CN104165870B - 利用阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液测定多巴胺方法 - Google Patents

利用阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液测定多巴胺方法 Download PDF

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一种利用阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液测定多巴胺的方法，属于荧光分析检测技术领域。本发明测定方法的技术特征是：将阳离子型二苯丙氨酸溶解于六氟异丙醇溶剂，然后加入甲苯使之凝胶化，干燥后分散于Tris‑HCl缓冲溶液，使阳离子型二苯丙氨酸自组装成纳米球并得到阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液；阳离子型二苯丙氨酸与多巴胺之间可发生荧光共振能量转移，将多巴胺加入阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液中可使胶体溶液的荧光强度降低，利用多巴胺浓度与胶体溶液荧光强度变化值之间的定量关系，可以实现对多巴胺的定量检测。本发明测定方法无需荧光标记物，环境友好，操作简单，此外还具有检测灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强，重现性好等优点。

Description

利用阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液测定多巴胺方法
技术领域
本发明涉及一种利用阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液测定多巴胺的方法，属于荧光分析检测技术领域。
背景技术
多巴胺是神经系统中重要的儿茶酚胺神经递质之一，多巴胺浓度水平不正常可导致帕金森病、精神分裂症等，同时多巴胺浓度也反映了体系内酪氨酸的生物降解水平。因此多巴胺的检测具有重要的临床意义。多巴胺的检测方法有电化学法、电致化学发光法、比色法、荧光法等，其中荧光法检测限低且具有良好的选择性而备受关注。但已报道的荧光检测体系多使用到量子点、石墨烯、碳纳米管、Au纳米颗粒等，这些材料往往生物相容性较差甚至具有较大的毒性。
二苯丙氨酸及其衍生物（阳离子型二苯丙氨酸等）具有容易自组装、生物相容性好、表面官能团丰富且容易进行化学修饰等特点，近年来二苯丙氨酸及其衍生物的自组装结构引起了人们的极大兴趣和关注，在分析领域也展现了广阔的应用前景。如Jae Hong Kim等人将二苯丙氨酸和镧系元素复合物结合，二苯丙氨酸和光敏剂产生协同效应，增强了镧系元素本身的发光强度，同时也提高了检测神经毒素的选择性 (Jae Hong Kim , Jungki Ryu, Chan Beum Park, Small, 2011, 7: 718-722)。
二苯丙氨酸及其衍生物的发射光谱与多巴胺的吸收光谱有重叠，两者间可以发生荧光共振能量转移。所谓荧光共振能量转移是指发生在供体和受体之间长距离偶极-偶极相互作用的非辐射能量转移，导致供体的荧光强度降低，受体荧光增强或不发出荧光。荧光共振能量转移具有距离依赖性，荧光共振能量转移的效率与分子间距离的六次方成反比，因此基于荧光共振能量转移原理的荧光分析方法通常具有较高的灵敏度和选择性。但基于荧光共振能量转移原理，利用二苯丙氨酸或其衍生物直接对底物进行荧光分析检测的工作未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液测定多巴胺的方法，其特征在于，先使阳离子型二苯丙氨酸凝胶化并干燥，然后将其分散于Tris-HCl缓冲溶液中自组装成纳米球，得到阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液，根据加入多巴胺前后胶体溶液荧光强度的变化来实现对多巴胺的定量检测。具体操作步骤如下。
(1) 阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液的制备：将阳离子型二苯丙氨酸粉末溶解于六氟异丙醇溶剂中，超声分散10~20分钟，获得浓度为90~110 mg/mL的阳离子型二苯丙氨酸溶液，按照阳离子型二苯丙氨酸溶液与甲苯体积比为1:30~1:40的比例关系将二者混合，超声处理直到全部凝胶化；将此凝胶在室温条件真空干燥8~12 小时，得到干凝胶，将干凝胶分散于Tris-HCl缓冲溶液并超声分散10~20分钟，得到阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液，其中阳离子型二苯丙氨酸的浓度为0.2 ~ 0.3 mg/mL。
(2) 利用阳离子型二苯丙氨酸与多巴胺之间可发生荧光共振能量转移的原理进行多巴胺检测，即作为供体的阳离子型二苯丙氨酸与受体多巴胺之间发生非辐射能量转移，使阳离子型二苯丙氨酸的荧光强度降低，具体而言，在258 nm的激发光激发下，阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液产生荧光，加入多巴胺后胶体溶液的荧光强度降低，且胶体溶液荧光强度的变化值与胶体溶液中多巴胺的浓度在一定范围内呈线性关系，由此可绘制出胶体溶液荧光强度变化值与多巴胺浓度之间的标准工作曲线；利用该标准工作曲线可以实现对待测体系中多巴胺的定量检测。其中测试荧光强度时选取的发射波长测试范围为275 ~ 290 nm，优选282 nm；在测试开始，即激发光开始照射后的15~30分钟的时间内记录荧光强度。
本发明方法的特点与优势在于：本发明提供了一种以阳离子型二苯丙氨酸为供体，多巴胺为受体，利用荧光共振能量转移直接检测多巴胺的方法（其工作原理如图1所示）；与文献报道的多巴胺荧光检测方法相比，具有无需标记物、灵敏度高、检测范围较宽、抗干扰能力强、重现性良好等优点。
附图说明
图1是本发明检测多巴胺的原理示意图。
图2为本发明实施例1中阳离子型二苯丙氨酸纳米球的透射电镜照片。
图3为本发明实施例1中阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液中多巴胺的浓度与荧光强度变化值的关系图。横坐标为以10为底的多巴胺的浓度的对数，即Log[多巴胺浓度/(纳摩尔/升)]；纵坐标为加入多巴胺前后荧光强度的变化值，简写为荧光强度的变化值，单位为：绝对单位 (a.u.)。
图4为本发明实施例1中加入各干扰物后荧光强度变化量的示例图。其中DA是多巴胺，加入的干扰物有抗坏血酸 (AA)、尿酸 (UA)、肾上腺素 (AD)、去甲肾上腺素 (NAD)、邻苯二酚 (Catl)、尿素 (Urea)、还原型谷胱甘肽 (GSH)、酪氨酸 (Tyr)、色氨酸 (Trp)、半胱氨酸 (Cys)、乳酸 (LA)、葡萄糖 (Glc)、蔗糖 (Sac)、丙酮 (Ace)、Na+、K+、Cu2+、Zn2+。横坐标为加入多巴胺或干扰物前胶体溶液的荧光强度与加入多巴胺或干扰物后胶体溶液的荧光强度比值，简写为荧光强度比值。
具体实施方式
实施例1：阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液的制备：将10 mg阳离子型二苯丙氨酸溶解于100 μL六氟异丙醇溶剂中，超声分散10分钟使其全部溶解，获得浓度为100 mg/mL的阳离子型二苯丙氨酸溶液；快速移取上述配好的溶液10 μL加入到1 mL离心管中，往该离心管加入300 μL甲苯溶剂，超声直到全部凝胶化；将此凝胶在室温条件真空干燥12小时，得到干凝胶，分散于4 mL的Tris-HCl缓冲溶液中(pH为6.5)，并超声15分钟，得到阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液，其中阳离子型二苯丙氨酸的浓度为0.25 mg/mL。阳离子型二苯丙氨酸纳米球的透射电镜照片如图2所示。
在258 nm的激发光激发下，阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液产生荧光，加入多巴胺后胶体溶液的荧光强度降低，且胶体溶液荧光强度的变化值与胶体溶液中多巴胺的浓度在一定范围内呈线性关系，由此可绘制出胶体溶液荧光强度变化值与多巴胺浓度之间的标准工作曲线如图3所示；利用该标准工作曲线可以实现对待测体系中多巴胺的定量检测。该荧光传感器的线性范围为0.05~30 μmol/L和30~300 μmol/L，加入多巴胺或干扰物前胶体溶液的荧光强度与加入多巴胺或干扰物后胶体溶液的荧光强度比值如图4所示，其中加入浓度为10 μmol/L的干扰物抗坏血酸时荧光强度比值为1.009。
实施例2：阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液的制备：将11 mg阳离子型二苯丙氨酸溶解于100 μL六氟异丙醇溶剂中，超声分散20分钟使其全部溶解，获得浓度为110 mg/mL的阳离子型二苯丙氨酸溶液；快速移取上述配好的溶液10 μL加入到1 mL离心管中，往该离心管加入400 μL甲苯溶剂，超声直到全部凝胶化；将此凝胶在室温条件真空干燥10小时，得到干凝胶，分散于4.5 mL的Tris-HCl缓冲溶液中(pH为7.0)，并超声20分钟，得到阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液，其中阳离子型二苯丙氨酸的浓度为0.24 mg/mL。
在258 nm的激发光激发下，阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液产生荧光，加入多巴胺后胶体溶液的荧光强度降低，且胶体溶液荧光强度的变化值与胶体溶液中多巴胺的浓度在一定范围内呈线性关系，由此可绘制出胶体溶液荧光强度变化值与多巴胺浓度之间的标准工作曲线；利用该标准工作曲线可以实现对待测体系中多巴胺的定量检测。该测试体系加入浓度为10 μmol/L干扰物抗坏血酸时荧光强度比值为1.057。

