CN104152503A - 一种提高异养下微藻脂肪酸产率的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提高微藻脂肪酸产率的方法，所述方法包括以下步骤：a.将微藻在自养培养基中扩大培养获得足够藻种；b.将步骤a所述藻种接种到磷限制异养培养基中；c.进行磷限制异养培养。
Description
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，涉及一种提高异养下微藻脂肪酸产率的方法。
背景技术
生物柴油即脂肪酸甲酯，是一种生物质能源，具有可再生的特点。它主要来源于产油作物，如大豆、葵花籽等，但产量低、成本高、与其他农作物争夺土地等缺点限制了其进一步发展。一部分微藻富含油脂，由于其生长周期短且无需占用耕地，成为生物柴油的新来源。
现今，关于微藻产油的研究多数是采用光自养培养方式。但是由于光自养培养对光的要求高，导致细胞密度低，而异养培养则可以克服这一缺点。异养培养无需光照，只需要添加葡萄糖等有机物作为碳源。目前异养微藻培养的研究主要是生产生物柴油、生产健康食品和处理废水。
其中异养在生产生物柴油这一方面有以下优点：(1)不受环境和气候等条件的限制；(2)生物量产率远高于自养，可获得极高的细胞浓度；(3)脂肪酸含量高于自养培养；(4)相比较于自养培养，异养培养的藻细胞脂肪酸组成更适用于生产生物柴油。
在进一步提高微藻脂肪酸含量方面，氮缺乏是被采用最多的方法之一。但是氮缺乏在提高脂肪酸含量的同时也会导致生物量产率的下降，进而导致脂肪酸产率提高甚微甚至下降。因此需要探索其他可应用在异养条件下提高微藻脂肪酸产率的方法。
发明内容
为了解决现有技术中微藻脂肪酸产率不高的技术难题，本发明的目的是提供一种提高异养下脂肪酸产率的微藻方法。
在一个方面，本发明提供一种提高微藻脂肪酸产率的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将微藻在自养培养基中扩大培养获得足够藻种；
b.将步骤a所述藻种接种到磷限制异养培养基中；
c.进行异养培养。
在一个实施方案中，所述微藻为绿藻门小球藻属(Chlorella)。
在一个实施方案中，所述微藻为普通小球藻(Chlorella vulgaris)。
在一个实施方案中，所述微藻自养培养基为BG-11培养基。
在一个实施方案中，所述微藻异养培养基为添加了葡萄糖的BG-11培养基，其中磷的浓度为0毫克每升至5毫克每升，优选1毫克每升至4毫克每升，再优选2毫克每升至3.5毫克每升，最优选3毫克每升。
在一个实施方案中，步骤b的接种比例为1∶6至1∶10，优选1∶7至1∶9，最优选1∶8。
在一个实施方案中，所述微藻异养培养基包含以下各项中的一种或多种：葡萄糖、NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、Na2CO3、CaCl2、一水合柠檬酸、柠檬酸铁铵、Na2EDTA、H3BO3、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O和Na2MoO4·2H2O等。
在一个实施方案中，葡萄糖的含量为：0g/L至10g/L，优选2g/L至10g/L，再优选4g/L至10g/L，最优选10g/L。
在一个实施方案中，NaNO3的含量为：0mg/L至1500mg/L。
在一个实施方案中，K2HPO4·3H2O的含量为：0mg/L至50mg/L，优选20mg/L至50mg/L，再优选30mg/L至40mg/L，最优选37mg/L。
在一个实施方案中，MgSO4·7H2O的含量为：60mg/L至90mg/L，优选65mg/L至85mg/L，再优选60mg/L至80mg/L，最优选75mg/L。
在一个实施方案中，Na2CO3的含量为：10mg/L至30mg/L，优选15mg/L至25mg/L，再优选18mg/L至22mg/L，最优选20mg/L。
在一个实施方案中，CaCl2的含量为：20mg/L至40mg/L，优选20mg/L至30mg/L，再优选25mg/L至30mg/L，最优选27mg/L。
