CN104147594B - 一种载vegf和万古霉素的多层缓释微球制剂、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
一种以海藻酸钠、壳聚糖为载体的载VEGF和万古霉素的多层局部用缓释微球制剂、制备方法及其在制备治疗骨缺损、骨组织再生、创伤愈合的药物中的应用。属于药物缓释微球技术领域。本发明除核心球的制备为滴注法外，其余多层微球的制备都是依据正负电荷相吸引及层层自组装原理制备。海藻酸钠与壳聚糖均为天然高分子多糖，壳聚糖为聚阳离子高分子材料，侧链结构中含有大量游离氨基；而海藻酸钠为聚阴离子材料，分子侧链上有大量的羧基，二者通过正负电荷相互吸引发生络合反应，按层层自组装原理依次包裹形成核壳型多层缓释药物的多层球，使本发明产品同时具备促进局部血管生成，改善血液循环及控制局部感染的效果。
Description
技术领域
本发明属于药物缓释微球技术领域，具体涉及一种以海藻酸钠、壳聚糖为载体的载血管内皮细胞生长因子(VEGF)和万古霉素(VCM)的多层局部用缓释微球制剂、制备方法及其在制备治疗骨缺损、骨组织再生、创伤愈合的药物中的应用。
背景技术
近年来，随着人们对生活质量和身体健康的日益关注，以及经济的迅猛发展所带来的道路交通和工伤事故，使骨缺损的临床诊治变得复杂起来。对于大段的骨缺损，构建的组织工程骨中心部位血供受限，易于发生营养障碍；复杂骨折常常骨缺损和感染并发；此时单纯的组织工程骨移植很有可能会因为局部感染无法控制而引发移植物感染，进而导致移植失败。因此，如何在构建组织工程骨组织的同时，促进小血管长入以及细胞与材料复合物内血供的重建，并控制缺损局部微生物感染成为骨组织工程由基础向临床应用的关键性环节。
血管内皮细胞生长因子(VEGF)对血管具有再生作用，其能够通过促进血管内皮细胞的有丝分裂、血管通透性的增加等方式促进局部血管的再生。VEGF在体内的半衰期短，直接应用难以达到促血管生成的目的，但如果采用首次大剂量给药，易导致局部血管瘤。万古霉素(VCM，Vancomycin)是治疗骨和关节感染的常用抗生素，由一种链霉菌产生的、结构复杂的糖肽类构成，专一地抑制肽聚糖的生物合成来抑制革兰氏阳性菌，主要用于葡萄球菌(包括耐青霉素和耐新青霉素株)引起的感染。常规抗感染主要是口服或静脉给药，虽说可以取得一定疗效，但是给予药物剂量大，容易引发副作用；而且，对于严重骨组织感染的患者，在感染骨组织周围血流减慢、减少，容易形成血液中的高浓度而局部骨组织低浓度的现象，降低了药物在局部的治疗作用。近几年来，开发局部应用的抗生素及促血管生成的缓释药物取得了一定进展，但是均是负载单种药物的缓释剂型，载药量及包封率较低，而且突释现象较为严重，且两种药物同时局部应用增加了应用的复杂性。鉴于此，联合应用抗炎及血管化药物并实现其差异性和程序性可控释放，减小药物毒副作用，充分发挥其持久协同的治疗效果，对于骨缺损的修复及抗感染的治疗具有极其重要的意义。
随着局部药物缓释研究的不断深入彻底改变了常规的连续间断性的给药方式，只要在局部组织内放置可以缓释药物的载体，就可以实现局部持续有效给药，提高局部药物浓度，降低药物毒性，延长药物作用时间，延长用药间隔，减少用药次数，提高病人用药顺应性和用药水平，极大地提高了治疗的依从性。海藻酸盐及壳聚糖在医药领域、食品加工领域等均已得到开发及利用，大量研究表明：壳聚糖具有良好的生物活性、生物相容性、生物降解性，它可以促进伤口愈合和组织修复，在新型伤口敷料和组织工程方面的应用倍受人们关注；海藻酸盐可以用于制造新型伤口敷料，它可以在伤口表面原位形成凝胶，创造有利于伤口愈合的湿润密闭愈合环境，海藻酸盐及壳聚糖均已被FDA批准为药物辅料。
层层自组装技术(LbL)是基于聚电解质阴阳离子所带正负电荷间相互作用的一种自组装超分子技术。该技术的主要特点是在表面荷电的基材表面通过静电相互作用交替地吸附上带相反电荷的聚电解质阴阳离子。近年来，层层组装技术由于其制备条件温和(在水溶液中)、利于保持药物活性、负载药物方式多样、药物负载量精确可控、智能响应释放药物等优点成为构筑药物控释功能性膜材料的重要方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有良好的生物相容性及生物可降解性、不使用有机溶剂、载VEGF和万古霉素的多层缓释微球制剂。
