP)辅因子；(f)约0.1-约0.5M三乙醇胺(TEA)；(g)约6-8的pH；和(h)约45-55℃的温度。
在所述过程的一些实施方式中，用工程转氨酶多肽的转氨反应可包括下列合适反应条件：(a)约25-约100g/L的底物负载；(b)约0.5-10g/L转氨酶多肽；(c)约1-10％v/v的PEG200；(d)约1-2M异丙胺(IPM)；(e)约0.1-1g/L磷酸吡哆醛(PLP)辅因子；(f)约0.1-约0.5M三乙醇胺；(g)约6-8的pH；和(h)约45-55℃的温度。
在一些实施方式中，进行额外反应组分或额外技术以补充反应条件。这些能包括设法稳定或防止酶灭活、减少产物抑制、使反应平衡移向产物胺形成。
因此，在所述制备胺如手性胺过程的一些实施方式中，可加入额外量的氨基受体(多至饱和)和/或可从反应混合物连续移出形成的氨基受体(酮)。例如，溶剂桥或双相共溶剂体系能用于将胺产物移到提取溶液，从而减少胺产物的抑制并使平衡移向产物形成(参见例如Yun和Kim、2008、Biosci.Biotechnol.Biochem.72(11):3030-3033)。
在所述过程的一些实施方式中，合适反应条件包括存在还原的辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，其能作用于限制转氨酶灭活(参见例如van Ophem等,1998,Biochemistry 37(9):2879-88)。在这类存在NADH的实施方式中，辅因子再生系统如葡糖脱氢酶(GDH)和葡萄糖或甲酸脱氢酶和甲酸盐能用于在反应介质中再生NADH。
在一些实施方式中，所述过程还可包括在氨基转至氨基受体时，移出形成自氨基供体的羰基副产物。所述原位移出能降低逆反应速率，从而正向反应占优且更多底物随后转化成产物。能以多种方式移出羰基副产物。氨基供体是氨基酸如丙氨酸时，羰基副产物酮酸可通过与过氧化物反应而移出(参见例如US2008/0213845，所述专利通过引用纳入本文)。可使用的过氧化物包括过氧化氢；过氧酸(过酸)如过乙酸(CH3CO3H)、三氟过氧乙酸和间氯过氧苯甲酸；有机过氧化物如叔丁基过氧化物((CH3)3COOH)、或其他选择性氧化剂如四丙基过钌酸铵、MnO2、KMnO4、四氧化钌和相关化合物。或者，丙酮酸移除能用乳酸脱氢酶使平衡移向产物胺通过其还原成乳酸盐实现(参见例如Koszelewski等、2008、Adv.Syn.Catal.350:2761-2766)。丙酮酸移除还能用丙酮酸脱羧酶(参见例如等、2008、Chem BioChem 9:363-365)或乙酰乳酸合酶(见Yun和Kim，同上)通过其脱羧反应实现。
或者，在氨基酸用作氨基供体的实施方式中，酮酸羰基副产物能通过与氨和NADH反应在氨基供体如氨存在下再循环生成氨基酸，使用合适的脱氢酶如氨基酸脱氢酶，从而补充氨基供体。
在一些实施方式中，其中选择氨基供体产生蒸汽压高于水的羰基副产物(例如低沸点副产品如挥发性有机羰基化合物)，可通过用非反应气体对溶液鼓泡或应用真空以降低反应压力并移出气相中存在的羰基副产物，移除羰基副产物。非反应气体是不与反应组分反应的任何气体。多种非反应气体包括氮气和稀有气体(如惰性气体)。在一些实施方式中，所述非反应气体是氮气。在一些实施方式中，用于所述过程的氨基供体是异丙胺(IPM)，其在氨基转至氨基受体后形成羰基副产物丙酮。通过鼓入氮气或向反应溶液应用真空并经丙酮阱如冷凝器或其他冷阱从气相中移出丙酮，可移除丙酮。或者，丙酮能用转氨酶通过还原成异丙醇来移除。
在移除羰基副产物的上述过程的一些实施方式中，对应氨基供体可在转氨反应中加入以补充氨基供体和/或维持反应pH。补充氨基供体还使平衡移向产物形成，从而增加底物向产物转化。因此，在氨基供体是异丙胺且丙酮产物原位移除的一些实施方式中，异丙胺可加入溶液以在丙酮移除期间补充氨基供体和维持反应pH(如约8.5)。
在其他实施方式中，用于底物化合物转化成产物化合物的任何上述过程还可包括选自以下的一个或多个步骤：产物化合物的提取；分离；纯化；和结晶。用于从上述方法所生成的生物催化反应混合物中提取、分离、纯化和/或结晶产物胺的方法、技术和操作为普通技术人员已知和/或通过常规实验获取。另外，举例说明性方法由以下实施例提供。
J部分：实施例
下列实施例用于说明本发明而不限制其范围，另一方面，其代表反应步骤、中间体和/或本发明过程的优选实施方式。
缩写：
δ             化学位移
μl            微升
μm            微米
aq             水性
(+)CSA         (+)樟脑磺酸
ESTP           乙酸乙酯
IPA            乙酸异丙酯
TRMA           三乙胺
Ac             乙酰
AcOH           乙酸
br             宽
brm            宽多重峰
br.m.          宽多重峰
br.mult.       宽多重峰
br.s.          宽信号
br.sign.       宽信号
cat.                 催化量
compl.m              复合多重峰
compl.mult.          复合多重峰
copl.m.              复合多重峰
cpl.m.               复合多重峰