在一个实施方案中，一水合柠檬酸的含量为：3mg/L至10mg/L，优选5mg/L至10mg/L，再优选5mg/L至8mg/L，最优选6mg/L。
在一个实施方案中，柠檬酸铁铵的含量为：3mg/L至10mg/L，优选5mg/L至10mg/L，再优选5mg/L至8mg/L，最优选6mg/L。
在一个实施方案中，Na2EDTA的含量为：0mg/L至2.0mg/L，优选0.5mg/L至2.0mg/L，再优选0.5mg/L至1.5mg/L，最优选1mg/L。
在一个实施方案中，H3BO3的含量为：0μg/L至5μg/L，优选2μg/L至4μg/L，再优选2.5μg/L至3.0μg/L，最优选2.86μg/L。
在一个实施方案中，MnCl2·4H2O的含量为：1μg/L至3μg/L，优选1μg/L至2μg/L，再优选1.5μg/L至2μg/L，最优选1.81μg/L。
在一个实施方案中，ZnSO4·7H2O的含量为：0.1μg/L至0.5μg/L，优选0.1μg/L至0.4μg/L，再优选0.20μg/L至0.25μg/L，最优选0.222μg/L。
在一个实施方案中，CuSO4·5H2O的含量为：0.05μg/L至0.15μg/L，优选0.05μg/L至0.10μg/L，再优选0.07μg/L至0.09μg/L，最优选0.079μg/L。
在一个实施方案中，CoCl2·6H2O的含量为：0.03μg/L至0.10μg/L，优选0.03μg/L至0.08μg/L，再优选0.04μg/L至0.06μg/L，最优选0.050μg/L。
在一个实施方案中，Na2MoO4·2H2O的含量为：0.2μg/L至0.6μg/L，优选0.2μg/L至0.5μg/L，再优选0.3μg/L至0.5μg/L，最优选0.39μg/L。
在一个实施方案中，步骤c的培养条件包括：22至26摄氏度的温度，优选23至25摄氏度，最优选24摄氏度。
在一个实施方案中，步骤c的培养条件包括：6.0至8.0的pH值，优选6.5至7.5，再优选6.8至7.2，最优选7.0的pH值。
在一个实施方案中，所述方法还包括将异养培养中的微藻细胞冷冻干燥成藻粉，用于提取胞内活性物质。
在一个实施方案中，磷限制异养培养持续时间为3至25天，优选4至20天，再优选5至15天，再优选6至10天，再优选7至9天，再优选8天。
相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：
(1)经过八天磷限制下的异养培养，微藻脂肪酸甲酯含量(脂肪酸甲酯g/细胞干重g)大大提高。有氮条件下，脂肪酸含量从14％提高到44％，。缺氮条件下脂肪酸含量从14％提高到87％。
(2)生物量产率相比较于磷充足条件几乎无下降。
(3)相比较于磷充足条件下，脂肪酸产率增加。有氮条件下提高了48％，缺氮条件下提高了9％。
附图说明
图1实施例1生物量的变化情况。
图2实施例1脂肪酸含量及产率变化情况。
图3实施例2生物量的变化情况。
图4实施例2脂肪酸含量及产率变化情况。
具体实施方式
为了解决现有技术中的问题，本发明提供的具体实施方式是：
将自养培养获得的微藻作为藻种接种到异养培养基中培养，通过控制异养培养基中磷的浓度，达到既不使生物量产率下降同时提高脂肪酸含量的效果。
在一个实施方案中，所述方法的具体步骤如下：
(1)自养条件下扩大培养获得足够藻种
(2)将步骤(1)所述藻种接种到特定的异养培养基中；
(3)进行磷限制下的异养培养。
在一个实施方案中，所述微藻为绿藻门小球藻属中的普通小球藻(Chlorella vulgaris)。
在一个实施方案中，所述微藻自养培养基为BG-11培养基。
在一个实施方案中，所述微藻异养培养基为添加了葡萄糖的BG-11培养基，其中磷的浓度约为3毫克每升。
在一个实施方案中，所述微藻异养培养时在1L锥形瓶中加入0.7L异养培养基，接种比例为1∶8。
在一个实施方案中，所述异养培养可在摇床和磁力搅拌器上进行。
