CN104164380B - 一株细菌纤维素高产菌 - Google Patents
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Abstract
一株细菌纤维素高产菌，它涉及一株细菌纤维素高产菌株。细菌纤维素高产菌为汉氏葡糖醋杆菌HDCo‑5(Gluconacetobacter hansenii HDCo‑5)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012234。本发明应用于细菌纤维素生产领域。
Description
技术领域
本发明涉及一株细菌纤维素高产菌株。
背景技术
细菌纤维素是一种由微生物合成的超微纯纤维素，与植物纤维素具有相同的化学结构，而在某些方面细菌纤维素又区别于植物纤维素，如网状微结构(自由nanoscale微纤维，其宽度小于10nm)，较高的抗张强度，高纯度(不含半纤维素和木质素)，高结晶度，高杨氏模量，高持水性，良好的形态可调控性，以及较高的生物适应性和良好的生物可降解性等特点。
细菌纤维素发现至今已有一百多年的历史，但由于其生产成本高应用仅局限在一些高附加值产品的制造中，以至于其工业化生产和推广受到一定的局限。近几十年来，随着人们对细菌纤维素生物合成机制的不断深入研究以及发酵技术的进一步改善，使细菌纤维素的工业生产与应用正日益向多元化方向发展。在美国、日本、德国等一些发达国家，细菌纤维素产业已初具规模，商业化的产品已进入食品、造纸、医疗、声学器材、化工等行业，形成了年产值上亿美元的市场，并每年以高比例状态持续增长。目前，对于有关细菌纤维素的应用性研究，在国外每年均有大量申请专利产生，其应用方面几乎涉及了每一工业领域，表现出了广阔的应用前景和潜在的巨大商业价值。而在国内，就现阶段而言我国除在食品领域有相对较多的基础研究外，在其它方面的研究开发涉及较少，总体仍处于起步阶段。对于国内细菌纤维素的研究现状，无论从细菌纤维素工业生产到应用，在数量、规模以及技术含量上与日欧美等国外企业都还存在较大差距。与此同时由于一般分离获得的醋酸菌液体发酵纤维素产量均比较低，其研究和应用受到一定的限制，使实际推广应用难以形成规模化和产业化，因此提高细菌纤维素的产量迫在眉睫。
发明内容
本发明为提高细菌纤维素的产量而提供了一株细菌纤维素高产菌。
本发明细菌纤维素高产菌为汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hanseniiHDCo-5)，属于革兰氏阴性菌，严格好氧，接触酶阳性，氧化酶阴性，不液化明胶，不产吲哚和H2S，氧化乙醇到乙酸，乙酸和乳酸氧化到CO2和H2O，不能水解淀粉，最适生长温度28～30℃，不能利用阿拉伯糖为碳源，低产丙酮酸、葡萄糖酸。汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)菌株呈椭球或杆状，以单个或成对呈现，罕见成链，如图4所示，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012234。
本发明采用硫酸二乙酯和60Co-γ对汉氏葡糖醋杆菌进行复合诱变，采用NaBr-NaBrO3培养基进行纤维素高产菌株的筛选，获得了本发明细菌纤维素高产菌株汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)。
汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)在每升基础发酵培养基(基础发酵培养基按质量百分比由5％的葡萄糖、0.5％的酵母膏、0.5％的蛋白胨、0.1％的柠檬酸、0.2％的Na2HPO4·12H2O、0.1％的K2HPO4、0.025％的MgSO4·7H2O和余量的蒸馏水制成，pH值为5.8)中产细菌纤维素干重平均达1.568g，是原始菌株汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3(Gluconacetobacter hansenii HDM1-3)产量的3.918倍，是仅经过硫酸二乙酯诱变高产突变株Br-3产量的1.83倍。而且经试验验证，汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hanseniiHDCo-5)具有细菌纤维素高产的稳定遗传性。本发明为将来大规模、产业化的生产细菌纤维素，为降低细菌纤维素的生产成本，为细菌纤维素在各领域的推广应用奠定了物质基础。
汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3(Gluconacetobacter hansenii HDM1-3)为汉氏葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter hansenii)，属于葡糖醋酸杆菌属(Gluconacetobacter)；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市，武汉大学，保藏日期为2010年12月5日，保藏号为CCTCCNO：M2010332。
