CN104151390B

CN104151390B - 从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法及其应用

Info

Publication number: CN104151390B
Application number: CN201410383292.1A
Authority: CN
Inventors: 岳会兰; 赵晓辉; 邵赟; 梅丽娟; 王启兰; 陶燕铎
Original assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Current assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Priority date: 2014-08-06
Filing date: 2014-08-06
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2034-08-06
Also published as: CN104151390A

Abstract

本发明涉及一种从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，该方法包括以下步骤：⑴将异叶青兰切段后用乙醇进行回流提取，得到提取液；该提取液经减压浓缩，即得提取物；⑵所述提取物用乙酸乙酯在常温条件下进行萃取，得到萃取液，该萃取液经减压浓缩，得到乌苏甲酯粗提物；⑶将所述乌苏甲酯粗提物溶解于乙酸乙酯中，然后加入硅胶拌样，溶剂乙酸乙酯挥干后，干法上硅胶柱二次，经减压浓缩后，得到较纯乌苏甲酯；⑷所述较纯乌苏甲酯用乙醇溶解后结晶除杂，经过滤即得乌苏甲酯晶体。本发明工艺简单、操作简便且分离效率和分离纯度高。同时，本发明所得的乌苏甲酯晶体可应用在肿瘤和急性肝损伤疾病治疗中。

Description

从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种天然活性成分的制备方法与应用，尤其涉及从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法及其应用。

背景技术

异叶青兰(DracocephalumheterophyllumBenth.)是唇形科青兰属草本植物，又名白花枝子花、白花夏枯草、吉孜青保(藏药名)，新疆维语称马尔赞居西、祖帕尔。异叶青兰地上部分有平肝、清热作用，其气味香甜清润，闻之令人神清气爽，是维族、藏族用于治疗咳喘病和胃病的传统用药，主要用于治疗黄疽性发烧、肝热、热性病头痛、眼豁、口腔溃疡、支气管炎、高血压等多种病症。近年来，青兰属植物中的三萜类化合物由于具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、护肝、抗心律失常、免疫调节、调节血糖和降血压等多种药理活性，受到越来越多研究者的青睐。

乌苏甲酯又名熊果酸甲酯，属于五环三萜类化合物，是熊果酸羧基酯化产物。熊果酸具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗溃疡、降低血糖等多种生物学效应；熊果酸临床表现有显著而迅速降低谷丙转氨酶、血清转氨酶、消退黄疽、增进食欲、抗纤维化和恢复肝功能的作用；近年来发现熊果酸还具有抗致癌、抗促癌、诱导F9畸胎瘤细胞分化和抗血管生成作用。

国内外相关文献显示，至今尚无乌苏甲酯单体制备和活性应用的相关报导。鉴于异叶青兰中乌苏甲酯含量很高，建立一种从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法很有必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、操作简便且分离效率和分离纯度高的从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供该乌苏甲酯的应用。

为解决上述问题，本发明所述的从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，包括以下步骤：

⑴将异叶青兰切成长度为1~3cm的段，然后按1kg：9~15L的料液质量体积比加入质量浓度为85~95%的乙醇，在温度为65~75℃的条件下进行回流提取，提取次数2~3次，每次1~3h，合并得到提取液；该提取液经减压浓缩，即得提取物；

⑵所述提取物按1kg：1~2L的料液质量体积比用乙酸乙酯在常温条件下进行萃取，萃取次数为3次，每次2h，合并得到萃取液，该萃取液经减压浓缩，得到乌苏甲酯粗提物；

⑶将所述乌苏甲酯粗提物溶解于乙酸乙酯中，然后加入所述乌苏甲酯粗提物质量1~2倍的硅胶拌样，溶剂乙酸乙酯挥干后，干法上硅胶柱；其次，用3~5倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液A，该洗脱液A经减压浓缩后，得到乌苏甲酯粗品；所述乌苏甲酯粗品再次上硅胶柱，用2~4倍柱体积的所述石油醚-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液B，该洗脱液B经减压浓缩后，得到较纯乌苏甲酯；

⑷在30~60℃温度下，所述较纯乌苏甲酯按1g：20~60mL的料液质量体积比用体积浓度为90~100%的乙醇进行溶解，然后在0~25℃的条件下进行1~3次结晶除杂，经过滤即得乌苏甲酯晶体。