本发明的另一目的在于提供一种制备工艺简单，温和无污染，药物程序性、可控性逐层释放的载VEGF和万古霉素的多层缓释微球制剂的制备方法。
本发明所述的一种载有VEGF和万古霉素的多层缓释微球制剂，其为多层核壳结构，核心球为载有VEGF的海藻酸盐，第一层壳为载有万古霉素的壳聚糖，第二层壳为载有VEGF的海藻酸钠，第二层壳为载有万古霉素的壳聚糖。
在本发明的另一方面，提供了一种载VEGF及万古霉素的多层缓释微球制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将海藻酸钠(SA)的去离子水溶液与VEGF无菌水溶液混合后，得到含有VEGF的海藻酸钠溶液；然后将该溶液逐滴滴入到交联剂溶液中，搅拌后制得VEGF均匀分布于海藻酸盐微球中的载VEGF的海藻酸盐核心球(CA)；其中海藻酸钠、VEGF、交联剂的用量质量比为2～8：8×10-6：15～45，海藻酸钠(SA)的摩尔质量为120～190kDa，VEGF的摩尔质量为39kDa，交联剂为CaCl2、MgCl2、BaCl2、ZnCl2等，其中优选CaCl2，对应的海藻酸盐为海藻酸钙、海藻酸镁、海藻酸钡、海藻酸锌。
(2)将上述步骤制备得到的载有VEGF的海藻酸盐核心球加入到搅拌的含有万古霉素和壳聚糖(CS)的稀醋酸水溶液中，通过正负电荷的相吸引及交替自组装，制得海藻酸盐-壳聚糖核壳结构的复合载药单层核心微球；
(3)将步骤(2)制得的海藻酸钙-壳聚糖复合载药单层核心微球再次加入到含有VEGF的海藻酸钠溶液中，搅拌下制得海藻酸盐-壳聚糖-海藻酸钠复合微球；然后再将该复合微球加入到含有万古霉素和壳聚糖(CS)的稀醋酸水溶液中，搅拌下制得海藻酸盐-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖复合微球(CA-CS-SA-CS)；重复步骤(2)和步骤(3)可依次制得多层结构的复合微球；
(4)将步骤(3)得到的复合微球于-20～-30℃下预冻12h～24h，后于-60～-70℃冻干直至重量不再变化，即可得载有VEGF和万古霉素的海藻酸盐-壳聚糖多层复合缓释微球。
上述步骤(1)中，海藻酸钠(SA)的去离子水溶液是将0.2～0.8g海藻酸钠溶于20mL去离子水中得到的溶液；VEGF的无菌水溶液是将0.8ug的VEGF的投入到0.4mL的无菌水中得到的溶液；交联剂溶液是将1.5～4.5g的CaCl2、MgCl2、BaCl2或ZnCl2溶于30mL水所配置的溶液。搅拌速度为200～300r/min，搅拌时间为20～40min。
上述步骤(2)中，是将100～200mg的万古霉素投入到含有0.3～0.9g壳聚糖的30mL稀醋酸水溶液中(稀醋酸水溶液中，稀醋酸的体积分数为1％～3％)；搅拌速度为500～800r/min，搅拌时间为10～20min。
上述步骤(3)中，含有VEGF的海藻酸钠溶液是将0～0.8ug的VEGF投入到含有0.15～0.6g海藻酸钠(SA)的30mL去离子水中；含有万古霉素和壳聚糖(CS)的稀醋酸水溶液是将200～400mg的万古霉素投入到含有0.3～0.9g壳聚糖的30mL稀醋酸水溶液中(稀醋酸水溶液中，稀醋酸的体积分数为1％～3％)；搅拌速度为500～800r/min，搅拌时间为10～20min；
上述步骤(3)中，所得载有VEGF和万古霉素的海藻酸盐-壳聚糖多层复合缓释微球的平均粒径为500～600um。
本发明除核心球的制备为滴注法外，其余多层微球的制备都是依据正负电荷相吸引及层层自组装原理制备。海藻酸钠与壳聚糖均为天然高分子多糖，壳聚糖为聚阳离子高分子材料，侧链结构中含有大量游离氨基；而海藻酸钠为聚阴离子材料，分子侧链上有大量的羧基，二者通过正负电荷相互吸引发生络合反应，按层层自组装原理依次包裹形成核壳型多层缓释药物的多层球，使本发明产品同时具备促进局部血管生成，改善血液循环及控制局部感染的效果，从而可以用于制备治疗骨缺损、骨组织再生、创伤愈合的药物。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
(1)本发明的制备中使用了两种不同天然高分子材料，材料本身具有一定的生物活性，抗菌性，止血性等；
