CN104181122A - 利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，通过将待测粮食样品研磨后压片得到的待测粮食压片样品，直接采用太赫兹时域光谱系统对其进行测试，得到太赫兹区域光谱信号作为样品信号，在同样条件下采集氮气氛围下的太赫兹时域光谱信号作为参考信号，进而得到所述待测粮食压片样品的吸收系数谱，获得所述目标农药的特征波段，最后将所述待测粮食压片样品的吸收系数谱划分为校正集样本吸收系数谱和验证集样本吸收系数谱，用偏最小二乘回归法方法建立定量分析模型，获得各所述待测粮食样品的定量检测值，本发明所述方法能够真实、有效地实现对粮食中农药残留进行快速准确的定量检测，所述定量分析模型的预测平方相关系数(R²)高达0.9903。

Description

利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法

技术领域

本发明涉及一种利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，属于农药检测技术领域。

背景技术

随着现代农业的快速发展，农业及农产品对农药的需求和依赖日益增长。加之一些从业人员缺乏农药知识，长期大量使用农药甚至滥用，使得农药对环境和人类健康造成了极大的影响和危害。对于农作物而言，农药施用到农作物之后，农作物内往往会有少量残留，长时间摄食残留农药会严重影响人体健康，亦会对身体和生态环境造成重大危害。特别是近年来，食物中农药残留超标而引起的致畸致残及中毒事件等也越来越受到关注，农药痕迹残留及其代谢物在土壤、水及农产品中均有发现。因而，在大力倡导科学使用农药的前提下，如何快速、准确的检测农药引起的食品、环境的污染等问题就显得极为重要和迫切。

世界各国对农产品及食品中农药最大残留量均有相应检测方法和标准，现有的农药检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱与质谱联用技术、液相色谱与质谱联用技术、免疫法、生物传感器法等，但上述方法均存在着样品前处理复杂，检测时间长，检测成本高，对检测人员要求较高，无法在线检测等不足。

太赫兹辐射(也称“THz辐射”)是指频率在0.1THz-10THz，波长在0.03-3mm之间的电磁波，其波段位于微波和红外线之间，是宏观电子学向微观光子学过渡的区域，在电磁波频谱中占有很特殊的位置。许多极性大分子在振动能级间的跃迁正好处于太赫兹频率范围，因此，生物分子的太赫兹光谱可以反映由分子内或分子间集体振动和晶格振动引起的低频振动膜的本征特性。太赫兹电磁波具有较低的光子能量，在进行样品检测时，不会产生有害的光致电离，是一种有效的无损探测方法。太赫兹光谱技术可作为近红外光谱技术的有益补充用于药品检测领域。

中国专利文献CN103472032A公开了一种利用太赫兹时域光谱技术检测盐酸四环素的方法，其包括如下步骤：(1)将盐酸四环素粉末与高密度聚乙烯粉末以不同比例混合研磨，用压片机一一压成圆盘形薄片，得到含有不同质量百分比的盐酸四环素压片；(2)在0.1-3.5THz频段范围内，用太赫兹时域光谱系统一一采集不同质量百分比的盐酸四环素压片的太赫兹时域光谱；(3)以氮气的时域波形作为参考信号，以盐酸四环素压片的时域波形作为样品信号，分别进行傅里叶变换，得到两种信号的频域分布，利用公式得到压片样本的吸收系数和折射率；(4)根据各个压片样本的质量百分比及其对应的吸收谱建立校正模型，进行校正模型的验证与评价。上述方法虽然能够实现对食品中抗生素盐酸四环素进行定性和定量检测，但是在样品制备过程中，是将待检测的抗生素盐酸四环素和高密度聚乙烯粉末混合压片样品，利用聚乙烯为“背景”检测抗生素的含量，因而该方法最终检测的是存在于聚乙烯中抗生素的含量的相对数值，这就导致与实际的检测样本相差甚远，影响了检测样本的真实性；此外，引入新的无关物质聚乙烯，不可避免将会对样本检测的准确度造成影响，同时还浪费了药品。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用太赫兹时域光谱技术实现直接对粮食中农药残留进行定量检测的方法。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，其包括如下步骤：