CDCl3                氘代氯仿
CH2Cl2               二氯甲烷
CH2O                 甲醛
CO2                  二氧化碳
d                    二重峰
dd                   双重双峰
de                   非对映体过量
dr                   非对映比率
DCM                  二氯甲烷
DEA                  二乙胺
DMSO                 二甲亚砜
DMSO-d6              氘代二甲亚砜
ee                   对映体过量
equiv                等价
ES                   电喷射
ES+                  正电电喷雾离子化
ESI                  电喷雾离子化
Et                   乙基
Et2O                 二乙醚
EtOAc                乙酸乙酯
EtOH                 乙醇
FTIR                 傅里叶变换红外线
g                    克
GC                   气相色谱
h                    小时
HCl                  盐酸
HCl(aq)               氯化氢水溶液
HNMR               质子核磁共振
1HNMR              质子核磁共振
HPLC               高效液相色谱
H3PO4              磷酸
HRMS               高分辨质谱
H2SO4              硫酸
Hz                 赫兹
iPr                异丙基
iPr2NEt            N-乙基二异丙胺
iPrOAc             乙酸异丙酯
iPrOH              异丙醇
IR                 红外
J                  耦合常数
K2CO3              碳酸钾
L                  升
LC-MS              液相色谱-质谱
LCMS               液相色谱-质谱
LRMS               低分辨率质谱
m                  多重峰
m/e                质荷比
mg                 毫克
min                分钟
ml                 毫升
mL                 毫升
mmol(s)            毫摩尔
mol(s)             摩尔
monosub.           单取代
mp                 熔点
m.p.               熔点
mult.d             多重双峰
m/z                质荷比
M                  摩尔浓度/摩尔
Me                 甲基
2-MeTHF            2-甲基四氢呋喃
MeOH               甲醇
MgSO4              硫酸镁
MS                 质谱法
[MS]+              质子加合物质量
MTBE               叔丁甲醚
nm                 纳米
N                  氮原子
N2                 氮气
NaCl               氯化钠
Na2CO3             碳酸钠
NaHCO3             碳酸氢钠
NaHMDS             双(三甲基甲硅烷基)氨基钠
NaOH               氢氧化钠
Na2SO4             硫酸钠
NH4Cl              氯化铵
NMR                核磁共振
oct.               八重峰
ppm                百万分之
psi                每平方英寸磅数
Pd/C               钯碳
Pd(PPh3)4          四(三苯基膦)钯(0)
Pt/C               铂碳
q                  四重峰
Rh/C               铑碳
RT＝rt              室温
s                  单峰
sev.brm            一些宽多重峰
sev.dd             一些双重双峰
t                  三重峰
temp.              温度
T               温度
tR              保留时间
tBu             叔丁基
TEA             三乙胺
