CN104164439A - 一种编码稗草高蛋氨酸蛋白的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种编码稗草高蛋氨酸蛋白的基因及其编码蛋白与应用。该基因能大大促进蛋白质合成，降低非蛋白氮含量，不仅促进作物生长，而且提高农产品品质，具有较高的实际应用价值。

Description

一种编码稗草高蛋氨酸蛋白的基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种稗草植物中编码高蛋氨酸蛋白的基因，属于分子生物学技术领域。

背景技术

硫是仅次于氮、磷、钾的植物必需的第4大营养元素，缺硫时蛋白质合成受阻，导致非蛋白氮累积，不仅影响作物生长，而且降低农产品品质；植物含硫量为0.1％～0.5％，其变幅明显受植物种类、品种、器官和生育期的影响。十字花科植物需硫最多，豆科、百合科植物次之，禾本科植物较少(陆景陵，1994)。含硫氨基酸如甲硫氨酸(也称为蛋氨酸，methionine，Met)、胱氨酸、半胱氨酸(cysteine，Cys)等是合成蛋白质的重要氨基酸；蛋白质中含硫氨基酸的含量与种子萌发、生长和作物品质均有密切关系。其中，Met作为人体和单瘤胃动物的必需氨基酸之一，在水稻、小麦、大麦、养麦，尤其是豆类和花生等主要的粮食作物和经济作物中含量极低，是主要的限制性氨基酸，因此提高这些作物的Met含量显得尤为重要(赵文明，1995；Müntz K，1998)。

随着现代生物技术的发展，通过扩大筛选获得更多高含硫氨基酸的目的基因，利用蛋白质组学的方法揭示高Met种子贮藏蛋白新的功能(王文军等，2005)，结合植物基因工程的手段改良作物品质、调节种子生长发育等将更具实际意义(Haft B K，2005)。

目前国际上已经分离出来可供用来提高作物Met含量的高Met植物种子贮藏蛋白基因为数不多，其主要来源是玉米(Altenbach S B，1990)和水稻(Masum-ura T，1989)，此外还有少部分来自巴西栗(Saalbach I，1994)、花生(BashaS M，1994)等，我国尤其落后，因而充分利用我国丰富的种质资源，合理与有效的发掘和利用植物资源，分离提取有价值的高Met植物种子贮臧蛋白基因是以提高作物Met含量为目的品质改良基因工程领域迫切需要的基础性工作，也将为高Met植物种子贮藏蛋白的研究开辟新的领域。

发明内容

本发明提供一种编码高蛋氨酸蛋白的稗草基因BarM及其编码高蛋氨酸蛋白的应用；该基因能提高高蛋氨酸蛋白的表达，尤其是能够提高植物中蛋氨酸的含量。

本发明通过设计出引物，以稗草DNA为模板，PCR扩增得到该基因全长序列，经T载体克隆并测序，再转入大豆进行强表达，表明这是一条编码高蛋氨酸蛋白的基因。该基因编码区为390bp，编码129个氨基酸，其中含有17个蛋氨酸，并且在该蛋白中蛋氨酸的摩尔百分含量达到13.18％。

因此，本发明第一目的是提供一种编码高蛋氨酸蛋白的稗草基因BarM，其属于新的编码高蛋氨酸蛋白基因，具有或选自SEQ ID NO：1的序列。或与SEQ IDNo：1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列；在高严谨条件下可与SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

本发明第二目的是提供所述基因所编码的功能蛋白，其具有或选自SEQ IDNO：2的蛋白序列，或具有或选自SEQ ID NO：1的基因序列所编码的蛋白序列。或与SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一至十二个氨基酸残基的取代或缺失或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。

本发明第三目的是提供所述基因或功能蛋白，在调控稗草高蛋氨酸蛋白表达中的用途；利用该基因，开发更高效、无毒的稗草来源的具有高蛋氨酸蛋白的功能型食用蛋白乃至保健品。

在具体实施方案中BarM基因及其调控元件的表达载体。

在具体实施方案中BarM基因及其调控元件的转基因细胞系。

在具体实施方案中BarM基因及其调控元件的工程菌。

在具体实施方案中BarM基因及其调控元件中任一片段的引物对。

在具体实施方案中BarM基因及其调控元件中在植物生长发育中的应用。

在具体实施方案中BarM基因及其蛋白可应用于植物包括单子叶植物和双子叶植物。

附图说明

图1为PCR基因扩增结果(1为稗草PCR扩增产物，M为DNA Marker)。

图2为酶切结果(1为提取的重组质粒，2为重组质粒酶切产物，M为DNAMarker)。

图3pCAMBIA1390重组质粒中连接示意图(L. Japonicus Ubiquitin promoterpCAMBIA1390)，其中BARM为稗草高蛋氨酸基因。

技术效果

1、利用本发明的BARM基因表达得到含有17个蛋氨酸的蛋白质，有助于蛋氨酸在大豆中的含量。

2、利用本发明的BARM基因基因和蛋白，可用于已有高蛋氨酸蛋白的研究和应用中，以及开发高效、无毒的高蛋氨酸蛋白的功能型的蛋白质乃至保健品。

具体实施方式

在本发明的下述实施例中，所用的实验材料均为稗草(Echinochloacrusgalli L.Beauv.)。

实施例1、稗草总RNA提取

利用RNA提取分离试剂盒(Invitrogen公司提供)提取稗草苞片中总RNA，其具体方法是：收集稗草苞片100mg，立即置于液氮中研磨，加入1ml Trizol试剂，充分混匀；室温放置5min；加入0.2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15s，室温温育3min；4℃，12000g离心15min；上清水相转移到一个新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇沉淀RNA；RNA沉淀用1ml75％乙醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。