在一个实施方案中，所述自养培养基的组成成分如下：NaNO31500mg/L，K2HPO4·3H2O40mg/L，MgSO4·7H2O75mg/L，Na2CO320mg/L，CaCl227mg/L，一水合柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，Na2EDTA1mg/L，1mL微量金属溶液(※微量金属溶液：H3BO32.86mg/L，MnCl2·4H2O1.81mg/L，ZnSO4·7H2O0.222mg/L，CuSO4·5H2O0.079mg/L，CoCl2·6H2O0.050mg/L，Na2MoO4·2H2O0.39mg/L)
在一个实施方案中，所述异养培养基的组成成分如下：葡萄糖4～10g/L，NaNO30～1500mg/L，K2HPO4·3H2O25mg/L，MgSO4·7H2O75mg/L，Na2CO320mg/L，CaCl227mg/L，一水合柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，Na2EDTA1mg/L，1mL微量金属溶液(※微量金属溶液：H3BO32.86mg/L，MnCl2·4H2O1.81mg/L，ZnSO4·7H2O0.222mg/L，CuSO4·5H2O0.079mg/L，CoCl2·6H2O0.050mg/L，Na2MoO4·2H2O0.39mg/L)
在一个实施方案中，所述培养条件包括：温度24±2℃，pH值6.0-8.0。
在一个实施方案中，所述方法还包括将异养培养中的微藻细胞冷冻干燥成藻粉，用于提取胞内活性物质。
在一个具体实施方式中，本发明采用普通小球藻，培养基为BG-11培养基。
将配制好的BG-11培养基加入1L光合反应器中，每瓶分装0.6L，然后高压蒸汽灭菌(121℃，20分钟)，当培养基降温至室温左右时，在超净工作台中按照10％的比例接入微藻开始自养扩大培养，培养时间为7d，CO2与空气的混合气体在反应器顶端通过0.22μm的滤器除菌后进入反应器。曝气速率为0.5v/v/min，其中CO2浓度为4％。
离心收集(6000转每分钟，离心5分钟)扩大培养获得的微藻并再悬浮于适量异养培养基中待用。
将配制好的异养培养基加入1L锥形瓶中，每瓶分装0.7L，然后高压蒸汽灭菌(121℃，20分钟)，当培养基降温至室温左右时，在超净工作台中将过膜除菌的葡萄糖浓缩液添加到培养基中混匀，接着按照1∶8的比例接入上述再悬浮的藻种开始异养培养，培养时间为8d，搅拌速率为100转每分钟。在培养第四天的时候补加约3毫克每升的磷，达到磷限制的状态。
本文中涉及到细胞干重、脂肪酸含量以及产率的测定和计算方法如下：
藻细胞干重测定：先将0.45μm的醋酸纤维膜烘至恒重，记录质量为m0(g)在细胞培养过程中取藻液VmL，将其抽滤过膜，再次烘至恒重，记录质量为m1(g)。藻体干重C可根据下式计算：C(g/L)＝(m1-m0)*1000/V。
脂肪酸含量与组成测定：称取25mg冷冻干燥后的干藻粉于消解管中，加入2mL酯化试剂(乙酰氯∶甲醇＝1∶9，现用现配)，80℃水浴反应2.5小时。冷却至室温后加入1mL质量分数为0.58％NaCl溶液停止酯化反应。紧接着再加入2mL正己烷(溶有苯甲酸甲酯作为标准物质，浓度为0.36mg/ml)，充分混匀后低转速离心，溶液分层之后取上清液进行气相分析。
脂肪酸产率：由生物量和脂肪酸含量计算得出。
实施例
实施例1有氮条件下磷限制对异养小球藻脂肪酸含量及产率的研究
自养培养基的组成成分如下：NaNO31500mg/L，K2HPO4·3H2O40mg/L，MgSO4·7H2O75mg/L，Na2CO320mg/L，CaCl227mg/L，一水合柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，Na2EDTA1mg/L，1mL微量金属溶液(※微量金属溶液：H3BO32.86mg/L，MnCl2·4H2O1.81mg/L，ZnSO4·7H2O0.222mg/L，CuSO4·5H2O0.079mg/L，CoCl2·6H2O0.050mg/L，Na2MoO4·2H2O0.39mg/L)