TFA             三氟乙酸
THF             四氢呋喃
Tol             甲苯
UV              紫外线
vol.            体积
wt.             重量
实施例1：合成酮中间体
6-氯-5-氟-3-羟基-3-(2-氧代-丙基)-1,3-二氢-吲哚-2-酮
向6-氯-5-氟-靛红(25g,125mmol)的丙酮悬液(620ml)加入Et2NH(0.9g,12.5mmol)和K2CO3(1.7g,12.5mmol)。反应混合物加热回流2小时。冷却至室温后，过滤反应混合物并在减压下移除溶剂。粗产物于50℃再溶于MeOH(300ml)并加入水。加入水后，固体沉淀。在减压下于50℃移除MeOH(250mL)；混合物冷却至0-5℃并搅拌30分钟；过滤固体且干燥生成6-氯-5-氟-3-羟基-3-(2-氧代-丙基)-1,3-二氢-吲哚-2-酮(27g)。1H NMR(DMSO-d6):2.00(3H,s,CH3),3.09(1H,d,CH,J＝16Hz),3.39(1H,d,CH,J＝16Hz),6.16(1H,s,OH)；6.88(1H,d,CH,J＝8Hz),7.36(1H,d,CH,J＝12Hz),10.37(1H,s,NH).MS(ESI)m/z 258.0(M+H)+
HPLC法：柱：Agilent Extend-C18；150×3.0mm；3.5μm。流动相A(0.1％H3PO4)，溶于水；流动相B(乙腈)。梯度：0min(95％A)；0.5min(95％A),14min(5％A),19.5min(5％A)。流速：0.5ml min-1。波长：210nm。温度：40℃。保留时间：7.52min。
6-氯-5-氟-3-羟基-3-(2-甲基-[1,3]二氧戊环-2-基甲基)-1,3-二氢-吲哚-2-酮
向6-氯-5-氟-3-羟基-3-(2-氧代丙基)二氢吲哚-2-酮(25g,97mmol)的乙二醇悬液(250mL)加入原甲酸三乙酯(43g,291mmol)和甲苯-4-磺酸单水合物(0.9g,4.8mmol)。反应混合物在40-50℃加热2小时。连续加入MeTHF(500mL)和10％NaCl水溶液(500mL)。分离有机层并用水洗2次。溶剂在真空下蒸发后，白色固体用TBME(400mL)洗涤且干燥生成6-氯-5-氟-3-羟基-3-(2-甲基-[1,3]二氧戊环-2-基甲基)-1,3-二氢-吲哚-2-酮(27.8g)。1H NMR(DMSO-d6):1.00(3H,s,CH3),2.37(2H,d,CH2,),3.13(1H,q,CHH,),3.58(1H,q,CHH,),3.59(1H,q,CHH,),3.68(1H,q,CHH,),6.00(1H,s,OH)；6.85(1H,d,CH,J＝8Hz),7.31(1H,d,CH,J＝12Hz),10.24(1H,s,NH).MS(ESI)m/z 302.0(M+H)+
HPLC法：柱：Agilent Extend-C18；150×3.0mm；3.5μm。流动相A(0.1％H3PO4)，溶于水；流动相B(乙腈)。梯度：0min(95％A)；0.5min(95％A),14min(5％A),19.5min(5％A)。流速：0.5ml min-1。波长：210nm。温度：40℃。保留时间：7.94min。
1-(6-氯-5-氟-1H-吲哚-3-基)-丙-2-酮
在N2气氛下于60℃向6-氯-5-氟-3-羟基-3-((2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)甲基)二氢吲哚-2-酮的THF溶液(250mL)缓慢加入溶于THF(100mL)的Red-Al(79.8g,276mmol)。加入后，混合物室温搅拌3小时。加入20％HCl(400mL)且混合物搅拌20分钟。加入乙酸乙酯(500mL)并搅拌10分钟。分离有机层并用水洗2次(100ml x2)。用Na2SO4(50g)和活性炭(5g)室温处理后，过滤混合物并浓缩滤液。粗产物用MeOH(80mL)和水(60mL)再结晶产生1-(6-氯-5-氟-1H-吲哚-3-基)-丙-2-酮(15.5g)。
1H NMR(DMSO-d6):2.21(3H,s,CH3),3.78(2H,s,CH2,),7.13(1H,d,CH,J＝4Hz)；7.23(1H,d,CH,J＝8Hz),7.33(1H,d,CH,J＝8Hz),8.23(1H,s,NH).
MS(ESI)m/z 226.0(M+H)+
HPLC法：柱：Agilent Extend-C18；150×3.0mm；3.5μm。流动相A(0.1％H3PO4)，溶于水；流动相B(乙腈)。梯度：0min(95％A)；0.5min(95％A),14min(5％A),19.5min(5％A)。流速：0.5ml min-1。波长：210nm。温度：40℃。保留时间：10.75min。
实施例2：酮起始材料的第二种合成
1-(6-氯-5-氟-1H-吲哚-3-基)-丙-2-酮
在N2下，将Pt/C(10g,5％碳载Pt)填充到6-氯-5-氟-3-((Z)-2-硝基-丙烯基)-1H-吲哚(100g,0.39mol)的乙酸乙酯悬液(500mL)。反应混合物抽真空并用H2清洗3次，室温搅拌过夜。滤去催化剂且在减压下移除有机溶剂以产生棕色油。所述油再溶于EtOH(500mL)并加入溶于水(500mL)的亚硫酸氢钠(81.7g,0.79mol)。所述悬液加热至80℃过夜。滤去沉淀物且在减压下移除乙醇。剩余物用水(500mL)稀释并用乙酸乙酯(300mL X2)提取。合并的有机层用Na2SO4干燥并在旋转蒸发仪中浓缩产生棕色油(53g,60％产率)。
