CN104178465B - 一种从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法，将以牛肝脏为原料制备而来的谷氨酸脱氢酶粗提液，采用超滤浓缩和凝胶层析技术进行谷氨酸脱氢酶的提取纯化，取代了利用大量有机溶剂或无机盐溶液等进行提取的复杂工艺，一方面使提取工艺更加简单易操作，大大降低了生产成本，另一方面将超滤浓缩产生的透过液重复回收利用，将每千克原料的水耗降低到2.0千克以下，避免了废水的排放，是一种环境友好型生产工艺。另外，在捣碎过程中采用并补充预冷的磷酸盐缓冲液，使捣碎过程始终处于低温下进行，保证了谷氨酸脱氢酶的活性，所得谷氨酸脱氢酶酶活达到9000U/mg以上，产率达到21％以上。

Description

一种从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法。
背景技术
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase.GDH)是参与谷氨酸新陈代谢的关键酶之一，它以NAD或NADP或者同时利用NAD和NADP作为辅酶，可逆的催化谷氨酸脱氨，使之形成Q.酮戊二酸和氨，从而参与到谷氨酸的合成与分解中，在生物体的碳、氮代谢中起着非常重要的作用。
尿素氦试剂盒主要用于临床上血清以及血浆中尿素氮含量的测定，以此作为对肝脏、肾脏疾病的鉴别、诊断以及疗效观察的指标。虽然尿素氮含量测定的方法有许多，但脲酶.谷氨酸脱氢酶偶联法以其独特的优势被广泛使用。该方法不需要特殊仪器，操作简单，还不受含氮化合物的干扰，准确度较高，适用于自动分析。
在许多的动物组织中，包括：脑、肝脏、肾脏、心脏、胰腺、卵巢以及淋巴结等，都发现有谷氨酸脱氢酶的存在。动物体内的谷氨酸脱氢酶在催化反应发生时既可以NAD作为辅酶，又可以NADP作为辅酶，但以NAD作为辅酶的催化效率要高出以NADP作为辅酶的效率的数倍。目前，已有从牛脑、鱼肝、牛肝、猪肝及鸭肝等组织中分离纯化谷氨酸脱氢酶的报道。
目前国内报道的得到谷氨酸脱氢酶的方法有两种：
一是发酵法生产，大连大学在申请号201210106727.9的专利中提到的一种方法方法是将产生的GDH的微生物进行6-10次活化，再经过微生物定向驯化4-6次，使其在24-30℃的环境下生长，然后按照常规方法经过一级和二级种子罐，按照发酵液的3-9％接种量接入发酵培养基中，在24-30℃中培养60-114小时得到含有谷氨酸脱氢酶的发酵液，然后经过发酵液的分离提取纯化得到谷氨酸脱氢酶。西藏金稞集团公司在申请号为201110449716.6的专利中，提出了一种由谷氨酸棒杆菌发酵、制备粗酶液、离子交换层析、疏水分离等一系列的工艺得到最后产品谷氨酸脱氢酶。这类发酵工艺的主要弊端就是发酵产率低、工艺长而且复杂，导致生产成本很高。而且这些工艺目前都处于起步研究阶段，稳定性和持续性很值得商榷。
二是从动物内脏中提取谷氨酸脱氢酶的工艺。
目前国内对从动物内脏中提取谷氨酸脱氢酶的工艺比较多，从工艺路线上来看大部分都大同小异，西藏金稞集团公司在申请号为201110422831.4的专利中提出了由动物内脏中提取谷氨酸脱氢酶的一种方法，大致工艺路线由动物内脏→绞碎→抽提→粗酶液→酸沉淀→硫酸铵盐析→磷酸钙凝胺吸附→离心→上清透析→冷冻、干燥→试剂制备→谷氨酸脱氢酶成品，经过这大量的步骤得到最后的产品谷氨酸脱氢酶。这类型工艺的典型问题就是工艺路线长，而且工艺复杂，要用到大量的无机盐沉淀，对环境造成不利影响的同时收率较低，而且生产过程中产生大量废水，造成水资源的极大浪费。朱鸿、李想韵等人在生物工程2010，VOL。31，NO.1中发表题目为鸭肝谷氨酸脱氢酶的纯化与酶学性质研究的文章，其中涉及的谷氨酸脱氢酶提取工艺路线为：丙酮干粉的制备→粗提液的制备→重金属离子沉淀→硫酸铵分级沉淀→DEAE-Sepharose离子交换层析→Sephacryl S-200凝胶过滤柱层析，这类型工艺中要用到大量的有机溶剂，且和上一类型的工艺有同样的缺点，工艺路线长，收率低，既不环保而且工艺复杂难于操作。
发明内容
本发明的目的是针对现有的谷氨酸脱氢酶提取工艺的不足，提供一种从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法，本发明以牛肝脏为原料制备谷氨酸脱氢酶粗提液，将所得粗提液采用超滤浓缩和凝胶层析技术进行谷氨酸脱氢酶的提取及纯化，取代利用大量有机溶剂提取、大量无机盐沉淀等对环境污染的方法，且将超滤浓缩得到的大量透过液进行重复利用，具有节能减排、经济环保且酶活损失小的优点，适合工业化生产的要求。
本发明的技术方案为：
一种从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法，其特征在于，