缺氮条件下异养培养基成分为：葡萄糖10g/L，NaNO31500mg/L，K2HPO4·3H2O0～258mg/L，MgSO4·7H2O75mg/L，Na2CO320mg/L，CaCl227mg/L，一水合柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，Na2EDTA1mg/L，1mL微量金属溶液(※微量金属溶液：H3BO32.86mg/L，MnCl2·4H2O1.81mg/L，ZnSO4·7H2O0.222mg/L，CuSO4·5H2O0.079mg/L，CoCl2·6H2O0.050mg/L，Na2MoO4·2H2O0.39mg/L)，其中磷限制培养基中K2HPO4·3H2O含量为25mg/L，磷充足培养基中K2HPO4·3H2O含量为258mg/L，磷缺乏培养基中K2HPO4·3H2O含量为0mg/L。
将配制好的自养培养基加入1L光合反应器中，每瓶分装0.6L，然后高压蒸汽灭菌(121℃，20分钟)，当培养基降温至室温左右时，在超净工作台中按照10％的比例接入微藻开始自养扩大培养，培养时间为7d，CO2与空气的混合气体在反应器顶端通过0.22μm的滤器除菌后进入反应器。曝气速率为0.5v/v/min，其中CO2浓度为4％。
离心收集(6000转每分钟，离心5分钟)扩大培养获得的微藻并再悬浮于适量有氮条件下的异养培养基中待用。
将配制好的异养培养基(一共三种)加入1L锥形瓶中，每瓶分装0.7L，然后高压蒸汽灭菌(121℃，20分钟)，当培养基降温至室温左右时，在超净工作台中将过膜除菌的葡萄糖浓缩液添加到培养基中混匀，接着按照1∶8的比例接入上述再悬浮的藻种开始异养培养，培养时间为8d，搅拌速率为100转每分钟。磷限制条件须在培养第四天的时候补加约3毫克每升的磷。
经过八天异养培养，磷限制状态下的生物量产率为526mg/L/d，相比较于磷充足状态(543mg/L/d)几乎无下降，且远高于磷缺乏状态(仅72mg/L/d)。脂肪酸含量高达43.7％，高于磷充足状态下的29.1％。最终脂肪酸产率为244mg/L/d，比磷充足状态提高了48％，比磷缺乏状态提高了294％。
实施例2缺氮条件下磷限制对异养小球藻脂肪酸含量及产率的研究
自养培养基的组成成分如下：NaNO31500mg/L，K2HPO4·3H2O40mg/L，MgSO4·7H2O75mg/L，Na2CO320mg/L，CaCl227mg/L，一水合柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，Na2EDTA1mg/L，1mL微量金属溶液(※微量金属溶液：H3BO32.86mg/L，MnCl2·4H2O1.81mg/L，ZnSO4·7H2O0.222mg/L，CuSO4·5H2O0.079mg/L，CoCl2·6H2O0.050mg/L，Na2MoO4·2H2O0.39mg/L)
缺氮条件下异养培养基成分为：葡萄糖10g/L，K2HPO4·3H2O0～258mg/L，MgSO4·7H2O75mg/L，Na2CO320mg/L，CaCl227mg/L，一水合柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，Na2EDTA1mg/L，1mL微量金属溶液(※微量金属溶液：H3BO32.86mg/L，MnCl2·4H2O1.81mg/L，ZnSO4·7H2O0.222mg/L，CuSO4·5H2O0.079mg/L，CoCl2·6H2O0.050mg/L，Na2MoO4·2H2O0.39mg/L)，其中磷限制培养基中K2HPO4·3H2O含量为25mg/L，磷充足培养基中K2HPO4·3H2O含量为258mg/L，磷缺乏培养基中K2HPO4·3H2O含量为0mg/L。
将配制好的自养培养基加入1L光合反应器中，每瓶分装0.6L，然后高压蒸汽灭菌(121℃，20分钟)，当培养基降温至室温左右时，在超净工作台中按照10％的比例接入微藻开始自养扩大培养，培养时间为7d，CO2与空气的混合气体在反应器顶端通过0.22μm的滤器除菌后进入反应器。曝气速率为0.5v/v/min，其中CO2浓度为4％。
离心收集(6000转每分钟，离心5分钟)扩大培养获得的微藻并再悬浮于适量缺氮条件下的异养培养基中待用。