(1)取待测粮食样品研磨后压片，即得待测粮食压片样品；

(2)利用太赫兹时域光谱系统，采用透射测量模式采集其氮气氛围下的太赫兹时域光谱信号作为参考信号E_ref(t)，并在相同条件下采集所述待测粮食压片样品的太赫兹时域光谱信号作为样品信号E_sam(t)，将参考信号E_ref(t)和样品信号E_sam(t)分别经过傅里叶变换后得到参考的频域信号E_ref(ω)和样品的频域信号E_sam(ω)，将参考的频域信号E_ref(ω)和样品的频域信号E_sam(ω)的比值定义为函数H(ω)，见式(1)，基于函数H(ω)，可以进一步计算出样品的折射率n(ω)和吸收系数谱α(ω)，并选择所述吸收系数谱的重现性较好的波段区间作为所述目标农药的特征波段：

$\mathrm{\α}\left(\mathrm{\ω}\right)=\frac{2\mathrm{\ωk}\left(\mathrm{\ω}\right)}{c}=\frac{2}{d}\ln \left[\frac{4n\left(\mathrm{\ω}\right)}{\mathrm{\ρ}\left(\mathrm{\ω}\right){(n\left(\mathrm{\ω}\right)+1)}^2}\right]---\left(3\right)$

式中n＇为待测粮食压片样品的复折射率，k(ω)为每个频率下的消光系数，d为待测粮食压片样品的厚度，ω为频率，ρ(ω)为振幅，表示相位，c表示真空中光的传播速度。

(3)在选定的所述特征波段内，将所述待测粮食压片样品的吸收系数谱划分为校正集样本吸收系数谱和验证集样本吸收系数谱；

(4)利用偏最小二乘回归法建立所述校正集样本吸收系数谱和所述验证集样本吸收系数谱的定量分析模型，获得各所述待测粮食样品的定量检测值。

所述农药为硝基亚甲基类农药。

所述的硝基亚甲基类农药为吡虫啉。

所述特征波段为0.3-1.7THz。

所述步骤(2)中，所述太赫兹时域光谱的测试条件是：温度为20℃，频率范围为0.3-3.0THz。

所述步骤(3)中，所述校正集样本和所述验证集样本吸收系数谱的划分采用自助拉丁配分法进行。

利用所述自助拉丁配分法进行划分时选择配分数为4，取其中3/4作为校正集样本，1/4作为验证集样本。

所述待测粮食压片样品为直径13mm、厚度约1.0mm的圆薄片。

所述步骤(4)中，采用交叉验证法确定偏最小二乘回归的主因子数。

所述步骤(4)中，采用测试集的均方误差MSEV和平方相关系数R²评价所建立模型的预测性能，所述MSEV和R²的计算公式如下：

$\mathrm{MSE}=\frac{1}{n}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(f\left(x_i\right)-y_i)}^2$

$R^2=\frac{{(n{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{n}f\left(x_i\right)y_i-{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{n}f\left(x_i\right){\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{y}_i)}^2}{(n{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{n}f{\left(x_i\right)}^2-{\left({\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{n}f\left(x_i\right)\right)}^2)(n{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{y}_i^2-{\left({\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{y}_i\right)}^2)}.$

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明所述的利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，通过将待测粮食样品研磨后压片得到的待测粮食压片样品，直接采用太赫兹时域光谱系统在透射测量模式、氮气氛围下对其进行测试，得到太赫兹时域光谱信号作为样品信号，在同样条件下采集氮气氛围下的太赫兹时域光谱信号作为参考信号，进而得到所述待测粮食压片样品的吸收系数谱，获得所述目标农药的特征波段，最后将所述待测粮食压片样品的吸收系数谱划分为校正集样本吸收系数谱和验证集样本吸收系数谱，用偏最小二乘回归法方法建立定量分析模型，获得各所述待测粮食样品的定量检测值，较之现有技术中已公开的利用太赫兹光谱检测农药残留的方式而言，本发明所述方法用于检测的样品中不需掺入其他任何物质，样品制备简单，不需进行任何预处理，能够真实、有效地实现对粮食中农药残留进行快速准确的定量检测，所述定量分析模型的预测均方误差较小，平方相关系数(R²)高达0.9903。

(2)本发明所述的利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，在采用偏最小二乘法建立校正模型之前，采用拉丁配分法对所述的吸收系数谱划分成校正集和验证集，可以准确评价定量校正模型预测能力和稳定性；这里所述的拉丁配分法是一种建立在交叉验证和随机抽样验证基础上的模型性能验证方法。拉丁配分法可以实现均匀的随机抽样验证，每配分一次，每一个样品作为且仅作为一次验证集；当配分数为4时，每个样品用于且仅用于一次验证集，而三次作为校正集，分别建立四次模型，确保了每个样品在校正集和验证集中以同样的比例出现，从而实现对所建模型预测能力的无偏评价，使定量校正模型更可靠，分析结果更具有统计学意义。