实施例3：酮中间体的第二种合成
1-(6-氯-5-氟-1H-吲哚-3-基)-丙-2-酮
将雷尼/镍(Raney/Ni)(0.75g)和乙酸(1.1mL,19.6mmol)室温填充入溶于MeOH和H2O混合物(2:1,50mL)的6-氯-5-氟-3-((Z)-2-硝基-丙烯基)-1H-吲哚(5g,19.6mmol)。反应混合物抽真空并用H2清洗3次，50℃加热过夜。向反应混合物加入MeOH(50mL)且在硅藻土上滤去催化剂。溶剂浓缩至50mL并加入H2O(300ml)。加入H2O后，生成灰白色固体。过滤所述固体并用水洗涤。烤箱中干燥后，分离出2.53g灰白色固体。
实施例4：合成、优化和筛选工程转氨酶多肽
基因合成和优化：来自SEQ ID NO:2河流孤菌的编码所报道野生型ω-转氨酶多肽的多核苷酸序列是密码子优化的并合成为SEQ ID NO:1基因。将SEQ IDNO:1的合成基因克隆到pCK110900载体系统中(参见例如美国专利申请公开20060195947，所述专利在此通过引用纳入本文)且随后在大肠杆菌W3110fhuA中表达。大肠杆菌W3110在lac启动子控制下表达转氨酶多肽作为胞内蛋白。编码工程转氨酶多肽SEQ ID NO:4的多核苷酸(SEQ ID NO:3)通过密码子优化基因SEQ ID NO:1定向进化来获得。SEQ ID NO:4多肽相对于SEQ ID NO:2有24个氨基酸残基差异(A9T；G18A；D21H；V31M；N45H；F86Y；A133R；R146L；W147K；V153S；K163F；V177L；R211K；P233T；A235P；P244T；M294V；P318D；A323T；S324G；A383V；T391A；C424A；F427Y)。此合成基因SEQID NO:3(编码SEQ ID NO:4多肽)用作起始主干以用定向进化标准方法进一步优化，这是通过基因合成的迭代变体库生成，然后筛选和测序所述命中以产生能将化合物(IA)转化成化合物(IIA)的工程转氨酶编码基因，其相对于多肽SEQ ID NO:2和4酶特性改良。所得工程转氨酶多肽序列和特定突变及相对活性如表2A所列。
实施例5：生成工程转氨酶
所述工程转氨酶多肽在大肠杆菌W3110中作为胞内蛋白生成，其在lac启动子控制下表达。所述多肽主要作为可溶性胞质活性酶累积。采用摇瓶步骤产生工程多肽粉末，所述粉末能用于本文所公开的活性测定或生物催化过程。
高通量生长和表达。挑出细胞并在含1％葡萄糖和30μg/mL氯霉素(CAM)的LB培养基中于30℃、200rpm、85％湿度下过夜生长。将20μL过夜生长物移至含380μL 2xYT生长培养基的深孔板，所述培养基含有30μg/mL CAM、1mMIPTG、1mM MgSO4，并在30℃、200rpm、85％湿度下孵育约18小时。传代培养的TB培养基由TB培养基(380uL/孔)、30ug/mL CAM、1mM MgSO4和1mMIPTG构成。细胞培养物在4000rpm、4℃离心10分钟，弃去培养基。如下所述，细胞团重悬于200或400μL裂解缓冲液(0.1M三乙醇胺(TEA)buffer、pH9.0、containing 1mM MgSO4、400μg/mL PMBS and 500μg/mL Lysozyme)。
摇瓶粉(SFP)生成：采用摇瓶方法产生用于本文所公开二级筛选测定或生物催化过程的工程转氨酶多肽粉末。摇瓶粉(SFP)包括约30％总蛋白并因而提供与HTP测定所用细胞裂解物相比更纯化的工程酶制品。将含感兴趣工程转氨酶编码质粒的大肠杆菌单一微生物菌落接种到含30μg/ml氯霉素和1％葡萄糖的50mL LB肉汤。细胞在孵育器中于30℃生长过夜(至少16小时)，以250rpm振荡。所述培养物在1升烧瓶中稀释到含30μg/ml氯霉素的250mL极品肉汤(12g/L细菌用胰蛋白胨、24g/L酵母膏、4mL/L甘油、65mM磷酸钾、pH7.0、1mM MgSO4)，600nm的光密度(OD600)为0.2且能在30℃生长。通过在培养物的OD600为0.6-0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(“IPTG”)到1mM终浓度来诱导转氨酶基因的表达，然后孵育持续过夜(至少16小时)。通过离心(5000rpm、15min、4℃)和弃上清来收获细胞。细胞团用等体积的冷(4℃)100mM三乙醇胺(氯化物)缓冲液、pH7.0(可选包括2mM MgSO4)重悬，通过上述离心收获。经洗涤细胞重悬于2体积的冷三乙醇胺(氯化物)缓冲液并以12,000psi通过弗氏压碎器2次，同时维持于4℃。细胞碎片通过离心(9000rpm、45分钟、4℃)移除。收集澄清裂解物上清并于-20℃保存。冷冻澄清裂解物的冻干提供粗转氨酶多肽的干燥摇瓶粉。或者，细胞团(洗涤前或后)能在4℃或-80℃保存。