所述步骤⑴中的减压浓缩条件是指温度为60~70℃，真空度为0.6~0.8MPa。

所述步骤⑵和所述步骤⑶中的减压浓缩条件是指温度为40~50℃，真空度为0.6~0.8MPa。

所述步骤⑶中石油醚-乙酸乙酯混合溶剂是指将石油醚与乙酸乙酯按3~5mL：1mL的比例混合而成的溶液。

如上所述的从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法所得的乌苏甲酯晶体在肿瘤和急性肝损伤疾病治疗中的应用，其特征在于：该乌苏甲酯晶体作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、由于本发明仅涉及乌苏甲酯的提取浓缩、萃取、硅胶柱层析和结晶四个步骤，纯化过程简单，因此，工艺简单、易于操作。

2、本发明采用二次硅胶柱分离与重结晶结合的方法，将乌苏甲酯粗提物进行快速分离纯化。因此，分离效率和分离纯度高。采用本发明方法，1kg异叶青兰能得到约3.8g乌苏甲酯，纯度≧97.0%。

3、本发明方法所制得的乌苏甲酯晶体为熊果酸衍生物，其结构式如下：

；

其分析结果如下：白色针状晶体，C₃₁H₅₀O₃，EI-MS:m/z=470[M+H]⁺；¹H-NMR(Acetone，600MHz)：5.23(t,1H,J-3.5Hz,H-12)，3.57(s,CH₃,H-31)，3.34(s,1H,-OH)，3.15(dd,1H,J=3.2，8.7Hz,H-3β)，0.78(s,CH₃,H-24)，0.84(s,CH,H-23)，0.88(s,CH₃,J=6.6Hz,H-29)，0.95(s,CH₃,J=6.6Hz,H-30)，0.99(s,CH₃,H-26)，1.12(s,CH₃,H-25)，1.13(s,CH₃,H-27)；¹³C-NMR(Acetone,150MHz)：32.5(CH₂,C-1)，27.2(CH₂,C-2)，77.7(CH,C-3)，38.6(C,C-4)，55.4(CH,C-5)，18.2(CH₂,C-6)，33.1(CH₂,C-7)，39.5(C,C-8)，47.4(CH,C-9)，36.9(C,C-10)，23.0(CH₂,C-11)，125.4(CH,C-12)，138.4(C,C-13)，42.0(C,C-14)，27.8(CH₂,C-15)，24.1(CH₂,C-16)，47.6(C,C-17)，52.3(CH,C-18)，39.0(CH,C-19)，38.6(CH,C-20)，30.5(CH₂,C-21)，36.7(CH₂,C-22)，27.9(CH₃,C-23)，15.0(CH₃,C-24)，15.4(CH₃,C-25)，16.7(CH₃,C-26)，23.6(CH₃,C-27)，177.6(C,C-28)，16.8(CH₃,C-29)，2O.6(CH₃,C-3O)，56.8(CH₃，C-31)。

4、对本发明方法所制得的单体化合物乌苏甲酯晶体进行药理实验：

⑴实验材料：

a受试药物：异叶青兰提取分离得到的单体化合物乌苏甲酯（1.0g/2000.0g生药）；

b剂量设计：人临床用量10.0g生药/天，按60公斤体重计算为0.167生药/kg，按动物与人公斤等效剂量折算，小鼠用1.84g生药/kg为中剂量，相当于临床等效剂量，高剂量为中剂量的2倍，低剂量为中剂量的1/2倍，换算为单体用量分别为，高剂量1.83mg/kg，中剂量0.92mg/kg，低剂量0.46mg/kg。实验灌胃用量为0.2ml/10g。

c阳性对照药：环磷酰胺，中美合资山西泰盛制药有限公司生产，批号：0704121；肝速康胶囊，远达药业集团哈尔滨中药六厂有限公司生产，批号：20070426。

d动物CD-(ICR)小鼠，19~21g，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号为SCXK(京)2007-0001。

e瘤株：肝癌H₂₂瘤株，中国医学科学院药物研究所肿瘤室提供，本实验室传代。

f仪器：AVE型半自动生化分析仪，爱威科技实业有限公司产品；电热三用水箱，北京医疗设备厂有限责任公司生产；6K15型离心机，Sigma公司产品；微量加样器：50-200、1000ul等规格，瑞士SOCOREX生产；Sartorius电子天平，型号：BP110S，德国生产。