细菌纤维素高产菌株汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)为汉氏葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter hansenii)，属于葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)；保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2012年6月15日，保藏编号为CCTCC NO:M2012234。
附图说明
图1是汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)、汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3(Gluconacetobacter hansenii HDM1-3)和突变株Br-3在细菌纤维素发酵过程中D-葡萄糖酸生成量图。
图2是汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)、汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3(Gluconacetobacter hansenii HDM1-3)和突变株Br-3在细菌纤维素发酵过程中丙酮酸的生成量图。
图3是汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)、汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3(Gluconacetobacter hansenii HDM1-3)和突变株Br-3在细菌纤维素发酵过程中柠檬酸的消耗量图。
图4是汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)菌株的光学显微镜观察图。
图5是汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3菌株的光学显微镜观察图。
图6是汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)产细菌纤维素膜的SEM图。
图7是汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3产细菌纤维素膜的SEM图。
图8是汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)和相近菌株的16SrDNA序列进行同源性比对构建的系统发育树图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式获得汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hanseniiHDCo-5)。
汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3(Gluconacetobacter hansenii HDM1-3)，简称M；由黑龙江大学生命科学学院食品分析验室从糜烂猕猴桃中分离获得并提供进行保藏。
一、取培养23～24h、一定体积(约3mL)的汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3菌种子培养液置于于离心管中，然后在5000r/min条件下离心5min，弃上清液，加入磷酸缓冲液(pH7.2)洗涤菌体2次，加入适量的磷酸缓冲液制成菌悬液，再将菌悬液置于漩涡振荡器上震荡打散菌体；待菌体分散均匀后，取少量菌液滴在血球计数板板上，在显微镜下计数，并调整汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3菌悬液浓度至107～108cfu/mL；
二、硫酸二乙酯化学诱变
取9mL步骤一调整后的汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3菌悬液与1mL、浓度为2％的硫酸二乙酯混合均匀，置于摇床中以120r/min的转速振荡处理45min，再加入0.5mL Na2S2O3终止反应10min；
三、菌株初次筛选
取100μL经过硫酸二乙酯化学诱变的菌悬液涂布于含不同浓度梯度的NaBr-NaBrO3固体筛选平板上，于28℃暗箱培养3～4天，取长势良好的单菌落，再一次涂在含相同浓度NaBr-NaBrO3的平板上富集培养，用于排除恢复突变株的产生；从2次NaBr-NaBrO3筛选平皿中挑取菌种，接种于液体种子培养基(液体种子培养基按重量百分比由2％的蔗糖、0.3％的酵母膏、0.5％的蛋白胨、0.2％的KH2PO4、0.015％的MgSO4和余量的蒸馏水组成，自然pH，115℃高压灭菌30min)中，充分震荡混匀后置于转速为150r/min的摇床中28℃震荡培养24h，再以7％的接种量从液体种子培养液中接转至基础发酵培养基(基础发酵培养基按重量百分比由5％的葡萄糖、0.5％的酵母膏、0.5％的蛋白胨、0.1％的柠檬酸、0.2％的Na2HPO4·12H2O、0.1％的K2HPO4、0.025％的MgSO4和余量的蒸馏水组成，调解pH值至5.8，115℃高压灭菌30min)中，在28℃静止培养7d后测定各突变菌株的细菌纤维素产量；其中，细菌纤维素产量最高的突变株细菌纤维素干重产量为0.857g/L，较M产量提高了114％，被命名为突变株Br-3；
