CN105168339B - 一种异叶青兰总多酚的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种异叶青兰总多酚的制备方法,该方法包括以下步骤:⑴提取:异叶青兰全草粉末经醇提、减压浓缩,即得异叶青兰乙醇提取物;⑵除色素:所述异叶青兰乙醇提取物溶解后萃取得到水部位萃取液;⑶粗制:所述水部位萃取液经萃取、减压浓缩,即得异叶青兰总多酚粗品;⑷精制:所述异叶青兰总多酚粗品溶解成混悬液,并用0.5mol/L的HCl溶液将其调至pH为3~4后,采用湿法上样于处理好的大孔树脂层析柱中洗脱,收集50~70%的乙醇水洗脱液;所述50~70%的乙醇水洗脱液经减压浓缩,即得异叶青兰总多酚精制品。本发明工艺简单、成本低,且所得的异叶青兰总多酚具有很好的抗氧化作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种总多酚的制备方法,尤其涉及一种异叶青兰总多酚的制备方法及其应用。
背景技术
异叶青兰(Dracocephalumheterophyllum Benth)系唇形科(Labiatae)青兰属(Dracocephalum)植物,主要分布于亚洲温带。该植物在民间被广泛应用,具有平肝、清热、治疗高血压、淋巴结炎、肺热咳嗽的作用。现代研究表明异叶青兰中的化学成分主要包括苯丙素类、黄酮类和萜类。至今未见有关异叶青兰多酚类化合物的研究报道。
研究表明:自由基的强氧化作用可导致基因突变、细胞损伤、色素形成、组织硬化。人体衰老、心脑血管疾病、糖尿病、肝硬化、炎症、癌症、息肉、肌瘤等80余种疾病都与体内氧化形成自由基密切相关。另外食物的变质、腐烂等也与氧化反应密切相关。因此抗氧化剂成为食品、药品及保健品领域的一个重要的研究内容。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、成本低的异叶青兰总多酚的制备方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供该异叶青兰总多酚的应用。
为解决上述问题,本发明所述的一种异叶青兰总多酚的制备方法,包括以下步骤:
⑴提取:异叶青兰全草粉末用其质量5~20倍且体积浓度为50~90%的乙醇水溶液在50~70℃温度下回流提取1~3次,每次3~5h,合并得到提取液,该提取液经减压浓缩,即得异叶青兰乙醇提取物;
⑵除色素:所述异叶青兰乙醇提取物用其质量30~50倍的蒸馏水溶解后加入与溶解液等体积的石油醚,在室温下萃取1~3次,每次3~5h,弃去有色素的石油醚部位萃取液,得到水部位萃取液;
⑶粗制:所述水部位萃取液中加入等体积的乙酸乙酯,在室温下萃取1~3次,每次3~5h,合并得到乙酸乙酯部位萃取液,该乙酸乙酯部位萃取液经减压浓缩,即得异叶青兰总多酚粗品;
⑷精制:所述异叶青兰总多酚粗品用其质量5~10倍的蒸馏水溶解成混悬液,并用0.5mol/L的HCl溶液将其调至pH为3~4后,采用湿法上样于处理好的大孔树脂层析柱中,先用2~3倍柱体积的浓度为20%的乙醇水溶液洗脱,以除去多糖及其他杂质;然后用50~70%的乙醇水溶液洗脱,收集50~70%的乙醇水洗脱液;所述50~70%的乙醇水洗脱液经减压浓缩,即得异叶青兰总多酚精制品。
所述步骤⑴中异叶青兰全草粉末是指将采自青海省海北州、果洛州、玉树州、海东地区的异叶青兰经阴干粉碎后,过40~60目筛所得的粉末。
所述步骤⑴、步骤⑶、步骤⑷中减压浓缩的条件均是指温度为50~70℃、压力为0.05~0.07MPa。
所述步骤⑷中大孔树脂层析柱是指NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂、D101型大孔吸附树脂、AB-8型大孔吸附树脂、HPD-500型大孔吸附树脂中的一种,该大孔树脂层析柱尺寸为80mm~100 mm×100 cm~200 cm。
所述步骤⑷中上样流速为1~2Bv/h。
所述步骤⑷中洗脱流速为3~5Bv/h。