下游过程(DSP)粉生成：DSP粉包含约80％总蛋白并因而提供与高通量测定所用细胞裂解物相比更纯化的工程转氨酶制品。用于DSP粉生成的大规模(～100–120g)工程转氨酶发酵能以小批量完成，然后是根据标准生物加工方法的分批补料过程。简言之，通过加入IPTG到到1mM终浓度来诱导转氨酶表达。发酵后，收获细胞并重悬于100mM三乙醇胺-H2SO4缓冲液，然后通过匀化进行机械破坏。细胞碎片和核酸用聚乙烯亚胺(PEI)絮凝且所述悬液通过离心澄清。所得清澈上清用切向错流超滤膜浓缩以移出盐和水。然后，所浓缩和部分纯化的酶浓缩物能在冻干器中干燥并包装(如聚乙烯容器中)。
实施例6：分析程序
HTP反应的HPLC分析：淬灭反应的等分部分在下列条件下进行HPLC分析。
从所得色谱图如下测定化合物(IA)向化合物(IIA)的转化：
转化(％)＝产物面积/(产物面积+底物面积x0.73)x100％
5mL和100mL规模反应的HPLC分析：淬灭反应的等分部分在下列条件下进行HPLC分析。
从所述色谱图如下测定化合物(IA)向化合物(IIA)的转化：
转化(％)＝产物面积/(产物面积+底物面积x0.73)x100％
确定产物手性纯度(％ee)：对映体过量的化合物(IIA)的手性纯度用下列条件通过HPLC评价。
确定产物纯度：产物纯度用下列条件通过HPLC评价。
实施例7：高通量(HTP)筛选用于使化合物(IA)转化成化合物(IIA)的转氨酶
HTP筛选测定：用于引导变体初级选择的高通量筛选在96孔板中通过细胞裂解物完成，测定条件为10g/L化合物(IA)；1mM磷酸吡哆醛(PLP)；2M异丙胺(IPM)、pH7.0)；0.1M三乙醇胺(TEA)、pH7；5％v/v PEG200；10uL裂解物；和50或55℃。
细胞如上所述在96孔板中生长，通过将200uL(用于第1轮)或400uL(用于第2轮)裂解缓冲液((1mg/mL溶菌酶、0.5mg/mL多粘菌素B硫酸盐、1mMPLP、0.1M三乙醇胺(TEA),pH7.0)分散到各孔来制备裂解物。板进行密封，振荡2小时，然后在4,000rpm、4℃离心20分钟以沉淀细胞碎片。
向96孔板的各孔中加入10uL底物储液(200g/L化合物(IIA)溶于PEG200)，然后是180uL异丙胺(IPM)/磷酸吡哆醛(PLP)储液(2.2M IPM和1.06mM PLP，溶于100mM TEA,pH7.0)。为评价产物化合物(IIA)抑制的不应性，向反应混合物加入化合物(IIA)至最终14g/L(用于第1轮测定)和16g/L(用于第2轮测定)。通过加入10uL细胞裂解物/孔来起始反应。密封板，通过50或55℃振荡来孵育24小时。如实施例5所述，用600uL乙腈淬灭反应且样品通过HPLC检测。
实施例8：在5mL规模中将化合物(IA)转化成化合物(IIA)的过程
5mL规模的反应如下完成。向装有十字形磁性搅拌棒的20mL小玻璃瓶加入0.75mL(或在10％v/v PEG 200浓度下为0.5mL)100mM TEA缓冲液(pH7.0)。向所述瓶加入2mL 5M IPM·HCl储液，然后是1mL 5mM PLP储液。所述混合物在500rpm搅拌(磁力搅拌)。然后，所述混合物的pH用1M NaOH溶液调至7.0。然后，向所述瓶加入125mg(或用于50g/L浓度的250mg或用于100g/L浓度的500mg)底物(固体)。接着向所述混合物加入0.25mL(或用于10％v/v的0.5mL)PEG 200。组分终浓度为：25g/L(或50或100g/L)化合物(IA)；1mM PLP；2M IPM；5％v/v(或10％)PEG 200；2g/L TA酶；100mM TEA、pH7.0)。随后搅拌所述混合物并加热至50℃。
通过加入1mL酶储液(10g/L)来起始反应。在不同时间点取20uL样品并用750uL甲醇稀释和HPLC分析。24小时后，用5mL乙腈淬灭所述反应混合物且样品通过HPLC分析以达到所述终％转化。
实施例9：在100mL规模中将化合物(IA)转化成化合物(IIA)的过程
100mL规模的反应如下完成。向有锚形搅拌桨叶的250mL圆底烧瓶加入15mL 100mM TEA缓冲液(pH7)。向圆底烧瓶加入40mL 5M IPM·HCl储液，然后是20mL 5mM PLP储液。所述混合物在100rpm搅拌(架空搅拌)且pH用10M NaOH调至7.0。然后，在约5分钟内向圆底烧瓶搅拌加入固体底物化合物(IA)。接着加入PEG 200(5mL)且混合物加热至50℃。随后加入20mL酶储液(10g/L)以起始反应。反应在200rpm搅拌(架空搅拌)。在不同时间点取20uL样品并用750uL甲醇稀释和HPLC分析。在一些未追踪逐步发展的情况下，24小时后，用100mL乙腈淬灭所述反应混合物且样品通过HPLC分析以达到所述终％转化(图9)。所述反应中不同组分的浓度：酮:25g/L(或50或100g/L)；PLP:1mM；IPM:2M；PEG200:5％v/v；TA酶:2g/L；缓冲液:100mM TEA、pH7.0。如实施例3所述，通过HPLC分析底物向产物的转化。
产物检查：上述条件下反应24小时后(多至点11)，所述反应混合物冷却至室温。所述混合物经标准G4烧结玻璃漏斗过滤，所述漏斗有一张滤纸(Whatman 1、孔径11μm)。圆底烧瓶用随后经同一漏斗过滤的20mL去离子水冲洗。滤饼用20mL去离子水洗2次。滤液的pH用5M HCl溶液从6.8调至3。然后，将滤液转至分液漏斗并用100mL MTBE提取。所述双相混合物能分开。弃去含未反应底物和杂质的MTBE层。将水层转至烧杯且加入100mL MTBE。水层的pH用10M NaOH溶液从3调至10。将所述混合物转至分液漏斗且所述相能分开。然后，水层用100mL MTBE提取3次(nb:重复直到水层中不存在产物)。合并来自3次提取的MTBE相并用旋转蒸发仪蒸发至干。粗产物在真空下进一步干燥48小时。