四、60Co-γ诱变
将突变株Br-3制成浓度至107～108cfu/mL的突变株Br-3菌悬液，然后进行60Co-γ诱变，60Co-γ辐射剂量为550Gy，剂量率为50Gy/min；
五、菌株二次筛选
取100μL经过60Co-γ诱变的菌悬液涂布于含不同浓度梯度的NaBr-NaBrO3固体筛选平板上，于28℃暗箱培养3～4天，取长势良好的单菌落，再一次涂在含相同浓度NaBr-NaBrO3的平板上富集培养，用于排除恢复突变株的产生；从2次NaBr-NaBrO3筛选平皿中挑取一环菌种，接种于液体种子培养基(液体种子培养基按重量百分比由2％的蔗糖、0.3％的酵母膏、0.5％的蛋白胨、0.2％的KH2PO4、0.015％的MgSO4和余量的蒸馏水组成，自然pH，115℃高压灭菌30min)中，充分震荡混匀后置于转速为150r/min的摇床中28℃震荡培养24h，再以7％的接种量从液体种子培养液中接转至基础发酵培养基(基础发酵培养基按重量百分比由5％的葡萄糖、0.5％的酵母膏、0.5％的蛋白胨、0.1％的柠檬酸、0.2％的Na2HPO4·12H2O、0.1％的K2HPO4、0.025％的MgSO4和余量的蒸馏水组成，调解pH值至5.8，115℃高压灭菌30min)中，在28℃静止培养7d后测定各突变菌株的细菌纤维素产量；其中，细菌纤维素产量最高的突变株每升基础发酵培养基产细菌纤维素干重达1.568g，是M产量的3.918倍，是突变株Br-3产量的1.83倍，然后对该突变株的16s rDNA进行提取、测序、比对和鉴定(如图8)，确定该菌株属于葡糖醋酸杆菌属(Gluconacetobacter)，为一株汉氏葡糖醋杆菌新菌株，被命名为汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)。
本实施方式中NaBr-NaBrO3固体筛选平板中的筛选培养基按重量百分比由3％的葡萄糖、0.5％的酵母膏、0.5％的蛋白胨、0.1％的柠檬酸、0.2％的Na2HPO4·12H2O、0.1％的K2HPO4、0.025％的MgSO4、2％的琼脂、NaBr和NaBOr3，以及余量的蒸馏水组成，pH值5.8，115℃高压灭菌30min；其中NaBr与NaBOr3的摩尔比为5:1，NaBr的浓度范围为5～25μmol/mL。
汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)经12代的传代培养后，细菌纤维素产量(干重)持续稳定在1.568g/L±0.06g/L左右。汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)传代培养T检验结果见表1所示，12代的细菌纤维素平均产量sig值<0.01，表明突变菌株已具有稳定遗传性。
表1
细菌纤维素的生物合成是一个复杂的过程，作为细菌纤维素产生菌新陈代谢过程中的次级代谢物——细菌纤维素的合成需要多种源于初级代谢的前导物和协同因子、能量和还原力；因此常规的不具有针对性的诱变方法难以获得高产细菌纤维素菌株。本发明选择硫酸二乙酯和60Co-γ对汉氏葡糖醋杆菌进行复合诱变，而且确定了合适的诱变条件，才使高产细菌纤维素产生菌的获得成为现实，这与多年的实验和潜心研究密不可分。
本实施方式汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)为革兰氏阴性，在显微镜下观察为椭球或杆状，以单个或成对呈现，罕见成链，菌体大小范围在2.1～1.0μm×0.9～0.5μm之间，其中长度较多集中在1.5μm左右，如图4所示；菌体长度总体水平上小于原始菌株汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3，汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3菌体主要呈长杆状，大小为2.8～1.0μm×1.0～0.5μm如图5所示。汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5与原始菌株汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3在菌体形态上发生了一定程度的变化。
汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)产细菌纤维素膜的SEM图如图6所示；汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3产细菌纤维素膜的SEM图如图7所示；对比发现，汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)产细菌纤维素的纤维丝纤细，纤维缠绕程度实密。