如上所述的一种异叶青兰总多酚的制备方法制得的异叶青兰总多酚作为抗氧化剂在制备抗氧化药物或保健食品中的应用,其特征在于:该异叶青兰总多酚作为有效组分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类抗氧化药用制剂,或作为有效组分按常规方法与食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明采用乙醇水溶液回流提取,操作简便,提取率高,乙醇可回收重复利用,提取成本低。
2、本发明采用石油醚萃取除色素,溶剂价格低廉,易于获取,且溶剂可以重复利用,易于规模化生产。
3、本发明采用液液分配萃取对异叶青兰总多酚进行富集,富集效率高,杂质少,且成本低廉。
4、本发明采用大孔树脂层析柱对异叶青兰总多酚进行纯化,大孔树脂可再生重复利用,进一步降低了制备成本,且所用大孔树脂对总多酚的纯化效果好,所得总多酚纯度高。
5、本发明具有良好的稳定性和重复性,每批异叶青兰浸膏提取物的得率可达20%~30%,异叶青兰总多酚精制品的总多酚含量可达到60%以上,为异叶青兰总多酚工业化生产以及相关健康产品的开发提供科学依据。
6、本发明所获得的异叶青兰总多酚经测试,具有很好的抗氧化作用。
⑴异叶青兰总多酚清除DPPH自由基的活性:
DPPH法是体外检测抗氧化剂清除自由基最常见的方法。该方法的基本原理是DPPH在溶液中生成一个稳定的含氮自由基,且该溶液呈典型的紫色在波长517nm处具有最大的吸收光谱。当DPPH 溶液中加入抗氧化剂时,由于其自由基清除作用使DPPH 紫色消退导致吸收光谱强度减小,其变化程度与自由基清除程度呈线性关系,以此评价抗氧化剂的抗氧化能力。即抗氧化剂的清除能力越强,吸光度越小,其抗氧化能力越强。
异叶青兰总多酚清除DPPH自由基实验以α-生育酚、BHT、BHA作为阳性对照,以无水乙醇加DPPH作为阴性对照,以无水乙醇作为空白,在试管中分别加入2 mL待测样品和2mLDPPH溶液,在室温下暗处放置30min后,在517nm处测量吸光度值(A)。按照下列公式计算DPPH自由基的清除率(%):
DPPH自由基清除率(%)=(A阴性对照-A待测样品)/A阴性对照×100%
结论:50ug/mL的异叶青兰总多酚、α-生育酚、BHT、BHA对于DPPH自由基的清除率分别为88.8%、81.63%、57.35%、80.35%(参见图1)。
⑵异叶青兰总多酚清除ABTS自由基的活性:
ABTS法测定总抗氧化能力的原理是ABTS在氧化剂K2S2O8作用下氧化成绿色的ABTS▪+自由基,ABTS▪+自由基在734nm下具有最大吸收值。在有自由基清除剂存在的情况下,ABTS▪+自由基会被捕捉,在最大吸收波长下的吸光度值会降低,且下降程度呈线性关系,吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加,以此评价试验样品的抗氧化能力。此抗氧化能力用清除率来表示,清除率越大,抗氧化性越强。
异叶青兰总多酚清除ABTS自由基实验以α-生育酚、BHT、BHA作为阳性对照,以无水乙醇加ABTS作为阴性对照,以无水乙醇作为空白,在试管中加入1mL待测样品和4mLABTS▪+工作液,振摇均匀后,静置6min,在734nm处测量实验组和控制组的吸光度值,按照下列公式计算ABTS自由基的清除率(%):
ABTS自由基清除率(%)=(A阴性对照-A待测样品)/A阴性对照×100%
结论:100ug/mL的异叶青兰总多酚、α-生育酚、BHT、BHA对于ABTS自由基的清除率分别为99.3%、99.56%、93.07%、99.56%。异叶青兰总多酚对于ABTS自由基具有较好的清除作用(参见图2)。
⑶异叶青兰总多酚Fe3+离子还原能力测定:
基于氧化还原反应的比色法,在低pH溶液中,Fe3+-TPTZ(Fe3+-三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成Fe2+-TPTZ,使反应液变成深蓝色,在593 nm处有最大光吸收,通过测定样品吸光度的变化来衡量其抗氧化能力。吸光值愈高表示样品的还原力越强。