实施例10：在30mL规模中将化合物(IA)转化成化合物(IIA)的过程
152.48g异丙胺盐酸盐和0.204g磷酸吡哆醛一水合物在搅拌下溶于495ml水。在15分钟内向此黄色澄清溶液加入溶于85ml聚乙二醇(平均分子量200)的30.0g酮溶液。加入后，酮作为在反应介质中均匀分布的细粒沉淀。向此悬液加入180ml三乙醇胺缓冲液(0.1mol/l、pH7)且通过加入氢氧化钠溶液(1mol/l)调整pH至7。所述反应混合物加热到50℃并加入溶于162ml乙醇胺缓冲液(0.1mol/l、pH7)的1.62g转氨酶SEQ ID NO:134溶液。通过加入1mol/l氢氧化钠水溶液使反应混合物持续保持在pH7。所述反应混合物在50℃搅拌24小时且氮流在该反应混和物表面吹过以去除形成的丙酮。然后，所述反应混合物冷却到25℃并在纤维素束床上过滤。通过加入浓缩硫酸调整pH到≈1。酸化滤液用250ml乙酸异丙酯提取。分开所述层并通过加入浓缩氢氧化钠水溶液调整水相的pH到≈10。用乙酸异丙酯提取碱化水相。分开所述层并用100ml水洗涤有机相。有机相通过蒸馏到其2/3原体积来浓缩。第二反应器中，33.98g(+)-樟脑磺酸在回流后溶于225ml乙酸异丙酯，在10分钟内加入浓缩有机相。完全加入后，所形成的稀悬液在2小时内冷却到0℃并在0℃保持15消失。过滤所沉淀的胺-(+)-樟脑磺酸盐，用70ml乙酸异丙酯洗涤并在40℃真空干燥，产生51.57g无色晶体(84.5％产率t.q.)。
分析数据
IR:
(cm-1)＝3296,3061,2962,2635,2531,2078,1741,1625,1577,1518,1461,1415,1392,1375,1324,1302,1280,1256,1226,1170,1126,1096,1041,988,966,937,868,834,814,790,766,746,719,669,615.
LC-MS(ESI+):
氨离子:m/z＝227([M+H]),268([M+H+CH3CN]),453([2M+H]).
樟脑烷磺酸离子:m/z＝250([M+NH4]),482([2M+NH4]).
LC-MS(ESI-):
樟脑烷磺酸离子:m/z＝231([M-H]),463([2M-H]).
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz):
11.22(br.s.,1H),7.75(br.s.,3H),7.59(d,J＝10.3Hz,1H),7.54(d,J＝6.5Hz,1H),7.36(d,J＝2.3Hz,1H),3.37-3.50(m,1H),2.98(dd,J＝14.3,5.8Hz,1H),2.91(d,J＝14.8Hz,1H),2.81(dd,J＝14.3,8.0Hz,1H),2.63-2.74(m,1H),2.41(d,J＝14.6Hz,1H),2.24(dt,J＝18.3,3.8Hz,1H),1.94(t,J＝4.4Hz,1H),1.86(dt,J＝7.4,3.6Hz,1H),1.80(d,J＝18.1Hz,1H),1.23-1.35(m,2H),1.15(d,J＝6.3Hz,3H),1.05(s,3H),0.74(s,3H)
游离胺(碱化水层提取后通过蒸发乙酸异丙酯层来获得)：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):
11.04(br.s.,1H),7.50(d,J＝10.5Hz,1H),7.48(d,J＝6.5Hz,1H),7.25(s,1H),3.03(sxt,J＝6.3Hz,1H),2.61(dd,J＝14.3,6.5Hz,1H),2.57(dd,J＝14.1,6.5Hz,1H),1.36(br.s.,2H),0.96(d,J＝6.3Hz,3H)
实施例11：化合物(IIA)转化成化合物(IVB)的过程
13.62g5-氯靛红悬于35ml异丙醇并加入2.3g三乙胺。所述悬液加热回流，在50分钟内加入溶于300ml异丙醇的34.42g胺-(+)-樟脑磺酸盐溶液。所述反应混合物在回流下搅拌17小时。所述反应混合物冷却到75℃并向该反应混合物加入17.4g(+)-樟脑磺酸。约300ml异丙醇通过真空蒸馏移除。蒸馏掉的异丙醇由乙酸异丙酯取代且继续真空蒸馏。再次重复此蒸馏。向此蒸馏剩余物加入19ml乙醇和265ml乙酸乙酯，所述混合物加热回流。所述混合物斜降到0℃且在0℃保持24小时。滤掉米黄到米白色晶体，用3部分(各25ml)预冷(0℃)乙酸乙酯洗涤并真空干燥，产生40.3g米黄到米白色晶体(86.3％产率t.q.)。
IR:
(cm-1)＝3229,3115,3078,3052,2971,2890,2841,2772,2722,2675,2605,2434,1741,1718,1621,1606,1483,1460,1408,1391,1372,1336,1307,1277,1267,1238,1202,1184,1162,1149,1128,1067,1036,987,973,939,919,896,871,857,843,785,771,756,717,690,678,613.