将配制好的异养培养基加入1L锥形瓶中，每瓶分装0.7L，然后高压蒸汽灭菌(121℃，20分钟)，当培养基降温至室温左右时，在超净工作台中将过膜除菌的葡萄糖浓缩液添加到培养基中混匀，接着按照1∶8的比例接入上述再悬浮的藻种开始异养培养，培养时间为8d，搅拌速率为100转每分钟。磷限制条件须在培养第四天的时候补加约3毫克每升的磷。
经过八天异养培养，磷限制状态下的生物量产率为113mg/L/d，高于磷充足状态(104mg/L/d)和磷缺乏状态(81mg/L/d)。脂肪酸含量为86.8％，同样高于磷充足状态(84.4％)和磷缺乏状态(84.2％)。最终脂肪酸产率为134mg/L/d，比磷充足状态提高了9％，比磷缺乏状态提高了29％。
Claims (10)
1.一种提高微藻脂肪酸产率的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将微藻在自养培养基中扩大培养获得足够藻种；
b.将步骤a所述藻种接种到磷限制异养培养基中；
c.进行磷限制异养培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微藻为绿藻门小球藻属(Chlorella)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述微藻为普通小球藻(Chlorella vulgaris)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述微藻自养培养基为BG-11培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述微藻异养培养基为添加了葡萄糖的BG-11培养基，其中磷的浓度为0毫克每升至5毫克每升。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b的接种比例为1∶6至1∶10。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述微藻异养培养基包含以下各项中的一种或多种：葡萄糖、NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、Na2CO3、CaCl2、一水合柠檬酸、柠檬酸铁铵、Na2EDTA、H3BO3、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O和Na2MoO4·2H2O。
8.根据权利要求1所述的方法，其中：
葡萄糖的含量为：0g/L至10g/L；和/或
NaNO3的含量为：0mg/L至1500mg/L；和/或
K2HPO4·3H2O的含量为：0mg/L至37mg/L；和/或
MgSO4·7H2O的含量为：60mg/L至90mg/L；和/或
Na2CO3的含量为：10mg/L至30mg/L；和/或
CaCl2的含量为：20mg/L至40mg/L；和/或
一水合柠檬酸的含量为：3mg/L至10mg/L；和/或
柠檬酸铁铵的含量为：3mg/L至10mg/L；和/或
Na2EDTA的含量为：0mg/L至2.0mg/L；和/或
H3BO3的含量为：0μg/L至5μg/L；和/或
MnCl2·4H2O的含量为：1μg/L至3μg/L；和/或
ZnSO4·7H2O的含量为：0.1μg/L至0.5μg/L；和/或
CuSO4·5H2O的含量为：0.05μg/L至0.15μg/L；和/或
CoCl2·6H2O的含量为：0.03μg/L至0.10μg/L；和/或
Na2MoO4·2H2O的含量为：0.2μg/L至0.6μg/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤c的培养条件包括：22至26摄氏度的温度，和/或6.0至8.0的pH值。
10.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括将异养培养中的微藻细胞冷冻干燥成藻粉，用于提取胞内活性物质。
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