CN104165988A - 一种鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法，它主要包括配置组织匀浆、测定蛋白质含量、在孵育夜中孵育、终止反应并计算含量几步。本发明的测定方法样品处理过程简单，只需在加入还原剂DTT的PBS缓冲液中匀浆即可，操作过程也比较简便，实验仪器仅需要高速冷冻离心机，紫外分光光度计，水浴锅和γ放射免疫计数仪即可。碘125标记物可在生物技术研究所定制合成，其半衰期较长，有利于实验的开展，测定结果可靠，具有很强的实用性。

Description

一种鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法
技术领域
本发明动物生理学和生物化学技术领域，具体涉及一种鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法。
背景技术
目前关于脱碘酶活性测定的方法仅有一篇于1996年发表在Clinical Biochemistry上的“一种用碘125标记的反三碘原腺甲氨酸为底物测定肝脏和肾脏中I型脱碘酶的方法”(Hotz,C.S.,Belonje,B.,Fitzpatrick,D.W.,L'abbe,M.R.,1996.A Methodfor the Determination of Type I Iodothyronine Deiod naseActivity in Liver and Kidney Using125I-Labelled ReverseTriiodothyronine as a Substrate.Clinical Biochemistry29,451-456.)。但该文献没有介绍Ⅱ型和Ⅲ型脱碘酶的测定方法。国内外文献中有多篇涉及脱碘酶活性测定的内容，虽然都是利用放射性的碘标记物作为反应底物来测定脱碘酶的活性，但方法不尽相同，没有统一的标准。
脱碘酶是一种硒蛋白，存在于细胞质膜中，它们对甲状腺激素的代谢过程有着非常重要的调节作用，测定其活性对甲状腺功能的研究以及发病机理有重要作用。脱碘酶活性表示为：每分钟每毫克蛋白质释放出的I的皮摩尔数或发摩尔数。(pmol/fmol I released·mgprotein-1·minute-1)。根据不同的物理化学特性、组织分布、底物特异性和对抑制剂的敏感性，脱碘酶可以分为三种类型：Ⅰ型脱碘酶(ID1)、Ⅱ型脱碘酶(ID2)、Ⅲ型脱碘酶(ID3)。这三种脱碘酶分别有着各自最适的反应底物。测定的方法是，用碘125标记相应的底物，经过一定时间的孵育之后，测定由脱碘酶脱下的碘离子的放射性强度，然后经过公式计算出脱碘酶的活性，脱碘酶的活性表示为每分钟每毫克蛋白质释放出的碘离子的发摩尔数。目前国内外还尚未见有测定鱼类组织中三种脱碘酶活性的试剂盒，也没有标准的测定方法。
发明内容
本发明的目的是根据现有技术的不足提供一种动物组织中三种脱碘酶活性的测定方法，本测定方法操作简单方便，成本低，测定结果直接可靠。
本发明是通过如下技术方案实现的：一种鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法，其步骤包括：(1)称取动物组织后用缓冲液将动物组织配制成质量浓度为1-2％的匀浆，并离心取上清夜；(2)测定所述上清液中蛋白质含量；(3)将所述上清液按照体积比1：1加入孵育液在37℃下孵育120min；将缓冲液按照同样方法加入孵育液后在37℃下孵育120min作为对照组；测定Ⅰ型脱碘酶活性的孵育液为50000cpm125I-rT3，0.1μM rT3，15mM DTT混合物；测定Ⅱ型脱碘酶的孵育液为50000cpm125I-T4，1nM T4，30mM DTT混合物；测定Ⅲ型脱碘酶的孵育液为150000cpm125I-T3，1nM T3，30mM DTT混合物；(4)加入BSA溶液终止反应后沉淀离心，取上清液用放射免疫计数仪分别测定总放射性及上清液的放射性cpm值，依据下述经验公式分别计算动物组织中三种脱碘酶活性：