(3)本发明所述的利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，在所述步骤(4)中，对所述校正集样本吸收系数谱和所述验证集样本吸收系数谱采用偏最小二乘回归法建立定量分析模型，并采用留一法作为交叉验证方法确定偏最小二乘回归的主因子数，从而每一回合中几乎所有的样本都用于训练模型,与原始样本的分布最为接近,分析结果准确性高；由于实验过程中不存在任何影响实验数据的随机因素,实验过程可被复制；并且在最佳主因子数的条件下建立偏最小二乘回归模型，能够最大程度地保留原始光谱数据中的有用信息，同时又尽可能少地引入测量噪声。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1是本发明方法测定吡虫啉-聚乙烯的太赫兹吸收系数谱；

图2是本发明实施例1所述的部分待测粮食样品在0.3-1.7THz特征波段区间的吸收系数谱；

图3是本发明方法中所述留一法交叉验证的均方根误差和PLS主因子数的关系图；

图4是本发明所述模型预测浓度与实际浓度之间的关系图。

具体实施方式

实施例

本实施例提供一种利用太赫兹时域光谱技术定量检测大米样品中吡虫啉含量，其中，所述待测“大米样品”采用本身不含有任何农药残留的大米(河北省张家口市检验检疫局提供)添加已知量吡虫啉(北京北纳创联生物技术研究院提供)后制备得到，并将所述待测“大米样品”作为盲样采用本发明方法进行检测，具体步骤如下：

(1)将所述大米放入粉碎机中粉碎，研磨后过筛(100目，粒径≤150μm)，放入烘箱中烘干，得到大米粉末；将大米粉末与吡虫啉粉末按照不同质量比例混合，转移至玛瑙研钵中进一步研磨得到所述待测“大米样品”细粉，其中，所述待测“大米样品”中吡虫啉质量百分含量依次为0％,0.99％,1.5％,1.97％,2.50％,3.00％,3.50％,4.00％,4.50％,5.01％,5.50％,5.91％,6.51％,7.00％,7.50％,8.00％,8.51％,9.00％,9.50％,10.00％,11.99％,14.02％,15.01％；

称取上述每种所述“大米样品”细粉约170mg，置于Specac公司的模具中，用压片机在5t的压力下保持3-4min，从而将所述“大米样品”细粉压制成直径13mm、厚度约1.0mm的圆薄片,即得含有不同质量百分比吡虫啉的待测粮食压片样品，所述待测粮食压片样品两表面平行、表面光滑且没有裂缝。

(2)应用基于光电导天线的透射型太赫兹时域光谱系统，以及T-spectroscopy信号采集软件，采用美国Newport集团旗下Spectra-Physics(光谱-物理)品牌的Mai Tai型飞秒激光振荡器作为外置激光源，激光脉冲中心波长800nm，输出功率＞500mW，在20℃条件下，太赫兹频率范围为0.3-3.0THz，以氮气作为参考，采用透射测量模式，采集所述待测粮食压片样品的太赫兹时域光谱信号作为样品信号E_sam(t)，并在采集每个压片样品的太赫兹区域的时域光谱数据之前，先采集没有放置压片样品的氮气氛围下的太赫兹区域的时域光谱信号作为参考信号E_ref(t)；将参考信号Eref(t)和样品信号E_sam(t)分别经过快速傅里叶变换后得到参考的频域信号E_ref(ω)和样品的频域信号E_sam(ω)，将参考的频域信号E_ref(ω)和样品的频域信号E_sam(ω)的比值定义为函数H(ω)，见式(1)，基于函数H(ω)，可以进一步推算出样品的折射率n(ω)和吸收系数谱α(ω)，见式(2)和式(3)：

$\mathrm{\α}\left(\mathrm{\ω}\right)=\frac{2\mathrm{\ωk}\left(\mathrm{\ω}\right)}{c}=\frac{2}{d}\ln \left[\frac{4n\left(\mathrm{\ω}\right)}{\mathrm{\ρ}\left(\mathrm{\ω}\right){(n\left(\mathrm{\ω}\right)+1)}^2}\right]---\left(3\right)$

式中n＇为待测粮食压片样品的复折射率，k(ω)为每个频率下的消光系数，d为待测粮食压片样品的厚度，ω为频率，ρ(ω)为振幅，表示相位，c表示真空中光的传播速度。

在进行上述数据采集时，每个所述待测粮食压片样品的样品光谱在相同环境下重复采集3次，最后取3次的平均值作为后续处理所用的吸收系数谱数据，最终得到23组吸收系数谱数据。