以牛肝脏为原料提取获得谷氨酸脱氢酶粗提液，将所得谷氨酸脱氢酶粗提液采用孔径为0.004-0.006μm的中空纤维滤膜，以30-50L/h的流速进行超滤浓缩，收集超滤截留液得到含有高浓度谷氨酸脱氢酶的谷氨酸脱氢酶浓缩液；
此外，还包括以下步骤：
步骤一、纯化，将所得谷氨酸脱氢酶浓缩液采用superdex-200凝胶进行凝胶过滤层析，用pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液对所述凝胶柱进行洗脱，流速为2.0-3.0L/h，收集层析洗脱液得到纯化的谷氨酸脱氢酶母液；
步骤二、冷冻干燥，将所得谷氨酸脱氢酶母液经过冷冻干燥，既得所述谷氨酸脱氢酶。
优选的是，所述的从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法中，所述谷氨酸脱氢酶粗提液的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将切碎的牛肝脏和预冷至5-10℃的磷酸缓冲液按照体积比1∶6-10混合后，进行捣碎20-30min，将捣碎后的物料于5-10℃搅拌3-5h，得到牛肝匀浆；
步骤二、将所得牛肝匀浆在5-20℃条件下进行真空压滤，收集过滤液既得所述谷氨酸脱氢酶粗提液。
优选的是，所述的从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法中，捣碎过程中所用磷酸缓冲液的pH值为6.5-7.5，且在捣碎过程中至少补充一次预冷至5-10℃的磷酸缓冲液，补充的磷酸缓冲液的量以磷酸缓冲液的总加入量低于牛肝脏与磷酸缓冲液的最大体积比为准。
优选的是，所述的从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法中，采用XTZL-Φ260/Φ200真空过滤机，孔径为0.4-0.6mm的棉纶滤布对牛肝匀浆进行真空压滤。
优选的是，所述的从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法中，将所述超滤浓缩得到的透过液进行收集，并调节所得透过液的pH值为6.5-7.5并预冷至5-10℃后，与切碎的牛肝脏混合后进行捣碎。
优选的是，所述的从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法中，在进行凝胶过滤层析之前用pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液对所述凝胶柱进行冲洗。
优选的是，所述的从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法中，步骤二中冷冻干燥温度为-55--60℃。
优选的是，所述的从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法中，所用磷酸缓冲液的浓度均为0.09-0.11mol/L。
本发明具有以下有益效果：首先，本发明将以牛肝脏为原料制备而来的谷氨酸脱氢酶粗提液，采用超滤浓缩和凝胶层析技术进行谷氨酸脱氢酶的提取纯化，取代了利用大量有机溶剂或无机盐溶液等进行提取的复杂工艺，一方面使提取工艺更加简单易操作，大大降低了生产成本，另一方面由于可将超滤浓缩产生的透过液重复回收利用，将每千克原料的水耗降低到2.0千克以下，避免了一般提取工艺中大量废水的排放，是一种环境友好型生产工艺，具有节能环保的优点。
其次，本发明在对牛肝脏的捣碎过程中采用预冷的磷酸盐缓冲液，并在捣碎过程中补充预冷的磷酸盐缓冲液，大幅度减少了在捣碎过程中由于机械摩擦升温导致的酶失活，使捣碎过程始终处于低温下进行，从而最大限度地保持了谷氨酸脱氢酶的活性，同时，由于提取过程中未采用有机溶剂及其他酸溶液进行沉淀，也避免了有机溶剂或酸溶液对谷氨酸脱氢酶造成一定的破坏，使本发明所述方法提取得到的谷氨酸脱氢酶酶活至少达到9000U/mg以上，甚至达到20000U/mg，产品回收率达到21％以上，均高于现有的从动物内脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法。
附图说明
图1为本发明所述的从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。
如图1所示，一种从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法，其中，