其中：其中SCc＝SC－BC；
BC：对照管的放射性计数；
SC：样品管的放射性计数；
SA：孵育液中反应底物的含量/TC；
TC：总放射性计数。
优选的，所述缓冲液为0.1M的pH＝7.0的PBS缓冲液，其中含有2mM EDTA，1Mm DTT。
优选的，所述步骤(4)中BSA溶液4℃的质量体积浓度为5％的BSA溶液，BSA溶液的加入量与上清液的体积比为1：1。
优选的，所述步骤(4)中加入BSA溶液后沉淀是加入了质量体积浓度为10％的TCA溶液，并在3500r/min下离心30min，TCA溶液的加入量与上清液的体积比为2：1。
本发明了以鱼类肝脏匀浆为实验材料，采用放射性碘标记物为实验底物。Ⅰ型脱碘酶(ID1)同时具有外环脱碘酶及内环脱碘酶的功能，在辅因子二硫苏糖醇(DTT)参与的情况下，ID1催化三种甲状腺激素的Km(米氏常数)和νmax(最大反应速度)值不同，对底物的亲和性顺序为rT3＞T4＞T3，因此采用碘125标记的rT3来测定ID1的脱碘活性，同时加入一定量的未标记的rT3来平衡ID1内环脱碘酶以及其他脱碘酶的活性。Ⅱ型脱碘酶(ID2)仅能催化T4和rT3的5’位脱碘，使T4转化为T3，rT3转化为3,3’-T2。ID2对T4的亲和力略高于rT3，同时ID2催化的脱碘也需要还原辅因子DTT的参与，因此采用碘125标记的T4来测定ID2的脱碘活性，同时加入一定量的未标记的T4来平衡其他脱碘酶的催化活性。ID3具有完全的内环脱碘酶活性，催化T3和T4的5位脱碘，分别转化为两种完全无生物活性的rT3和3,3’-T2。采用碘125标记的T3来测定ID3的脱碘活性，同时加入一定量的未标记的T3来平衡其他脱碘酶的催化活性。本发明将待测样品与相应的孵育液在37℃条件下孵育进行脱碘反应，120min后加入4℃5％BSA(w/v)溶液终止反应，充分混匀后加入10％TCA使蛋白沉淀，于3000r/min离心30min，被脱碘酶催化脱落的碘125标记的碘离子游离在上清液中，通过测定总放射性cpm值和上清液中的放射性cpm值，根据公式进行计算则可得出脱碘酶的活性。
本发明的测定方法样品处理过程简单，只需在加入还原剂DTT的PBS缓冲液中匀浆即可，操作过程也比较简便，实验仪器仅需要高速冷冻离心机，紫外分光光度计，水浴锅和γ放射免疫计数仪即可。碘125标记物可在生物技术研究所定制合成，其半衰期较长，有利于实验的开展，测定结果可靠，具有很强的实用性。
说明书附图
图1为鲤不同组织中ID1的活性；
图2为鲤不同组织中ID2的活性；
图3为鲤不同组织中ID3的活性。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明：
实施例1
测定鲤不同组织中三种脱碘酶的活性
实验材料为鲤，购自湖北省武汉市白沙洲农副产品大市场，平均体长为17.4±0.53cm，平均体重为104.9±4.84g。在取样前，将鲤在恒定的实验室环境中驯养15天，保持恒定的水温(25±1℃)，光照周期为16(光照)：8(黑暗)，每天换三分之一的水并喂食饲料，取样的当天不喂食。取样时将鲤用MS-222进行麻醉，取肝、脑、肾、白肌、红肌、鳃和甲状腺组织进行脱碘酶活性的测定。具体操作步骤如下：
(1)制备组织匀浆：
准确称取待测组织的重量，按照重量体积比用0.1M PBS缓冲液(含2mM EDTA，1mM DTT，PH7.0)制备成10％的组织匀浆10000g，4℃，离心20分钟，然后取上清液，将肝、肾、鳃组织的上清液再用缓冲液稀释成1％的组织匀浆，将脑、白肌、红肌组织的上清液稀释成2％的组织匀浆，将甲状腺组织的上清液稀释成5％的组织匀浆。
(2)组织匀浆蛋白含量的测定：