如图1所示为采用本发明方法测定吡虫啉-聚乙烯的太赫兹吸收系数谱，可以看出，在0.3-1.7THz的频段内，农药吡虫啉位于频率0.89THz、1.13THz、1.26THz、1.50THz处存在4个特征吸收，因此，选择所述吸收系数谱的重现性较好的波段区间0.3-1.7THz作为所述目标农药的特征波段。

如图2所示为其中6个不同吡虫啉质量百分含量的所述待测粮食样品在0.3-1.7THz特征波段区间的吸收系数谱，6个不同吡虫啉质量百分含量分别为0.00％，3.00％，5.01％,7.00％,10.00％,15.01％；此外，从图2可以看出，在吡虫啉质量分数为0.00％-15.01％的范围内，吡虫啉的特征吸收系数与吡虫啉的质量分数成正比例变化，从而检测吡虫啉的特征频段内的吸收系数谱能够用于粮食中农药吡虫啉的定量分析。

(3)在选定的所述待测粮食压片样品的特征波段内，将所述待测粮食压片样品的吸收系数谱，上述23组吸收系数谱数据，采用自助拉丁配分法划分为校正集样本吸收系数谱和测试集样本吸收系数谱，选择配分数为4，取其中3/4作为校正集样本，1/4作为测试集样本，具体为：首先将待测样本分为4份，选择其中1份作为测试集样本，其余3份作为校正集样本，需要说明的是，在每次计算中，每个样本仅用于一次预测验证。

(4)利用校正集数据集，结合偏最小二乘回归建立定量校正模型，采用留一法交叉验证，确定偏最小二乘回归的主因子数，由图3可知，当主因子为8时，交叉验证的均方根误差最小，RMSECV＝0.00387(MSECV＝1.4977×10^-5),因此建立定量校正模型时采用8个主因子。所述偏最小二乘回归的具体原理如下：

偏最小二乘回归首先对样品的太赫兹吸收系数谱矩阵X和浓度矩阵Y进行分解，其模型表达如下：

$Y={\mathrm{UQ}}^T+E_Y=\underset{i=1}{\overset{k}{\mathrm{\Σ}}}{u}_k{q}_K^T+E_Y$

$X={\mathrm{TP}}^T+E_X=\underset{i=1}{\overset{k}{\mathrm{\Σ}}}{t}_k{p}_k^T+E_X$

上述表达式中，t_k(n×1)为吸收系数矩阵X的第i个主因子的得分；p_k(1×m)为吸收系数矩阵X的第i个主因子的载荷；u_k(n×1)是浓度矩阵Y的第i个主因子的得分，q_k(1×p)是浓度矩阵Y的第i个主因子的载荷；k为主因子数。T和U分别是X和Y矩阵的得分矩阵，P和Q分别是X和Y矩阵的载荷矩阵，Ex和E_Y则分别是X和Y矩阵的PLS拟合残差矩阵。

之后将T和U两个得分矩阵T和U做线性回归：

U＝TB

B＝(T^TT)^-1T^TY

最后在进行预测时，首先根据吸收系数矩阵X的载荷矩阵P求出未知样品吸收系数矩阵X＇的得分矩阵T＇，然后可以由下式得到未知样品的浓度预测矩阵Y＇：

Y＇＝T＇BQ

由此可以得到浓度预测矩阵Y＇内的未知样品的浓度预测值y＇；

(5)利用测试集数据集，在最佳主因子数下，验证所建立的偏最小二次定量校正模型的预测性能，不同样品的实际浓度与预测浓度的对比结果如表1所示，结果表明：在0-15％的吡虫啉质量分数范围内，偏最小二乘模型的预测均方误差为MSEV＝1.53356×10^-5，平方相关系数R²＝0.9903。所述MSEV和R²的计算公式如下：

$\mathrm{MSE}=\frac{1}{n}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(f\left(x_i\right)-y_i)}^2$

$R^2=\frac{{(n{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{n}f\left(x_i\right)y_i-{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{n}f\left(x_i\right){\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{y}_i)}^2}{(n{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{n}f{\left(x_i\right)}^2-{\left({\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{n}f\left(x_i\right)\right)}^2)(n{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{y}_i^2-{\left({\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{y}_i\right)}^2)}.$