从新陈代谢流量途径上分析，有机酸等代谢副产物合成量降低，则会有更多碳源流量进入菌体生长和细菌纤维素(BC)合成途径，从而减少能量无效消耗，增加有效途径流量，进而增加BC产量。所以降低发酵环境的pH值，抑制菌体有机酸的代谢，是增加BC产量，提高碳源利用率的有效途径。但是酸性环境会导致菌体代谢紊乱，影响产细菌纤维素菌体的正常生理代谢，致使菌体存活率降低。本实施方式汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacterhansenii HDCo-5)具有耐酸性，可在pH值为2.5～7.5的环境中产细菌纤维素，据类似报道，该种属的其他菌株的pH耐酸极值仅为3.5。本试验诱变得到的高产菌不但能够保持高存活率，而且可加快BC合成速率，减少能量无效消耗，提高碳源有效利用率。
实施例1、利用汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)生产细菌纤维素。
一、将经12代传代培养的汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)活化后接入到液体种子培养基(液体种子培养基按重量百分比由2％的蔗糖、0.3％的酵母膏、0.5％的蛋白胨、0.2％的KH2PO4、0.015％的MgSO4和余量的蒸馏水组成，自然pH，115℃高压灭菌30min)，然后在28℃、150r/min的条件下振荡培养24h，再以7％的接种量接入基础发酵培养基(基础发酵培养基按重量百分比由5％的葡萄糖、0.5％的酵母膏、0.5％的蛋白胨、0.1％的柠檬酸、0.2％的Na2HPO4·12H2O、0.1％的K2HPO4、0.025％的MgSO4和余量的蒸馏水组成，调解pH值至5.8，115℃高压灭菌30min)中，接种后在漩涡振荡器上充分振荡，使菌体均匀分散于培养基中，于28℃恒温静置培养7d。
二、恒温静置培养7d后生成的细菌纤维素膜浮于基础发酵培养基液面；细菌纤维素膜取出后，首先用水多次冲洗，以除去细菌纤维素膜表面培养基及杂质；再将细菌纤维素膜浸泡在浓度为0.1mol/L的NaOH溶液中于100℃煮沸20min，以去除液细菌纤维素膜中的菌体和残留培养基，若NaOH溶液从透明澄清转变为黄褐色则重新更换NaOH溶液继续蒸煮至20min；之后取出细菌纤维素膜再用蒸馏水多次冲洗，用pH试纸轻压膜测pH值，多余碱液用浓度为0.5％的醋酸进行中和至pH值7.2；而后于80℃干燥至恒重，即获得汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)生产的细菌纤维素。
汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)分为5组进行试验，每升培养基产细菌纤维素干重平均为1.568g，细菌纤维素膜平均厚为1.0cm。
实施例2、用汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3(Gluconacetobacter hansenii HDM1-3)，并采用与实施例1相同的方法生产细菌纤维素。
汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3(Gluconacetobacter hansenii HDM1-3)每升基础发酵培养基产细菌纤维素干重平均为0.4g，细菌纤维素膜平均厚为1.0cm。
实施例3、用突变株Br-3，并采用与实施例1相同的方法生产细菌纤维素。
突变株Br-3每L基础发酵培养液产细菌纤维素干重达0.857g，细菌纤维素膜厚为0.7cm。
实施4、对汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)、汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3(Gluconacetobacter hansenii HDM1-3)和突变株Br-3进行比较分析
一、进行AFLP选择性扩增，对差异性基因进行比较分析
汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)有2条不同于M和突变株Br-3的特异条带，分别命名为HD-c1(如SEQ ID NO：1所示)和HD-c2(如SEQ ID NO：2所示)。
对差异条带HD-c1进行比对，结果显示HD-c1基因序列编码的氨基酸片段与Gluconacetobacter hansenii ATCC23769的acsD基因所编码的蛋白质具有92％的相似度。有研究表明细菌纤维素合成菌株的acsD基因并不是直接参与细菌纤维素体内合成的必须基因，而acsD基因被插入失活后细菌纤维素合成产量将降低40％，其合成的细菌纤维素结构发生了变化，所以也认为acsD基因参与了细菌纤维素的合成过程。由于汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)在acsD处产生了突变位点进而使其编码的氨基酸序列也产生了一定的变化，这种变化可能使体合成的纤维素更为高效的在体外进行折叠组装。
对差异条带HD-c2(缺失基因序列)进行比对，结果显示HD-c2基因序列与Gluconacetobacter hansenii ATCC23769的UDPG-4-差向异构酶有98％的同源相似性。UDPG-4-差向异构酶是生成UDPG的酶，在汉氏葡糖醋酸杆菌中，UDPG是合成细菌纤维素的底物，可以推测汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)的细菌纤维素产量的增高是因为催化产生UDPG的酶系代谢活性增强所致。
