CN104164418A - 一种石蜡包埋组织切片基因组dna提取试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种石蜡包埋组织切片基因组DNA提取试剂盒及其使用方法，包括脱蜡剂，二甲苯0.9~1.1份；脱蜡清洗剂，由95%乙醇1.8~2.2体积份，和75%乙醇0.9-1.1体积份组成；消化液0.28-0.32体积份，所述消化液由SDS、Tris-HCl、EDTA及蛋白酶K与水配制，消化液中各组分浓度分别为，SDS0.9-1.1%，Tris-HCl9~11mM、EDTA0.9-1.1mM，蛋白酶K90-110μg/ml；蛋白沉淀剂，所述蛋白沉淀剂为4MNH₄AC溶液DNA沉淀剂，所述DNA沉淀剂为独立包装的3M醋酸钠溶液、无水乙醇、70%乙醇。

Description

一种石蜡包埋组织切片基因组DNA提取试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种核酸提取方法，具体上的涉及一种脱氧核糖核酸（DNA）的提取方法。 

背景技术

福尔马林固定石蜡包埋组织(formalin fixed and paraffin embedded tissues，FFPE，以下简称FFPE) 切片是医疗机构最常用的保存病理组织的方法。医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。由于新鲜标本难以得到，对已有病例进行回顾性研究时，只能从石蜡包埋组织中进行DNA提取，因此石蜡包埋组织就成为来源最丰富的珍贵资源。从FFPE 样品中分离出高纯度高质量的DNA是下游试验顺利进行的最基本前提。文献中报道的提取方法主要有酚氯仿抽提法等，但该方法需使用有毒试剂，如苯酚、氯仿等，不利于实验人员的身体健康，在酚氯法中，苯酚对皮肤有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经系统；而氯仿易挥发，能分解出有毒气体，作用中枢神经系统。吸入后对心、肾、肝有损害。异戊醇：吸入或经皮肤吸收有麻醉作用，对皮肤和呼吸道有刺激，引起神经系统功能紊乱，且采用酚氯法对石蜡包埋组织切片中的基因组DNA进行提取时，操作比较繁琐而且耗时（进行蛋白质消化孵育时需水浴3h以上至过夜）。因此迫切需要无毒且操作步骤简单，提取时间段的提取试剂盒及提取方法。 

有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种DNA提取试剂盒，使其更具有产业上的利用价值。 

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种石蜡包埋组织切片基因组DNA提取试剂盒及其使用方法。 

本发明提供了一种石蜡包埋组织切片基因组DNA提取试剂盒，其特征是所述试剂盒包括： 

脱蜡剂，二甲苯0.9~1.1份；

脱蜡清洗剂， 由95%乙醇1.8~2.2体积份，和75%乙醇0.9-1.1体积份组成； 

消化液0.28-0.32体积份，所述消化液由SDS、Tris-HCl、EDTA及蛋白酶K与水配制，消化液中各组分浓度分别为， SDS 0.9-1.1%， Tris-HCl 9~11mM、EDTA 0.9-1.1mM，蛋白酶K 90-110μg/ml；

蛋白沉淀剂，所述蛋白沉淀剂为4M NH₄AC溶液 

DNA沉淀剂，所述DNA沉淀剂为独立包装的3M醋酸钠溶液 、无水乙醇、70%乙醇。

所述石蜡包埋组织切片基因组DNA提取试剂盒，其特征是优选： 

所述脱蜡剂为二甲苯1份；

所述脱蜡清洗剂为95%乙醇2体积份，和75%乙醇1体积份；

所述消化液为0.3体积份，所述消化液中各组分浓度分别为， SDS 1%， Tris-HCl 10mM、EDTA 1mM，蛋白酶K 100μg/ml。

一种石蜡包埋组织切片基因组DNA提取方法，其特征是采用所述的石蜡包埋组织切片基因组DNA提取试剂盒， 

步骤如下：

1）脱蜡：包埋组织切片刮下置于离心管中，加脱蜡剂涡旋混匀，53~56度孵育9~11min，11000~13000rpm离心4~6min，弃上清；

2）清洗：向步骤1）离心管中的加入脱蜡清洗剂中的一半体积的95%乙醇，混匀室温放置9-11min，11000~13000rpm离心4~6min，弃掉上清，再分别用另一半体积的95%乙醇和脱蜡清洗剂中的75%乙醇洗脱，弃掉上清，在36~38℃晾干沉淀；