异叶青兰总多酚Fe3+离子还原能力测定实验以α-生育酚、BHT、BHA为阳性对照,在3mL FRAP工作液中加入100uL不同浓度的样品溶液,在室温下反应10min后,测定溶液在波长593nm处的吸光度值。以FeSO 4为标准物质绘制标准曲线,样品的抗氧化能力以 FRAP 值表示:1 FRAP单位= 1 mmol /L FeSO4,即样品的抗氧化能力相当于FeSO4的mmol /L 数。
结论:FeSO4标准物质在0.2mmol/L~2mmol/L浓度范围内线性关系良好,线性方程为y = 0.68006x + 0.00916,R² = 0.99951。500ug/mL的异叶青兰总多酚、α-生育酚、BHT、BHA的FRAP值分别为1.60、2.08、1.28、1.84。异叶青兰总多酚具有很好的Fe3+离子还原能力(参见图3、4)。
⑷异叶青兰总多酚脂质过氧化实验(FTC):
硫氰酸铁盐(FTC)比色法是基于在酸性条件下,脂质氧化形成的过氧化物可将Fe2+氧化成Fe3+,Fe3+与硫氰酸根离子可形成在480~515nm内有最大吸收的红色络合物。通常用500nm处吸光值的高低表示物质抗脂质过氧化的能力,吸光值越小,表明物质的抗脂质过氧化能力越强。
异叶青兰总多酚脂质过氧化实验(FTC)以α-生育酚、BHT、BHA为阳性对照,以无水乙醇加FTC作为阴性对照,以无水乙醇作为空白,在试管中分别加入1mL 50ug/mL的待测样品溶液、1mL 2.5%的亚油酸无水乙醇溶液、2mL磷酸缓冲盐和1mL蒸馏水,置于40℃的恒温培养箱中,每隔24h取0.1mL,采用硫氰酸铁比色法测定500nm处的吸光度值,当阴性对照组吸光度达到最大时,按照以下公式计算样品脂质过氧化的抑制率:
脂质过氧化抑制率(%)=(A阴性对照-A待测样品)/A阴性对照×100%
结论:50ug/mL的异叶青兰总多酚、α-生育酚、BHT、BHA对于脂质过氧化的抑制率分别为98.72%、91.45%、97.52%、93.72%(参见图5)。因此,异叶青兰总多酚具有很好的脂质过氧化抑制作用。
综上所述,本发明所得的异叶青兰总多酚具有很好的抗氧化活性,可用作食品、药品、保健品中的抗氧化剂。
⑸本发明工艺简单,环境污染小,可适用于工业化生产。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明DPPH自由基清除率。
图2为本发明ABTS自由基清除率。
图3为本发明FeSO4标准曲线。
图4为本发明Fe3+离子还原能力。
图5为本发明抑制脂质过氧化能力。
具体实施方式
实施例1 一种异叶青兰总多酚的制备方法,包括以下步骤:
⑴提取:1kg异叶青兰全草粉末用其质量5倍且体积浓度为90%的乙醇水溶液在50℃温度下回流提取1次,3h后得到提取液,该提取液在温度为50℃、压力为0.07MPa的条件下经减压浓缩,即得异叶青兰乙醇提取物120.4g。
其中:异叶青兰全草粉末是指将采自青海省海北州、果洛州、玉树州、海东地区的异叶青兰经阴干粉碎后,过40目筛所得的粉末。
⑵除色素:异叶青兰乙醇提取物用其质量30倍的蒸馏水溶解后加入与溶解液等体积的石油醚,在室温下萃取1次,每次3h,弃去有色素的石油醚部位萃取液,得到水部位萃取液。
⑶粗制:水部位萃取液中加入等体积的乙酸乙酯,在室温下萃取1次,每次3h,合并得到乙酸乙酯部位萃取液,该乙酸乙酯部位萃取液在温度为50℃、压力为0.07MPa的条件下经减压浓缩,即得异叶青兰总多酚粗品53.2g。
⑷精制:异叶青兰总多酚粗品用其质量5倍的蒸馏水溶解成混悬液,并用0.5mol/L的HCl溶液将其调至pH为3后,采用湿法上样于处理好的大孔树脂层析柱中,先用2倍柱体积的浓度为20%的乙醇水溶液洗脱,以除去多糖及其他杂质;然后用50%的乙醇水溶液洗脱,收集50%的乙醇水洗脱液;50%的乙醇水洗脱液在温度为50℃、压力为0.07MPa的条件下经减压浓缩,即得异叶青兰总多酚精制品13g。
其中:大孔树脂层析柱是指NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂,该大孔树脂层析柱尺寸为80mm×100 cm。
上样流速为1Bv/h;洗脱流速为3Bv/h。