以牛肝脏为原料提取获得谷氨酸脱氢酶粗提液，将所得谷氨酸脱氢酶粗提液采用孔径为0.004-0.006μm的中空纤维滤膜为组件的超滤设备，本发明所采用滤膜为由吉林金赛提供的GP4012滤膜，孔径为0.005μm，并以30-50L/h的流速进行超滤浓缩，截留分子量10万以上的肽链，收集超滤截留液得到含有高浓度谷氨酸脱氢酶的谷氨酸脱氢酶浓缩液；而将超滤透过液回收到储蓄罐中，并利用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节透过液的pH值为6.5～7.5备用。在进行超滤浓缩之前先用纯净水对超滤设备进行冲洗，将超滤设备的管道及容器冲洗干净后再加入所述谷氨酸脱氢酶粗提液进行超滤浓缩。
此外，还包括以下步骤：
步骤一、纯化，将所得谷氨酸脱氢酶浓缩液采用superdex-200凝胶柱进行凝胶过滤层析，装柱后，在进行凝胶过滤层析之前用浓度为0.09-0.11mol/L，pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液对所述凝胶柱进行冲洗，上样后用浓度为0.09-0.11mol/L，pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液对凝胶柱进行洗脱，流速为2.0-3.0L/h，收集层析洗脱液得到纯化的谷氨酸脱氢酶母液；所用superdex-200是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶混合后的产品，是最新的分子筛材料，和SephacrylS-200相比，具有刚性好、流速快的特点，更加适用于谷氨酸脱氢酶浓缩液的纯化。
步骤二、冷冻干燥，将所得谷氨酸脱氢酶母液经过冷冻干燥，既得所述谷氨酸脱氢酶产品，冷冻干燥温度为-55--60℃，优选-60℃，所用冷冻干燥仪器为FD一27压盖型冷冻干燥机。
所述的从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法中，所述谷氨酸脱氢酶粗提液的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将新鲜牛肝脏用水洗净后切碎，将切碎的牛肝脏和预冷至5-10℃的pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液按照体积比1∶6-10混合后，用组织捣碎匀浆机进行捣碎20-30min，匀浆机转速为2000-3000r/min，将捣碎后的物料于5-10℃搅拌3-5h，得到牛肝匀浆，其中保持低温的方式通过将捣碎后的物料置于冷冻机中进行搅拌来实现。可在进行捣碎之前先按照体积比加入预冷至5-10℃的磷酸缓冲液，在捣碎过程中至少补充一次少量的预冷至5-10℃的磷酸缓冲液，用以使物料在捣碎过程中始终保持一个低温环境，有效避免温度升高对谷氨酸脱氢酶酶活的降低，补充的磷酸缓冲液的量以磷酸缓冲液的总加入量低于牛肝脏与磷酸缓冲液的最大体积比为准。另外，本发明中所用的磷酸缓冲液的浓度均优选0.1mol/L。
步骤二、将所得牛肝匀浆在5-20℃条件下进行真空压滤，由于过滤过程中具有一定的压力，在压力作用下有利于谷氨酸脱氢酶更充分地溶出，收集过滤液既得所述谷氨酸脱氢酶粗提液。本发明中采用XTZL-Φ260/Φ200真空过滤机，孔径为0.4-0.6mm的棉纶滤布对牛肝匀浆进行真空压滤。
所述的从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法中，将所述超滤浓缩得到的透过液进行收集，并调节所得透过液的pH值为6.5-7.5并预冷至5-10℃后，替代磷酸缓冲液与切碎的牛肝脏混合后进行捣碎，从而将超滤产生的大量透过液回收利用，实现提取工艺中的废水零排放。
实施例1
将新鲜牛肝50kg用自来水洗净，切碎，加入预冷至5℃的6倍体积的pH值为6.5的磷酸缓冲液中，用组织捣碎匀浆机捣碎20分钟，并在捣碎至10min时补充1倍体积的预冷至5℃的磷酸缓冲液，然后保持5℃下缓慢搅拌3.0小时，得到牛肝匀浆，将所得牛肝匀浆在保持温度10℃下用XTZL-Φ260/Φ200真空过滤机，孔径为0.5mm的棉纶滤布进行压滤分离，过滤液为谷氨酸脱氢酶粗提液。先用纯净水冲洗超滤设备，确定超滤设备的管道及容器冲洗干净后，将待进行超滤的料液装入超滤设备的原料槽，采用GP4012滤膜，以30L/h的流速进行超滤浓缩，截留分子量10万以上的母液既得所述谷氨酸脱氢酶浓缩液，而将透过液回收到储罐中，然后调节透过液的pH值为6.5作为提取剂重复使用。将所得谷氨酸脱氢酶浓缩液采用superdex-200凝胶进行凝胶过滤层析，装柱后，用浓度为0.1mol/L，pH值为6.5的磷酸缓冲液冲洗，上样后用浓度为0.1mol/L，pH值为6.5的磷酸缓冲液进行洗脱，流速为2.0L/h，收集洗脱液得到纯化的谷氨酸脱氢酶母液。将纯化后的谷氨酸脱氢酶母液用FD-27压盖型冷冻干燥机，在-60℃冷冻干燥，得到谷氨酸脱氢酶产品，酶活达到9000U/mg。
实例2.