⑵乌苏甲酯对荷瘤（肝癌H₂₂）小鼠的影响：

取健康小鼠，体重19~21g，在无菌条件下右腋皮下接种肝癌H₂₂生理盐水瘤细胞悬液（1：7）0.2ml/只，接种后按体重随机分组，分别为荷瘤对照组，阳性药环磷酰胺组，熊果酸甲酯高、中、低剂量组，每组10只，雌雄各半，分笼饲养。

各组分别给药，荷瘤对照组给予相同体积的蒸馏水0.2ml/10g，；环磷酰胺组于接种后24小时腹腔注射给药（0.2ml/20g）；其余各组灌胃给予相应药物（0.2ml/20g），每日一次，连续13天。末次给药后24小时，各组动物颈椎脱臼处死，解剖并剥离瘤体，摘取胸腺，脾，电子天平称重，以t检验进行统计学处理，其结果参见表1。

表1单体乌苏甲酯对荷瘤小鼠的影响

注：与荷瘤对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；与环磷酰胺组比较，##P<0.01。

表1结果表明，阳性对照药环磷酰胺明显抑制荷瘤（肝癌H₂₂）小鼠瘤体重量，体重减轻；乌苏甲酯高剂量对荷瘤（肝癌H₂₂）小鼠瘤体重量有明显的抑制作用，体重增长三个剂量组均明显高于阳性对照药环磷酰胺组，三个剂量组小鼠胸腺，脾指数均高于环磷酰胺组。

⑶乌苏甲酯对四氯化碳致小鼠肝损伤的影响：

取健康小鼠，体重19~22g，按体重随机分组，分组别为正常对照组，模型对照组，阳性对照组，乌苏甲酯高、中、低三组，各组分别灌胃给予相应药物，正常组和模型组给予相同体积的蒸馏水。除正常对照组外，其余各组小鼠药后腹腔注射0.1%CCl₄花生油溶液10ml/kg一次，16小时后，小鼠眶静脉取血，离心，测血清GPT活性。以t检验进行统计学处理，其结果参见表2。

表2单体乌苏甲酯对四氯化碳致小鼠肝损伤的影响

注：与模型对照组比较，*P<0.05。

表2结果表明，乌苏甲酯单体的剂量在1.83mg/kg可明显的抑制CCl₄所致小鼠血清GPT值升高，与模型对照组相比，有显著性差异。

综上所述，本发明方法所制得的单体化合物乌苏甲酯晶体经药理实验表明，在抗肿瘤和急性肝损伤方面有一定的药用价值，可用于开发出新的具有更好药理活性的抗肿瘤和保肝药物。

具体实施方式

实施例1从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，包括以下步骤：

⑴将1kg异叶青兰切成长度为2cm的段，然后按1kg：12L的料液质量体积比加入质量浓度为90%的乙醇，在温度为70℃的条件下进行回流提取，提取次数2次，每次2h，合并得到提取液；该提取液在温度为65℃、真空度为0.7MPa的条件下经减压浓缩，即得提取物。

⑵提取物按1kg：1.5L的料液质量体积比用乙酸乙酯在常温条件下进行萃取，萃取次数为3次，每次2h，合并得到萃取液，该萃取液在温度为45℃、真空度为0.7MPa的条件下经减压浓缩，得到乌苏甲酯粗提物。

⑶将乌苏甲酯粗提物溶解于乙酸乙酯中，然后加入乌苏甲酯粗提物质量1.5倍的硅胶拌样，溶剂乙酸乙酯挥干后，干法上硅胶柱；其次，用4倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液A，该洗脱液A在温度为45℃、真空度为0.7MPa的条件下经减压浓缩后，得到乌苏甲酯粗品；乌苏甲酯粗品再次上硅胶柱，用3倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液B，该洗脱液B在温度为45℃、真空度为0.7MPa的条件下经减压浓缩后，得到较纯乌苏甲酯，其纯度为86.7%。

其中：石油醚-乙酸乙酯混合溶剂是指将石油醚与乙酸乙酯按4mL：1mL的比例混合而成的溶液。

⑷在45℃温度下，较纯乌苏甲酯按1g：40mL的料液质量体积比用体积浓度为95%的乙醇进行溶解，然后在15℃的条件下进行2次结晶除杂，经过滤即得纯度为98.1%的乌苏甲酯晶体3.8g。