(2)本发明的制备方法使用了两种不同功效的药物，使微球具有促血管生成及抗感染的双重功效；
(3)本发明的制备方法使用了海藻酸钠与壳聚糖分别包裹VEGF与万古霉素，逐层释放，使药物达到程序性、可控性释放；同时，多层包裹能有效地降低突释效应，使药物缓慢释放。临床上无需患者多次注射药物，给患者提供了极大的方便；
(4)一种微球同时包载两种药物，实现了“一球多药”，满足了对骨缺损的双重修复需求，提高骨移植的成功率；
(5)利用缓释微球装载VEGF和万古霉素可实现骨缺损局部直接给药，既避免了生长因子和抗生素过量的副作用，又可维持局部的药物浓度，促进骨组织的再生；
(6)本发明的制备方法采用层层自组装原理，通过壳聚糖与海藻酸钠之间正负电荷相吸引，对包裹物的性质没有影响，将层与层之间紧密结合，制备工艺简单，无需有机溶剂，安全无污染，温和环保，市场前景广阔。
附图说明
图1：分别为载VEGF和万古霉素的缓释微球冻干前与冻干后的照片；
图2：为载VEGF和万古霉素的缓释微球的扫描电镜照片(微球整体与截面观)；
图3：为载VEGF和万古霉素缓释微球的红外曲线(前后箭头的指示分别为海藻酸盐与壳聚糖特异性官能团峰值，表明两种支架材料成功实现交替自组装)；
图4：分别为微球中药物VEGF与万古霉素的体外累积释放曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不仅限于此。
实施例1
(1)取质量体积比为4.0g：100mL的海藻酸钠(SA)的去离子水溶液20mL，与溶有0.8ug VEGF的0.4mL无菌水溶液搅拌混合均匀后，逐滴滴入5.0g：100mL的30mL CaCl2溶液中，200r/min匀速搅拌，搅拌30min，制得海藻酸钙核心微球；
(2)将步骤(1)得到的核心球加入到正在搅拌的溶有100mg万古霉素的质量体积比为3.0g：100mL、30mL的壳聚糖(CS)稀醋酸水溶液(稀醋酸水溶液的体积分数为1％)中，搅拌速度为500r/min，搅拌时间为10min，制得海藻酸钙-壳聚糖复合载药单层核心微球；
(3)将步骤(2)中制得的微球再次加入到含有0ug VEGF质量体积比为1.0g：100mL、30mL的海藻酸钠溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠两层微球；
(4)将步骤(3)中制得的微球再次加入到含有200mg万古霉素的质量体积比为3.0g：100mL、30mL的壳聚糖稀醋酸水溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球；
(5)将上述微球于-20℃预冻12h，后于-63℃冻干直至重量不再变化，即得成品，保存备用。如图1所示，分别为冻干前与冻干后的微球。冻干前，微球成球性好，大小均匀，表面光滑，晶莹剔透；冻干后，微球体积无变化，分散性好，无粘连。图2为多层微球扫描电镜图片，整体观可见球体圆整，表面疏松多孔；截面观可见层与层之间间隙，表明两种载体材料实现了层层包裹。
其余条件下，也可进行冻干，但此条件下冻干微球效果(成球性好，大小均匀，分散性好)更好。
对上述冻干后的多层微球进行红外扫描，结果如图3所示，出现了海藻酸盐及壳聚糖特异性官能团峰值，表明两种支架材料成功实现交替自组装。
对比例1
其步骤如实施例1所示，除微球各层均不包裹药物外，其余微球的制备条件均与实施例1相同，为空白对照组。其制备的目的为与实验组一起，用紫外分光光度法共同完成万古霉素缓释曲线的绘制。VEGF的体外释放检测用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测，不需此空白对照组。
复合多层缓释微球载药量、包封率检测实验：将0.22g载有VEGF和万古霉素(VCM)的藻酸盐-壳聚糖多层微球与0.20g不载药的藻酸盐-壳聚糖多层微球分别加入到柠檬酸钠水溶液中至总体积为25mL，密封保存。待微球全部溶解后，取实验组与对照组上清液，利用紫外分光光度法测定万古霉素的载药量与包封率。同时，取实验组上清液，用ELISA检测VEGF的载药量与包封率。VEGF包封率为49.40％，载药量为0.72ug/g；万古霉素包封率为0.97％，载药量为5.32mg/g。