Claims (3)

1.一种利用阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液测定多巴胺的方法，其特征在于，先使阳离子型二苯丙氨酸凝胶化并干燥，然后将其分散于Tris-HCl缓冲溶液中自组装成纳米球，得到阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液，根据加入多巴胺前后胶体溶液荧光强度的变化来实现对多巴胺的定量检测，具体操作步骤如下：
(1) 阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液的制备：将阳离子型二苯丙氨酸粉末溶解于六氟异丙醇溶剂中，超声分散10~20分钟，获得浓度为90~110 mg/mL的阳离子型二苯丙氨酸溶液，按照阳离子型二苯丙氨酸溶液与甲苯体积比为1:30~1:40的比例关系将二者混合，超声处理直到全部凝胶化；将此凝胶在室温条件真空干燥8~12 小时，得到干凝胶，将干凝胶分散于Tris-HCl缓冲溶液并超声分散10~20分钟，得到阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液，其中阳离子型二苯丙氨酸的浓度为0.2 ~ 0.3 mg/mL；
(2) 在258 nm的激发光激发下，阳离子型二苯丙氨酸纳米球胶体溶液产生荧光，加入多巴胺后胶体溶液的荧光强度降低，且胶体溶液荧光强度的变化值与胶体溶液中多巴胺的浓度在一定范围内呈线性关系，由此可绘制出胶体溶液荧光强度变化值与多巴胺浓度之间的标准工作曲线；利用该标准工作曲线可以实现对待测体系中多巴胺的定量检测。
2.根据权利要求1所述测定多巴胺的方法，其特征在于，利用阳离子型二苯丙氨酸与多巴胺之间可发生荧光共振能量转移的原理进行多巴胺检测，即作为供体的阳离子型二苯丙氨酸与受体多巴胺之间发生非辐射能量转移，使阳离子型二苯丙氨酸的荧光强度降低。
3.根据权利要求1所述测定多巴胺的方法，其特征在于，在步骤(2)中，测试荧光强度时选取的发射波长测试范围为275 ~ 290 nm；在测试开始，即激发光开始照射后的15~30分钟的时间内记录荧光强度。
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