用Bradford蛋白定量试剂盒测定各组织匀浆液中的蛋白含量，以匀浆缓冲液作为空白，牛血清白蛋白(BSA)溶液作为蛋白质标准溶液，用酶标仪测定595nm处各管的OD值，通过标准曲线计算出各组织匀浆液中蛋白质的含量。
(3)与孵育液进行孵育：
将各200μl组织匀浆液分别与200μl不同的IDs孵育液在37℃条件下孵育120min以分别检测ID1、ID2和ID3的活性，以匀浆缓冲液作为空白对照。
用于测定ID1活性的孵育液：50000cpm125I-rT3，0.1μM rT3和15mMDTT；
用于测定ID2活性的孵育液：50000cpm125I-T4，1nM T4，30mM DTT；
用于测定ID3活性的孵育液：150000cpm125I-T3，1nM T3，30mM DTT。(4)终止反应：
孵育结束后加入200μl4℃5％BSA(w/v)溶液终止反应，混匀后再加入400μl4℃10％TCA溶液使蛋白沉淀，3500转离心30min。
(5)测定总放射性及上清液的放射性cpm值：用放射免疫计数仪测定总放射性及上清液的放射性cpm值，脱碘酶的活性由以下公式计算：
其中SCc＝SC－BC
BC：对照管的放射性计数；
SC：样品管的放射性计数；
SA：孵育液中反应底物的含量/TC；
TC：总放射性计数。
脱碘酶活性表示为：每分钟每毫克蛋白质释放出的I-的皮摩尔数或发摩尔数。(pmol/fmol I released·mg protein-1·minute-1)实验结果如图1-图3所示。由实验结果可知，ID1在鲤的肝和肾组织中的活性最高，ID2活性主要存在于肝组织中，ID3活性则仅在肝和脑组织中被检测出来，且在脑组织中活性最高，与所报道的文献均一致，可见利用该实验方法均能可靠的测定出肝脏组织中的脱碘酶活性，说明本实验方法结果可靠，可以作为测定动物肝脏中三种脱碘酶活性的方法。

Claims (4)

1.一种鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法，其步骤包括：(1)称取动物组织后用缓冲液将动物组织配制成质量浓度为1-5％的匀浆，并离心取上清夜；(2)测定所述上清液中蛋白质含量；(3)将所述上清液按照体积比1：1加入孵育液在37℃下孵育120min；将缓冲液按照同样方法加入孵育液后在37℃下孵育120min作为对照组；测定Ⅰ型脱碘酶活性的孵育液为50000cpm125I-rT3，0.1μM rT3，15mM DTT混合物；测定Ⅱ型脱碘酶的孵育液为50000cpm125I-T4，1nM T4，30mMDTT混合物；测定Ⅲ型脱碘酶的孵育液为150000cpm125I-T3，1nM T3，30mM DTT混合物；(4)加入BSA溶液终止反应后沉淀离心，取上清液用放射免疫计数仪分别测定总放射性及上清液的放射性cpm值，依据下述经验公式分别计算动物组织中三种脱碘酶活性：
其中：其中SCc＝SC－BC；
BC：对照管的放射性计数；
SC：样品管的放射性计数；
SA：孵育液中反应底物的含量/TC；
TC：总放射性计数。
2.根据权利要求1所述鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法，其特征在于：所述缓冲液为0.1M的pH＝7.0的PBS缓冲液，其中含有2mM EDTA，1Mm DTT。
3.根据权利要求1所述鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法，其特征在于：所述步骤(4)中BSA溶液4℃的质量体积浓度为5％的BSA溶液，BSA溶液的加入量与上清液的体积比为1：1。
4.根据权利要求1所述鱼类组织中三种脱碘酶活性的测定方法，其特征在于：所述步骤(4)中加入BSA溶液后沉淀是加入了质量体积浓度为10％的TCA溶液，并在3500r/min下离心30min，TCA溶液的加入量与上清液的体积比为2：1。
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