复合多层缓释微球体外释药曲线实验：将0.22g载有VEGF和万古霉素的藻酸盐-壳聚糖多层微球与0.20g不载药的藻酸盐-壳聚糖多层微球分别加入到PBS缓冲液中至总体积为25mL，密封保存。每隔一段时间，利用紫外分光光度法与ELISA检测法分别测定上清液中两种药物的浓度，计算其释放量。每次取液后全部重新换成新鲜的PBS缓冲液至总体积为25mL。根据时间和累计释放百分比得到药物释放曲线，结果如图4所示，可以看出，VEGF药物的缓释时间为21天，累积释放量为94.80％。VCM药物的缓释时间为6天，累积释放量为84.57％。
实施例2
(1)取质量体积比为1.0g：100mL的海藻酸钠(SA)溶液20mL，与溶有0.8ug VEGF的0.4mL无菌水溶液搅拌混合均匀后，逐滴滴入质量体积比为15.0g：100mL、30mL的CaCl2溶液中，200r/min匀速搅拌，搅拌30min，制得海藻酸钙核心微球；
(2)将步骤(1)得到的核心球加入到正在搅拌的溶有100mg万古霉素的质量体积比为2.0g：100mL、30mL的壳聚糖(CS)稀醋酸水溶液中，搅拌速度为500r/min，搅拌时间为10min，制得海藻酸钙-壳聚糖复合载药单层核心微球；
(3)将步骤(2)中制得的微球再次加入到含有0ug VEGF质量体积比为1.0g：100mL、30mL的海藻酸钠溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠两层微球；
(4)将步骤(3)中制得的微球再次加入到含有200mg万古霉素的质量体积比为2.0g：100mL、30mL的壳聚糖稀醋酸水溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球；
(5)将上述微球于-20℃预冻12h，后于-63℃冻干直至重量不再变化，即得成品，保存备用。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的海藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物包封率与载药量的检测，VEGF包封率为27.69％，载药量为1.23ug/g；万古霉素包封率为2.53％，载药量为41.96mg/g。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的海藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物释放检测，VEGF药物的缓释时间为21天，累积释放量为97.07％。VCM药物的缓释时间为6天，累积释放量为91.58％。
实施例3
(1)取质量体积比为4.0g：100mL的海藻酸钠(SA)溶液20mL，与溶有0.8ug VEGF的0.4mL无菌水溶液搅拌混合均匀后，逐滴滴入质量体积比为15.0g：100mL、30mL的CaCl2溶液中，200r/min匀速搅拌，搅拌30min，制得海藻酸钙核心微球；
(2)将步骤(1)得到的核心球加入到正在搅拌的溶有100mg万古霉素的质量体积比为1.0g：100mL、30mL的壳聚糖(CS)稀醋酸水溶液中，搅拌速度为500r/min，搅拌时间为10min，制得海藻酸钙-壳聚糖复合载药单层核心微球；
(3)将步骤(2)中制得的微球再次加入到含有0ug VEGF质量体积比为1.0g：100mL、30mL的海藻酸钠溶液中，搅拌速度为500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠两层微球；
(4)将步骤(3)中制得的微球再次加入到含有200mg万古霉素的质量体积比为1.0g：100mL、30mL的壳聚糖稀醋酸水溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球；