LC-MS(ESI+):
铵离子:m/z＝390([M+H]),431([M+H+CH3CN])
樟脑磺酸盐离子:m/z＝250([M+NH4]),482([2M+NH4])
LC-MS(ESI-):
樟脑磺酸盐离子:m/z＝231([M-H]),463([2M-H])
1H NMR(DMSO-d6,600MHz):
11.49(s,1H),11.23(s,1H),10.29-10.83(m,1H),9.78-10.31(m,1H),7.55-7.60(m,2H),7.52(s,1H),7.40(d,J＝6.2Hz,1H),7.16(d,J＝8.8Hz,1H),4.52-4.63(m,1H),3.20(dd,J＝16.3,4.2Hz,1H),2.96(dd,J＝16.1,11.3Hz,1H),2.90(d,J＝15.0Hz,1H),2.56-2.63(m,1H),2.39(d,J＝14.6Hz,1H),2.21(dt,J＝18.0,3.8Hz,1H),1.89-1.93(m,1H),1.81(ddd,J＝15.3,7.8,3.7Hz,1H),1.76(d,J＝18.3Hz,1H),1.53(d,J＝6.6Hz,3H),1.20-1.33(m,2H),0.98(s,3H),0.70(s,3H)
实施例12：制备式(IVA)化合物1/2水合物的过程
在有叶轮搅拌器的750ml反应器中，50g化合物(IVB)盐溶于300ml乙醇(ALABD)和100ml去离子水。所述澄清、淡黄色溶液加热到58℃内部温度。在10分钟内向该溶液加入85g10％碳酸钠水溶液。所述澄清溶液经粒子过滤到第二反应容器中。容器和粒子过滤器各用25ml乙醇:水(3:1v/v)混合物在第二反应容器中冲洗。所合并的粒子过滤溶液加热到58℃内部温度且200ml水(WEM)在15分钟内逐滴加入。加入结束时，所述溶液变得浑浊。所述混合物在58℃内部温度搅拌10分钟且随后在4小时30分钟内缓慢冷却至室温，形成可良好搅拌的白色浓悬液。向所述悬液加入200ml水且所述混合物室温再搅拌15小时20分钟。过滤该悬液，滤饼用25ml部分的乙醇:水9:1(v/v)混合物洗2次。所述无色晶体在60℃真空干燥，产生26.23g(＝91.2％产率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)
10.70(s,1H),10.52(s,1H),7.44(d,J＝10.0Hz,1H),7.33(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),7.26(d,J＝6.5Hz,1H),7.05(d,J＝2.3Hz,1H),6.93(d,J＝8.3Hz,1H),3.83-4.00(m,1H),3.13(d,J＝6.0Hz,1H),2.77(dd,J＝15.1,3.8Hz,1H),2.38(dd,J＝15.1,10.5Hz,1H),1.17(d,J＝6.3Hz,3H)。

Claims (40)

1.一种制备式(II)化合物、或者其盐或溶剂合物或水合物的方法，
所述方法包括使式(I)化合物转化成(II)化合物或其盐、溶剂合物或水合物，
其中：
虚线是键或缺失；
A选自C＝O和C＝NH；或当虚线是双键时，A-R8是：
Ra是C1-6烷基；
R1是H、-CH3、
R4和R7各自独立是H或-Cl；
R5是H、-OH、-CH3、-OCH3、-F、-Cl、-CF3或-CN；
R6是H、-OH、-OCH3、-F或-Cl；
R8是H、-CH3、-CH2CH3、-CH2OH、-CO2H、-CO2CH3、-CO2CH2CH3或-CF3；和
n是1或2。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氟。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氟和氯。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氢。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当n是1且R6是氢时，R5是氟。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，式(II)化合物具有式(IIA)、或其盐或溶剂合物或水合物，
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述式(II)化合物在选自以下的条件下转化自式(I)化合物：酶促转氨、化学不对称催化、不对称还原和手性拆分、或2种或更多种条件的组合。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，A是C＝O。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述式(I)化合物是式(IA)化合物或者其盐或水合物溶剂合物，
10.一种制备式(IIA)化合物或者其盐或水合物或溶剂合物的方法，
所述方法包括使式(IA)化合物或者其盐或溶剂合物或水合物发生酶促转氨，
以提供式(IIA)化合物。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述酶是SEQ IDNO:134。
12.一种制备式(IV)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物的方法，
所述方法包括
使式(III)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物
与式(II)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物反应，
其中式(II)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物制备自式(I)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物，
其中：
虚线是键或缺失；