将新鲜牛肝50kg用自来水洗净，切碎，加入预冷至10℃的8倍体积的pH值为7.2的磷酸缓冲液中，用组织捣碎匀浆机捣碎25分钟，并在捣碎至10min时补充1倍体积的预冷至10℃的磷酸缓冲液，然后保持10℃下缓慢搅拌4.0小时，得到牛肝匀浆，将所得牛肝匀浆在保持温度10℃下用XTZL-Φ260/Φ200真空过滤机，孔径为0.5mm的棉纶滤布进行压滤分离，过滤液为谷氨酸脱氢酶粗提液。先用纯净水冲洗超滤设备，确定超滤设备的管道及容器冲洗干净后，将待进行超滤的料液装入超滤设备的原料槽，采用GP4012滤膜，以30L/h的流速进行超滤浓缩，截留分子量10万以上的母液既得所述谷氨酸脱氢酶浓缩液，而将透过液回收到储罐中，然后调节透过液的pH值为7.2作为提取剂重复使用。将所得谷氨酸脱氢酶浓缩液采用superdex-200凝胶进行凝胶过滤层析，装柱后，用浓度为0.1mol/L，pH值为7.2的磷酸缓冲液冲洗，上样后用浓度为0.1mol/L，pH值为7.2的磷酸缓冲液进行洗脱，流速为3.0L/h，收集洗脱液得到纯化的谷氨酸脱氢酶母液。将纯化后的谷氨酸脱氢酶母液用FD-27压盖型冷冻干燥机，在-60℃冷冻干燥，得到谷氨酸脱氢酶产品，酶活达到10000U/mg。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.一种从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法，其特征在于，
以牛肝脏为原料提取获得谷氨酸脱氢酶粗提液，将所得谷氨酸脱氢酶粗提液采用孔径为0.004-0.006μm的中空纤维滤膜，以30-50L/h的流速进行超滤浓缩，收集超滤截留液得到含有高浓度谷氨酸脱氢酶的谷氨酸脱氢酶浓缩液；
此外，还包括以下步骤：
步骤一、纯化，将所得谷氨酸脱氢酶浓缩液采用superdex-200凝胶进行凝胶过滤层析，用pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液进行洗脱，流速为2.0-3.0L/h，收集层析洗脱液得到纯化的谷氨酸脱氢酶母液；
步骤二、冷冻干燥，将所得谷氨酸脱氢酶母液经过冷冻干燥，既得所述谷氨酸脱氢酶；
其中，所述谷氨酸脱氢酶粗提液的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将切碎的牛肝脏和预冷至5-10℃的磷酸缓冲液按照体积比1：6-10混合后，进行捣碎20-30min，将捣碎后的物料于5-10℃搅拌3-5h，得到牛肝匀浆；
步骤二、将所得牛肝匀浆在5-20℃条件下进行真空压滤，收集过滤液既得所述谷氨酸脱氢酶粗提液；
其中，捣碎过程中所用磷酸缓冲液的pH值为6.5-7.5，且在捣碎过程中至少补充一次预冷至5-10℃的磷酸缓冲液，补充的磷酸缓冲液的量以磷酸缓冲液的总加入量低于牛肝脏与磷酸缓冲液的最大体积比为准。
2.如权利要求1所述的从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法，其特征在于，采用XTZL-Ф260/Ф200真空过滤机，孔径为0.4-0.6mm的棉纶滤布对牛肝匀浆进行真空压滤。
3.如权利要求1所述的从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法，其特征在于，将所述超滤浓缩得到的透过液进行收集，并调节所得透过液的pH值为6.5-7.5并预冷至5-10℃后，与切碎的牛肝脏混合后进行捣碎。
4.如权利要求1所述的从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法，其特征在于，在进行凝胶过滤层析之前用pH值为6.5-7.5的磷酸缓冲液对所述凝胶柱进行冲洗。
5.如权利要求1所述的从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法，其特征在于，步骤二中冷冻干燥温度为-55—-60℃。
6.如权利要求1或4所述的从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法，其特征在于，所用磷酸缓冲液的浓度均为0.09-0.11mol/L。
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