(5)将上述微球于-20℃预冻12h，后于-63℃冻干直至重量不再变化，即得成品，保存备用。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的海藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物包封率与载药量的检测，VEGF包封率为61.31％，载药量为0.59ug/g；万古霉素包封率为3.48％，载药量为12.47mg/g。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物释放检测，VEGF药物的缓释时间为21天，累积释放量为93.02％。VCM药物的缓释时间为6天，累积释放量为91.61％。
实施例4
(1)取质量体积比为1.0g：100mL的海藻酸钠(SA)溶液20mL，与溶有0.8ug VEGF的0.4mL无菌水溶液搅拌混合均匀后，逐滴滴入质量体积比为10.0g：100mL、30mL的CaCl2溶液中，200r/min匀速搅拌，搅拌30min，制得海藻酸钙核心微球；
(2)将步骤(1)得到的核心球加入到正在搅拌的溶有100mg万古霉素的质量体积比为3.0g：100mL，30mL的壳聚糖(CS)稀醋酸水溶液中，搅拌速度为500r/min，搅拌时间为10min，制得海藻酸钙-壳聚糖复合载药单层核心微球；
(3)将步骤(2)中制得的微球再次加入到含有0ug VEGF质量体积比为1.0g：100mL，30mL的海藻酸钠溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠两层微球；
(4)将步骤(3)中制得的微球再次加入到含有200mg万古霉素的质量体积比为3.0g：100mL，30mL的壳聚糖稀醋酸水溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球；
(5)将上述微球于-20℃预冻12h，后于-63℃冻干直至重量不再变化，即得成品，保存备用。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的海藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物包封率与载药量的检测，VEGF包封率为46.92％，载药量为1.77ug/g；万古霉素包封率为2.55％，载药量为36.07mg/g。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物释放检测，VEGF药物的缓释时间为21天，累积释放量为97.16％。VCM药物的缓释时间为6天，累积释放量为91.50％。
实施例5
(1)取质量体积比为2.0g：100mL的海藻酸钠(SA)溶液20mL，与溶有0.8ug VEGF的0.4mL无菌水溶液搅拌混合均匀后，逐滴滴入质量体积比为15.0g：100mL，30mL的CaCl2溶液中，200r/min匀速搅拌，搅拌30min，制得海藻酸钙核心微球；
(2)将步骤(1)得到的核心球加入到正在搅拌的溶有100mg万古霉素的质量体积比为3.0g：100mL，30mL的壳聚糖(CS)稀醋酸水溶液中，搅拌速度为500r/min，搅拌时间为10min，制得海藻酸钙-壳聚糖复合载药单层核心微球；
(3)将步骤(2)中制得的微球再次加入到含有0ug VEGF质量体积比为1.0g：100mL，30mL的海藻酸钠溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠两层微球；
(4)将步骤(3)中制得的微球再次加入到含有200mg万古霉素的质量体积比为3.0g：100mL，30mL的壳聚糖稀醋酸水溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球；
(5)将上述微球于-20℃预冻12h，后于-63℃冻干直至重量不再变化，即得成品，保存备用。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的海藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物包封率与载药量的检测，VEGF包封率为47.36％，载药量为0.78ug/g；万古霉素包封率为3.68％，载药量为22.59mg/g。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物释放检测，VEGF药物的缓释时间为21天，累积释放量为93.18％。VCM药物的缓释时间为6天，累积释放量为93.20％。