采用Folin-Ciocalteu法测定得知本实施例中异叶青兰总多酚纯度为 67.3%。
实施例2 一种异叶青兰总多酚的制备方法,包括以下步骤:
⑴提取:1kg异叶青兰全草粉末用其质量10倍且体积浓度为70%的乙醇水溶液在60℃温度下回流提取2次,每次4h,合并得到提取液,该提取液在温度为60℃、压力为0.07MPa的条件下经减压浓缩,即得异叶青兰乙醇提取物218.3g。
其中:异叶青兰全草粉末是指将采自青海省海北州、果洛州、玉树州、海东地区的异叶青兰经阴干粉碎后,过40目筛所得的粉末。
⑵除色素:异叶青兰乙醇提取物用其质量30倍的蒸馏水溶解后加入与溶解液等体积的石油醚,在室温下萃取2次,每次3h,弃去有色素的石油醚部位萃取液,得到水部位萃取液。
⑶粗制:水部位萃取液中加入等体积的乙酸乙酯,在室温下萃取2次,每次3h,合并得到乙酸乙酯部位萃取液,该乙酸乙酯部位萃取液在温度为60℃、压力为0.07MPa的条件下经减压浓缩,即得异叶青兰总多酚粗品85.6g。
⑷精制:异叶青兰总多酚粗品用其质量7倍的蒸馏水溶解成混悬液,并用0.5mol/L的HCl溶液将其调至pH为3后,采用湿法上样于处理好的大孔树脂层析柱中,先用2倍柱体积的浓度为20%的乙醇水溶液洗脱,以除去多糖及其他杂质;然后用60%的乙醇水溶液洗脱,收集60%的乙醇水洗脱液;60%的乙醇水洗脱液在温度为60℃、压力为0.07MPa的条件下经减压浓缩,即得异叶青兰总多酚精制品20.4g。
其中:大孔树脂层析柱是指D101型大孔吸附树脂,该大孔树脂层析柱尺寸为80 mm×100 cm。
上样流速为1Bv/h;洗脱流速为5Bv/h。
采用Folin-Ciocalteu法测定得知本实施例中异叶青兰总多酚纯度为 63.56%。
实施例3 一种异叶青兰总多酚的制备方法,包括以下步骤:
⑴提取:2kg异叶青兰全草粉末用其质量10倍且体积浓度为70%的乙醇水溶液在60℃温度下回流提取2次,每次5h,合并得到提取液,该提取液在温度为70℃、压力为0.06MPa的条件下经减压浓缩,即得异叶青兰乙醇提取物541.4g。
其中:异叶青兰全草粉末是指将采自青海省海北州、果洛州、玉树州、海东地区的异叶青兰经阴干粉碎后,过60目筛所得的粉末。
⑵除色素:异叶青兰乙醇提取物用其质量50倍的蒸馏水溶解后加入与溶解液等体积的石油醚,在室温下萃取2次,每次5h,弃去有色素的石油醚部位萃取液,得到水部位萃取液。
⑶粗制:水部位萃取液中加入等体积的乙酸乙酯,在室温下萃取2次,每次5h,合并得到乙酸乙酯部位萃取液,该乙酸乙酯部位萃取液在温度为70℃、压力为0.06MPa的条件下经减压浓缩,即得异叶青兰总多酚粗品194.7g。
⑷精制:异叶青兰总多酚粗品用其质量10倍的蒸馏水溶解成混悬液,并用0.5mol/L的HCl溶液将其调至pH为4后,采用湿法上样于处理好的大孔树脂层析柱中,先用3倍柱体积的浓度为20%的乙醇水溶液洗脱,以除去多糖及其他杂质;然后用60%的乙醇水溶液洗脱,收集60%的乙醇水洗脱液;60%的乙醇水洗脱液在温度为70℃、压力为0.06MPa的条件下经减压浓缩,即得异叶青兰总多酚精制品55.6g。
其中:大孔树脂层析柱是指AB-8型大孔吸附树脂,该大孔树脂层析柱尺寸为100mm×200 cm。
上样流速为2Bv/h;洗脱流速为3Bv/h。
采用Folin-Ciocalteu法测定得知本实施例中异叶青兰总多酚纯度为68.5%。
实施例4 一种异叶青兰总多酚的制备方法,包括以下步骤:
⑴提取:2kg异叶青兰全草粉末用其质量20倍且体积浓度为50%的乙醇水溶液在70℃温度下回流提取3次,每次5h,合并得到提取液,该提取液在温度为70℃、压力为0.05MPa的条件下经减压浓缩,即得异叶青兰乙醇提取物627.8g。
其中:异叶青兰全草粉末是指将采自青海省海北州、果洛州、玉树州、海东地区的异叶青兰经阴干粉碎后,过50目筛所得的粉末。
⑵除色素:异叶青兰乙醇提取物用其质量40倍的蒸馏水溶解后加入与溶解液等体积的石油醚,在室温下萃取3次,每次4h,弃去有色素的石油醚部位萃取液,得到水部位萃取液。