二、胞外代谢物产生量的比较分析
1、各菌株在细菌纤维素发酵过程中D-葡萄糖酸的生成量如图1所示。
汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)在发酵终点前期D-葡萄糖酸生成量稳定在11.00mg/100mL左右，且生成量最低，当到达发酵终点时测得D-葡萄糖酸产量仅为49.58mg/100mL，与M相比D-葡萄糖酸总生成量降低了45.21％。
以上结果显示代谢初期D-葡萄糖酸在原始菌株(M)与突变株Br-3都仅有较少的积累，伴随着培养时间的延长D-葡萄糖酸的生成量呈现出差异，汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)的D-葡萄糖酸的积累量最少。Peter De Wulf等已研究表明碳源仅有部分用以转化为细菌纤维素，随着发酵的进行，代谢过程中有机酸的分泌则破坏了细胞的正常生长和纤维素合成的最适pH，其中以葡萄糖酸的影响最为显著，此研究成果与本实施例结果一致。而在差异基因分析中，汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacterhansenii HDCo-5)产生的未知差异基因可能参与了葡萄糖酸的合成；汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)的胞外D-葡萄糖酸积累量减少，对pH的影响最小，推测汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)中的未知基因序列HD-c2可能是编码用于葡萄糖酸合成的前体物或酶类，其突变造成前体物合成量减少或酶活降低，使D-葡萄糖酸的生成量减少，从而使菌株有一个相对稳定的pH值环境，有利于菌体的生长和细菌纤维素的合成，使汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)成为细菌纤维素高产菌株。
2、各菌株在细菌纤维素发酵过程中丙酮酸的生成量如图2所示。
发酵初期在发酵液中均未检测到丙酮酸的积累，当到达发酵终点时，胞外丙酮酸积累量最少的是汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)，其胞外丙酮酸积累量仅为2.35mg/100mL。
汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)存在缺失基因序列(差异条带HD-c2)，这里所指的缺失基因并非该段基因的真正意义的剔除，这是由于突变位点的产生导致酶切位点的变化，从而该基因没有在相应位置出现，导致视觉上的缺失。而在代谢物检测中丙酮酸在胞外出现了积累量上的差异，推测可能与这段未知基因存在某种联系。在汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)中差异条带HD-c2片段可能存在加速磷酸戊糖途径向细菌纤维素合成途径转换，而不会有丙酮酸的过量合成。
3、各菌株在细菌纤维素发酵过程中柠檬酸的消耗量如图3所示。
试验中柠檬酸做为培养基添加成分，实测添加值为18.94mg/100mL。在发酵过程中M对柠檬酸的消耗几乎保持不变，消耗量维持在2.00mg/100mL左右；而在发酵第1d突变菌株对柠檬酸也有不同程度的消耗，其中以汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hanseniiHDCo-5)柠檬酸消耗量最高，达到3.03mg/100mL，较M多消耗了1.13mg。发酵至第4d时，汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)柠檬酸消耗量却转变为2.94mg/100mL，与发酵第1d的数据对比汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hanseniiHDCo-5)出现了少量的柠檬酸合成。当到达发酵终点时，结果显示在后期的代谢阶段M合成了1.50mg/100mL的柠檬酸，说明在发酵后期M参与进行了柠檬酸的合成反应，而汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)在发酵结束时，柠檬酸的总累积消耗量最多是M的2.5倍，说明汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)在发酵中期经历短暂合成到后期柠檬酸再次被利用参与代谢循环。
实验证实细菌纤维素生物合成过程中胞外的H+浓度高低对其产量影响较大，胞外酸浓度过高不利于菌株进行纤维素的合成，符合本发明进行目的突变株的筛选条件。
Claims (1)
1.一株细菌纤维素高产菌，其特征在于细菌纤维素高产菌为汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2012234。
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| CN104164380A (zh) | 2014-11-26 |
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