3）消化：向步骤2）得到的沉淀中加所述消化液, 于摇床 55~57度，180r/min震荡孵育0.9~1.1h；

4）蛋白沉淀：将步骤3）样品在冰上冷却，然后加入作为蛋白沉淀剂的4M NH₄AC，并充分混匀，11000~13000rpm离心4~6min

5）DNA沉淀：取步骤4）上清液加入DNA沉淀剂中的3M醋酸钠溶液至醋酸钠终浓度为0.3M，,加入2倍体积-20℃预冷的DNA沉淀剂中的无水乙醇，4℃ 13000rpm离心5min。弃上清，加入-20℃ 预冷的DNA沉淀剂中的70%乙醇洗涤沉淀，4℃13000rpm离心5min，弃上清，得到DNA。

6）DNA洗脱：将步骤5）得到的DNA室温干燥15min，用洗脱缓冲液溶解DNA，放在-20℃或-80℃长期保存。 

本发明中所述95%乙醇、75%乙醇，70%乙醇中的百分比含量均为体积百分含量。 

本发明还提供了一种石蜡包埋组织切片基因组DNA提取试剂盒，优化了脱蜡剂及脱蜡清洗剂的配方以及脱蜡步骤的工艺，能够代替现有的酚氯仿法提取DNA，与酚氯仿法相比，本发明提供的试剂盒避免了毒性较大的苯酚、氯仿等试剂的使用，减少了对实验操作者健康的威胁和对环境的污染，且提供的消化液中优选了配方，在采用较低浓度的蛋白酶K情况下即可实现良好消化效果，节约了蛋白酶K等昂贵试剂的使用。此外，本发明还提供了一种采用所述试剂盒进行石蜡包埋组织切片基因组DNA提取的方法，优化了采用消化液进行消化时的孵育方法，经过本发明提供脱蜡剂及脱蜡清洗剂处理过的试样，在采用消化液进行消化时，可以采用摇床震荡孵育的方法，较传统的孵育方法（水浴3h以上至过夜）节省了时间，提高了工作的效率，震荡孵育时仅需要1h即可消化完全，而采用本发明提供试剂盒及其使用方法在避免了使用高毒性有机溶剂，减少了昂贵的蛋白酶K用量，且能够采用震荡孵育大幅度节省操作时间的情况下，提取得到的DNA达到了与酚氯仿法同样质量，能够用于PCR扩增及后续的分析等用途。 

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 

实施例1 石蜡包埋组织切片基因组DNA提取试剂盒的组配 

脱蜡剂，二甲苯1.0mL；

脱蜡清洗剂，由95%乙醇2.0mL，75%乙醇1.0mL组成；

消化液300μL，由SDS、Tris-HCl、EDTA及蛋白酶K与水配制，消化液中各组分浓度分别为， SDS 1%（m/v）， Tris-HCl 10mM、EDTA 1.0mM，蛋白酶K 100μg/mL。

蛋白沉淀剂，4M NH₄AC溶液 

DNA沉淀剂，独立包装的3M醋酸钠溶液、无水乙醇、70%乙醇。

实施例2一种石蜡包埋组织切片基因组DNA提取方法，采用实施例1中提供的试剂盒 

样品类型：石蜡切片

一．  实验步骤

1. 脱蜡：包埋组织切片刮下置于1.5ml离心管中，加脱蜡剂（1.0ml二甲苯）涡旋混匀，55度孵育10min，12000rpm离心5min，弃上清。

2. 洗掉二甲苯：加脱蜡清洗剂中的一半体积的95%乙醇（1.0ml95%乙醇）混匀室温放置10min，12000rpm离心5min，弃掉上清，再分别用另一半体积的95%乙醇（1.0mL）和脱蜡清洗剂中的75%乙醇（1.0mL）洗脱，弃掉上清。在37度晾干沉淀。 