实施例2、稗草总RNA纯化

依据DNase I试剂盒(Thermo Scientific公司提供)依次向实施例1获得的稗草总RNA中加入6μl DEPC处理水、10μl RNA、2μl DNase I Buffer、2μl DNaseI，混合均匀后，37℃30min，加入EDTA2μl，65℃10min。

实施例3、稗草RNA逆转录

第一链合成：依据Plant RT-PCR Kit2.01(TaKaRa，Japan)的用户手册进行。1-2ng总RNA(大约1-2μl)，和Kit的各种反转录试剂混合(MgCl₂4μl；10XRNA PCR Buffer2μl；RNase Inhibitor0.5μl；RNase free Water8.5μl；dNTPMixture2μl；Reverse Transcriptase1μl；Oligo dT-Adaptor1μl)。混匀后，42℃30min；99℃5min；5°℃5min，完成反转录反应。

第二链合成：根据生物信息学提供的序列资料设计以下引物：

5’端引物(SEQ ID NO：3)：5′-CGGGATCCCGATGGCAGCCAAGATGCTTGC-3′；

3’端引物(SEQ ID NO：4)：5′-CGAGCTCGCTAGAATGCAGCACCAACAAAGGG-3′。

吸取1μl反转录产物，作为模板与DNA Taq酶混合(反转录产物1μl，上游引物(SEQ ID NO：3)0.5μl，下游引物(SEQ ID NO：4)0.5μl，Taq0.5μl，10X Buffer2μl，Mg²⁺0.5μl，ddH₂O15μl)进行PCR反应：94℃5min后进入扩增程序：94℃1min、57℃1min、72℃1min，30个循环后，72℃5min。

实施例4、TA克隆

将实施例3中所获得的PCR扩增产物，经琼脂糖电泳(图2)分离目的DNA片段，采用胶回收DNA试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)方法进行回收DNA片段，将回收的第二链合成产物与DNA克隆试剂混合(第二链产物6μl，PEG40001μl，T载体1μl，10X ligation buffer1μl，ligase1μl)，于16℃连接过夜。

实施例5、转化大肠杆菌和目的DNA片段测序

取连接产物5μl与200μl大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自上海生工生物工程有限公司)混匀，冰上放置30min，42℃90s，冰浴1-2分钟，加入800μl LB培养基，于37℃，250rpm震荡培养45min，4000rpm离心5min，上清留下约150μl，加入7μl IPTG，40μl x-gal混合均匀，涂布于预先加入Amp(氨苄青霉素)的LB固体培养基上培养过夜，挑取白色菌落于加有Amp的LB液体培养基中震荡过夜，取1ml菌液送至上海生工生物工程有限公司测序。测序结果表明：扩增得到的序列SEQ ID NO：1自起始密码子到终止密码子总长390碱基，编码129个氨基酸，推测分子量为14.2kD，等电点8.74，编码蛋氨酸17个，蛋氨酸的百分摩尔含量为13.18％。

实施例6、将目的DNA片段导入大豆中进行强表达

从上述含有BARM基因的菌液中提取质粒，用Xba I和BamH I进行双酶切，酶切产物经回收后，与同样经Xba I和BamH I双酶切回收的pCAMBIA1390质粒进行连接，构建重组质粒(如图3)；将重组质粒转化根癌农杆菌AGL1，通过Kan和Rif筛选出转化成功的AGL1菌株，并将其侵染大豆(购自南京农业大学国家大豆种质资源中心)子叶节，利用潮霉素筛选获得BARM基因转染成功的大豆幼苗，并经培养获得大豆种子，通过氨基酸分析仪检测大豆种子Met含量，发现其Met含量由对照的0.651％提高至3.968％，表明BARM基因在大豆中得到了强表达。

SEQ ID NO：1基因序列表如下：

SEQ ID NO：2氨基酸序列表如下：

Claims (9)

1.编码高蛋氨酸蛋白的稗草基因BarM及其编码蛋白的应用，其特征在于为下述核苷酸序列之一的基因：

(1)SEQ ID No：1；

(2)与SEQ ID No：1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列；

(3)在高严谨条件下可与SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2.权利要求1所述BarM基因表达的蛋白质，其特征在于为下述氨基酸残基序列之一：

(1)SEQ ID No：2；

(2)SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一至十二个氨基酸残基的取代或缺失或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。

3.含有权利要求1所述的BarM基因及其调控元件的表达载体。

4.含有权利要求1所述的BarM基因及其调控元件的转基因细胞系。

5.含有权利要求1所述的BarM基因及其调控元件的工程菌。

6.扩增权利要求1所述的BarM基因及其调控元件中任一片段的引物对。

7.权利要求1所述的BarM基因及其调控元件中在植物生长发育中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，所述的植物包括单子叶植物和双子叶植物。

9.根据权利要求1或2所述的应用，在调控稗草高蛋氨酸蛋白表达中的用途；利用该基因，开发更高效、无毒的稗草来源的具有高蛋氨酸蛋白的功能型食用蛋白乃至保健品。