实施例2从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，包括以下步骤：

⑴将2kg异叶青兰切成长度为1cm的段，然后按1kg：9L的料液质量体积比加入质量浓度为85%的乙醇，在温度为65℃的条件下进行回流提取，提取次数2次，每次1h，合并得到提取液；该提取液在温度为60℃、真空度为0.6MPa的条件下经减压浓缩，即得提取物。

⑵提取物按1kg：1L的料液质量体积比用乙酸乙酯在常温条件下进行萃取，萃取次数为3次，每次2h，合并得到萃取液，该萃取液在温度为40℃、真空度为0.6MPa的条件下经减压浓缩，得到乌苏甲酯粗提物。

⑶将乌苏甲酯粗提物溶解于乙酸乙酯中，然后加入乌苏甲酯粗提物质量1倍的硅胶拌样，溶剂乙酸乙酯挥干后，干法上硅胶柱；其次，用3倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液A，该洗脱液A在温度为40℃、真空度为0.6MPa的条件下经减压浓缩后，得到乌苏甲酯粗品；乌苏甲酯粗品再次上硅胶柱，用2倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液B，该洗脱液B在温度为40℃、真空度为0.6MPa的条件下经减压浓缩后，得到较纯乌苏甲酯，其纯度为85.4%。

其中：石油醚-乙酸乙酯混合溶剂是指将石油醚与乙酸乙酯按3mL：1mL的比例混合而成的溶液。

⑷在30℃温度下，较纯乌苏甲酯按1g：20mL的料液质量体积比用体积浓度为90%的乙醇进行溶解，然后在0℃的条件下进行1次结晶除杂，经过滤即得纯度97.5%的乌苏甲酯晶体8.2g。

实施例3从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，包括以下步骤：

⑴将3kg异叶青兰切成长度为3cm的段，然后按1kg：15L的料液质量体积比加入质量浓度为95%的乙醇，在温度为75℃的条件下进行回流提取，提取次数3次，每次3h，合并得到提取液；该提取液在温度为70℃、真空度为0.8MPa的条件下经减压浓缩，即得提取物。

⑵提取物按1kg：2L的料液质量体积比用乙酸乙酯在常温条件下进行萃取，萃取次数为3次，每次2h，合并得到萃取液，该萃取液在温度为50℃、真空度为0.8MPa的条件下经减压浓缩，得到乌苏甲酯粗提物。

⑶将乌苏甲酯粗提物溶解于乙酸乙酯中，然后加入乌苏甲酯粗提物质量2倍的硅胶拌样，溶剂乙酸乙酯挥干后，干法上硅胶柱；其次，用5倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液A，该洗脱液A在温度为50℃、真空度为0.8MPa的条件下经减压浓缩后，得到乌苏甲酯粗品；乌苏甲酯粗品再次上硅胶柱，用4倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，经薄层层析TCL检测，得到含有乌苏甲酯的洗脱液B，该洗脱液B在温度为50℃、真空度为0.8MPa的条件下经减压浓缩后，得到较纯乌苏甲酯，其纯度为90.2%。

其中：石油醚-乙酸乙酯混合溶剂是指将石油醚与乙酸乙酯按5mL：1mL的比例混合而成的溶液。

⑷在60℃温度下，较纯乌苏甲酯按1g：60mL的料液质量体积比用体积浓度为100%的乙醇进行溶解，然后在25℃的条件下进行3次结晶除杂，经过滤即得纯度97.9%的乌苏甲酯晶体13.3g。

上述实施例1~3所得的乌苏甲酯晶体作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，用于治疗肿瘤和急性肝损伤疾病。

上述实施例是对本发明的进一步详细说明，但不意味着对本发明的任何限制。在不脱离本发明上述思想的情况下，根据本领域普通技术知识和常规手段做出的各种替换方式或变更，均包含在本发明之内。

Claims

1.从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，其特征在于：所述步骤⑴中的减压浓缩条件是指温度为60~70℃，真空度为0.6~0.8MPa。

3.如权利要求1所述的从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，其特征在于：所述步骤⑵和所述步骤⑶中的减压浓缩条件是指温度为40~50℃，真空度为0.6~0.8MPa。

4.如权利要求1所述的从异叶青兰中分离制备乌苏甲酯的方法，其特征在于：所述步骤⑶中石油醚-乙酸乙酯混合溶剂是指将石油醚与乙酸乙酯按3~5mL：1mL的比例混合而成的溶液。