如图4所示为所述模型预测浓度与实际浓度之间的关系图，可以清楚看出所述模型预测浓度和实际浓度之间的相关性令人满意。

表1-不同样品实际浓度值与预测浓度值

由此可见，上述分析模型预测的MSEV较小，R²高达0.9903，从而说明本发明方法建立的模型可靠可行，可以用来对大米样品中农药吡虫啉进行定量检测。

采用上述描述的方法，不仅可以对大米中的吡虫啉进行定量检测，也可以推广到其它种类的粮食样品和其它农药的检测。在其它种类粮食的样品的检测中，亦需将样品制备成粉末压片。而适于检测的目标农药只要在太赫兹频段内具有特征吸收即可用本发明所述方法实现检测。本发明所述检测方法可准确、简便的对粮食中的农药成分进行检测，已得到国家自然科学基金(21275101)和国家重大科学仪器专项(2012YQ140005)的大力资助。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取待测粮食样品研磨后压片，即得待测粮食压片样品；

(2)利用太赫兹时域光谱系统，采用透射测量模式采集其氮气氛围下的太赫兹时域光谱信号作为参考信号E_ref(t)，并在相同条件下采集所述待测粮食压片样品的太赫兹时域光谱信号作为样品信号E_sam(t)，将参考信号E_ref(t)和样品信号E_sam(t)分别经过傅里叶变换后得到参考的频域信号E_ref(ω)和样品的频域信号E_sam(ω)，将参考的频域信号E_ref(ω)和样品的频域信号E_sam(ω)的比值定义为函数H(ω)，基于函数H(ω)，计算出样品的折射率n(ω)和吸收系数谱α(ω)，并根据目标农药的性质选择所述吸收系数谱的重现性较好的波段区间作为所述目标农药的特征波段：

$\mathrm{\α}\left(\mathrm{\ω}\right)=\frac{2\mathrm{\ωk}\left(\mathrm{\ω}\right)}{c}=\frac{2}{d}\ln \left[\frac{4n\left(\mathrm{\ω}\right)}{\mathrm{\ρ}\left(\mathrm{\ω}\right){(n\left(\mathrm{\ω}\right)+1)}^2}\right]---\left(3\right)$

上述式(1)-(3)中，n＇为待测粮食压片样品的复折射率，k(ω)为每个频率下的消光系数，d为待测粮食压片样品的厚度，ω为频率，ρ(ω)为振幅，表示相位，c表示真空中光的传播速度；

(3)在选定的所述特征波段内，将所述待测粮食压片样品的吸收系数谱划分为校正集样本吸收系数谱和验证集样本吸收系数谱；

(4)利用偏最小二乘回归法建立所述校正集样本吸收系数谱和所述验证集样本吸收系数谱的定量分析模型，获得各所述待测粮食样品的定量检测值。

2.根据权利要求1所述的利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，其特征在于，所述农药为硝基亚甲基类农药。

3.根据权利要求2所述的利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，其特征在于，所述的硝基亚甲基类农药为吡虫啉。

4.根据权利要求3所述的利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述特征波段为0.3-1.7THz。

5.根据权利要求1-4任一所述的利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述太赫兹时域光谱的测试条件是：温度为20℃，频率范围为0.3-3.0THz。

6.根据权利要求1-5任一所述的利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述校正集样本和所述验证集样本吸收系数谱的划分采用自助拉丁配分法进行。

7.根据权利要求1-6任一所述的利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，其特征在于，利用所述自助拉丁配分法进行划分时选择配分数为4，取其中3/4作为校正集样本，1/4作为验证集样本。

8.根据权利要求1-7任一所述的利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，其特征在于，所述待测粮食压片样品为直径13mm、厚度约1.0mm的圆薄片。

9.根据权利要求1-8任一所述的利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，采用交叉验证法确定偏最小二乘回归的主因子数。

10.根据权利要求1-9任一所述的利用太赫兹时域光谱技术检测粮食中农药含量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，采用测试集的均方误差MSEV和平方相关系数R²评价所建立模型的预测性能准确性，所述MSEV和R²的计算公式如下：

$\mathrm{MSE}=\frac{1}{n}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(f\left(x_i\right)-y_i)}^2$

$R^2=\frac{{(n{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{n}f\left(x_i\right)y_i-{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{n}f\left(x_i\right){\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{y}_i)}^2}{(n{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{n}f{\left(x_i\right)}^2-{\left({\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{n}f\left(x_i\right)\right)}^2)(n{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{y}_i^2-{\left({\mathrm{\Σ}}_{i=1}^n{y}_i\right)}^2)}.$