⑶粗制:水部位萃取液中加入等体积的乙酸乙酯,在室温下萃取3次,每次4h,合并得到乙酸乙酯部位萃取液,该乙酸乙酯部位萃取液在温度为70℃、压力为0.05MPa的条件下经减压浓缩,即得异叶青兰总多酚粗品247.1g。
⑷精制:异叶青兰总多酚粗品用其质量5倍的蒸馏水溶解成混悬液,并用0.5mol/L的HCl溶液将其调至pH为3.5后,采用湿法上样于处理好的大孔树脂层析柱中,先用2.5倍柱体积的浓度为20%的乙醇水溶液洗脱,以除去多糖及其他杂质;然后用70%的乙醇水溶液洗脱,收集70%的乙醇水洗脱液;70%的乙醇水洗脱液在温度为70℃、压力为0.05MPa的条件下经减压浓缩,即得异叶青兰总多酚精制品83.2g。
其中:大孔树脂层析柱是指HPD-500型大孔吸附树脂,该大孔树脂层析柱尺寸为90mm×150 cm。
上样流速为1.5Bv/h;洗脱流速为4Bv/h。
采用Folin-Ciocalteu法测定得知本实施例中异叶青兰总多酚纯度为64.2%。
上述实施例1~4中制得的异叶青兰总多酚作为抗氧化剂在制备抗氧化药物或保健食品中的应用是指:该异叶青兰总多酚作为有效组分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类抗氧化药用制剂,或作为有效组分按常规方法与食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
Claims (5)
1.一种异叶青兰总多酚的制备方法,包括以下步骤:
⑴提取:异叶青兰全草粉末用其质量5~20倍且体积浓度为50~90%的乙醇水溶液在50~70℃温度下回流提取1~3次,每次3~5h,合并得到提取液,该提取液经减压浓缩,即得异叶青兰乙醇提取物;所述异叶青兰全草粉末是指将采自青海省海北州、果洛州、玉树州、海东地区的异叶青兰经阴干粉碎后,过40~60目筛所得的粉末;
⑵除色素:所述异叶青兰乙醇提取物用其质量30~50倍的蒸馏水溶解后加入与溶解液等体积的石油醚,在室温下萃取1~3次,每次3~5h,弃去有色素的石油醚部位萃取液,得到水部位萃取液;
⑶粗制:所述水部位萃取液中加入等体积的乙酸乙酯,在室温下萃取1~3次,每次3~5h,合并得到乙酸乙酯部位萃取液,该乙酸乙酯部位萃取液经减压浓缩,即得异叶青兰总多酚粗品;
⑷精制:所述异叶青兰总多酚粗品用其质量5~10倍的蒸馏水溶解成混悬液,并用0.5mol/L的HCl溶液将其调至pH为3~4后,采用湿法上样于处理好的大孔树脂层析柱中,先用2~3倍柱体积的浓度为20%的乙醇水溶液洗脱,以除去多糖及其他杂质;然后用50~70%的乙醇水溶液洗脱,收集50~70%的乙醇水洗脱液;所述50~70%的乙醇水洗脱液经减压浓缩,即得异叶青兰总多酚精制品;所述大孔树脂层析柱是指NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂、D101型大孔吸附树脂、AB-8型大孔吸附树脂、HPD-500型大孔吸附树脂中的一种,该大孔树脂层析柱尺寸为80 mm~100 mm×100 cm~200 cm。
2.如权利要求1所述的一种异叶青兰总多酚的制备方法,其特征在于:所述步骤⑴、步骤⑶、步骤⑷中减压浓缩的条件均是指温度为50~70℃、压力为0.05~0.07MPa。
3.如权利要求1所述的一种异叶青兰总多酚的制备方法,其特征在于:所述步骤⑷中上样流速为1~2Bv/h。
4.如权利要求1所述的一种异叶青兰总多酚的制备方法,其特征在于:所述步骤⑷中洗脱流速为3~5Bv/h。
5.如权利要求1所述的一种异叶青兰总多酚的制备方法制得的异叶青兰总多酚作为抗氧化剂在制备抗氧化药物或保健食品中的应用,其特征在于:该异叶青兰总多酚作为有效组分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类抗氧化药用制剂,或作为有效组分按常规方法与食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
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