3. 消化：加消化液（300μL） 于摇床56度，180r/min 震荡孵育1h。 

4. 蛋白沉淀：将样品在冰上冷却，然后加入200ul作为蛋白沉淀剂的 4M NH₄AC，并充分混匀，12000rpm离心5min 

5. DNA沉淀：取上清液加入DNA沉淀剂中的3M醋酸钠溶液调节至醋酸钠终浓度为0.3M，加入2倍体积的DNA沉淀剂中的无水乙醇（-20℃预冷），4℃ 13000rpm离心5min。弃上清，加入1ml DNA沉淀剂中的70%乙醇（-20℃ 预冷）洗涤沉淀，4℃13000rpm离心5min，得到DNA。

6. DNA洗脱：将步骤5得到的DNA室温干燥15min，用洗脱缓冲液溶解DNA，放在-20℃或-80℃长期保存。 

二．  实验结果 

1. DNA纯度：260/280比值在1.8左右。

2. 后续实验：提取出的DNA进行一些PCR扩增实验，选了EGFR和KRAS两个基因做参考，与采用酚氯仿法得到的DNA相比，用于PCR扩增的效果基本相当，能够满足后续分析的要求。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。 

Claims (3)

1.一种石蜡包埋组织切片基因组DNA提取试剂盒，其特征是所述试剂盒包括：

脱蜡剂，二甲苯0.9~1.1份；

脱蜡清洗剂， 由95%乙醇1.8~2.2体积份，和75%乙醇0.9-1.1体积份组成， 

消化液0.28-0.32体积份，所述消化液由SDS、Tris-HCl、EDTA及蛋白酶K与水配制，消化液中各组分浓度分别为， SDS 0.9-1.1%， Tris-HCl 9~11mM、EDTA 0.9-1.1mM，蛋白酶K 90~110μg/ml；

蛋白沉淀剂，所述蛋白沉淀剂为4M NH₄AC溶液 

DNA沉淀剂，所述DNA沉淀剂为独立包装的3M醋酸钠溶液 、无水乙醇、70%乙醇。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是：

所述脱蜡剂为二甲苯1份；

所述脱蜡清洗剂为95%乙醇2体积份，和75%乙醇1体积份；

所述消化液为0.3体积份，所述消化液中各组分浓度分别为， SDS 1%， Tris-HCl 10mM、EDTA 1mM，蛋白酶K 100μg/ml。

3.一种石蜡包埋组织切片基因组DNA提取方法，其特征是采用如权利要求1或2所述的试剂盒，

步骤如下：

1）脱蜡：包埋组织切片刮下置于离心管中，加脱蜡剂涡旋混匀，53~56度孵育9~11min，11000~13000rpm离心4~6min，弃上清；

2）清洗：向步骤1）离心管中的加入脱蜡清洗剂中的一半体积的95%乙醇，混匀室温放置9-11min，11000~13000rpm离心4~6min，弃掉上清，再分别用另一半体积的95%乙醇和脱蜡清洗剂中的75%乙醇洗脱，弃掉上清，在36~38℃晾干沉淀；

3）消化：向步骤2）得到的沉淀中加所述消化液,于摇床 55~57度，180r/min震荡孵育0.9~1.1h；

4）蛋白沉淀：将步骤3）样品在冰上冷却，然后加入作为蛋白沉淀剂的4M NH₄AC，并充分混匀，11000~13000rpm离心4~6min；

5）DNA沉淀：取步骤4）上清液加入DNA沉淀剂中的3M醋酸钠溶液至醋酸钠终浓度0.3M，,加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，4℃ 13000rpm离心5min;弃上清，加入-20℃ 预冷的1ml 70%乙醇洗涤沉淀，4℃13000rpm离心5min，弃上清，得到DNA；

6）DNA洗脱：将步骤5）得到的DNA室温干燥15min，用洗脱缓冲液溶解DNA，放在-20℃或-80℃长期保存。