A选自C＝O和C＝NH；或当虚线是双键时，A-R8是：
Ra是C1-6烷基；
R1是(C1-C6)烷基，可选取代有氨基、(C1-C6)烷基氨基、(C1-C6)烷基二烷基氨基或(C1-C6)烷基C(O)NH(C1-6)烷基；
R4和R7各自独立是H或卤素；
R5和R6各自独立是氢、卤素、羟基、(C1-C6)烷基、三卤(C1)烷基、氰基或(C1-C6)烷氧基；
R8是(C1-C6)烷基，可选取代有羟基；
n是1或2；
R1’是氢或(C1-C6)烷基；和
R4’、R5’、R6’和R7’各自独立是氢、卤素、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、(C1-C6)烷基和(C1-C6)烷氧基。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氟。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氟和氯。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氢。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，当n是1且R6是氢时，R5是氟。
17.如权利要求12所述的方法，其特征在于，R1是H、-CH3、，
R4和R7各自独立是H或-Cl；R5是H、-OH、-CH3、-OCH3、-F、-Cl、-CF3或-CN；R6是H、-OH、-OCH3、-F或-Cl；
R8是H、-CH3、-CH2CH3、-CH2OH、-CO2H、-CO2CH3、-CO2CH2CH3或-CF3；和
n是1或2。
18.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述式(II)化合物具有式(IIA)、或者其盐或溶剂合物或水合物，
19.如权利要求12所述的方法，其特征在于，R5’是卤素。
20.如权利要求12所述的方法，其特征在于，R5’是氯且R1’、R4’、R6’和R7’各是氢。
21.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述式(III)化合物具有式(IIIA)、或者其盐或水合物或溶剂合物，
22.一种制备式(IVA)化合物、或者其盐或溶剂合物或水合物的方法，
所述方法包括
使式(IIIA)化合物或者其盐或溶剂合物或水合物
与式(II)化合物或者其盐或溶剂合物或水合物反应，
以提供式(IVA)化合物、或者其盐或溶剂合物或水合物，
其中式(IIA)化合物制备自式(IA)化合物、或者其盐或水合物或溶剂合物，
23.如前述权利要求12-22中任一项所述的方法，其特征在于，所述酶是SEQ ID NO:134。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述式(IIA)化合物转化成式(IIB)的盐：
然后与式(IIIA)化合物反应。
25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述反应在碱性条件下完成。
26.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述反应在三乙胺存在下完成。
27.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述式(IVA)化合物作为式(IVB)的盐分离：
28.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述式(IVB)的盐转化成游离碱形式的式(IVA)化合物。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述转化用碳酸钠完成。
30.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述式(IVA)化合物是水合物。
31.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述式(IVA)化合物是1/2水合物。
32.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述式(IVA)化合物在分离后磨碎。
33.一种式(IC)化合物：
其中：
R1是(C1-C6)烷基，可选取代有氨基、(C1-C6)烷基氨基、(C1-C6)烷基二烷基氨基或(C1-C6)烷基C(O)NH(C1-6)烷基；
R5和R6各自独立是氢、卤素、羟基、(C1-C6)烷基、三卤(C1)烷基、氰基或(C1-C6)烷氧基；
R8是(C1-C6)烷基，可选取代有羟基；
n是1或2；
或其药学上可接受盐或水合物或溶剂合物。
34.如权利要求33所述的化合物，其特征在于，当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氟。
35.如权利要求33所述的化合物，其特征在于，当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氟和氯。
36.如权利要求33所述的化合物，其特征在于，当R8是-CH3且n是1时，R5和R6是氢。
37.如权利要求33所述的化合物，其特征在于，当n是1且R6是氢时，R5是氟。
38.如权利要求33所述的化合物，其特征在于，R1是H、-CH3、，
R5是H、-OH、-CH3、-OCH3、-F、-Cl、-CF3或–CN；
R6is H、-OH、-OCH3、-F或–Cl；
R8是H、-CH3、-CH2CH3、-CH2OH、-CO2H、-CO2CH3、-CO2CH2CH3或-CF3；和
n是1或2。
39.如权利要求33所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有式(IA)：
或其药学上可接受盐或水合物或溶剂合物。
40.一种化合物，所述化合物选自：
其药学上可接受盐、溶剂合物或水合物。
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