实施例6
(1)取质量体积比为4.0g：100mL的海藻酸钠(SA)溶液20mL，与溶有0.8ug VEGF的0.4mL无菌水溶液搅拌混合均匀后，逐滴滴入质量体积比为10.0g：100mL，30mL的CaCl2溶液中，200r/min匀速搅拌，搅拌30min，制得海藻酸钙核心微球；
(2)将步骤(1)得到的核心球加入到正在搅拌的溶有100mg万古霉素的质量体积比为2.0g：100mL，30mL的壳聚糖(CS)稀醋酸水溶液中，搅拌速度为500r/min，搅拌时间为10min，制得海藻酸钙-壳聚糖复合载药单层核心微球；
(3)将步骤(2)中制得的微球再次加入到含有0ug VEGF质量体积比为1.0g：100mL，30mL的海藻酸钠溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠两层微球；
(4)将步骤(3)中制得的微球再次加入到含有200mg万古霉素的质量体积比为2.0g：100mL，30mL的壳聚糖稀醋酸水溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球；
(5)将上述微球于-20℃预冻12h，后于-63℃冻干直至重量不再变化，即得成品，保存备用。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的海藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物包封率与载药量的检测，VEGF包封率为55.19％，载药量为0.61ug/g；万古霉素包封率为0.85％，载药量为3.51mg/g。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物释放检测，VEGF药物的缓释时间为21天，累积释放量为90.40％。VCM药物的缓释时间为6天，累积释放量为76.03％。
实施例7
(1)取质量体积比为2.0g：100mL的海藻酸钠(SA)溶液20mL，与溶有0.8ug VEGF的0.4mL无菌水溶液搅拌混合均匀后，逐滴滴入质量体积比为5.0g：100mL，30mL的CaCl2溶液中，200r/min匀速搅拌，搅拌30min，制得海藻酸钙核心微球；
(2)将步骤(1)得到的核心球加入到正在搅拌的溶有100mg万古霉素的质量体积比为2.0g：100mL，30mL的壳聚糖(CS)稀醋酸水溶液中，搅拌速度为500r/min，搅拌时间为10min，制得海藻酸钙-壳聚糖复合载药单层核心微球；
(3)将步骤(2)中制得的微球再次加入到含有0ug VEGF质量体积比为1.0g：100mL，30mL的海藻酸钠溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠两层微球；
(4)将步骤(3)中制得的微球再次加入到含有200mg万古霉素的质量体积比为2.0g：100mL，30mL的壳聚糖稀醋酸水溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球；
(5)将上述微球于-20℃预冻12h，后于-63℃冻干直至重量不再变化，即得成品，保存备用。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的海藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物包封率与载药量的检测，VEGF包封率为64.51％，载药量为1.35ug/g；万古霉素包封率为2.36％，载药量为18.61mg/g。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物释放检测，VEGF药物的缓释时间为21天，累积释放量为97.05％。VCM药物的缓释时间为6天，累积释放量为90.42％。
实施例8
(1)取质量体积比为2.0g：100mL的海藻酸钠(SA)溶液20mL，与溶有0.8ug VEGF的0.4mL无菌水溶液搅拌混合均匀后，逐滴滴入质量体积比为10.0g：100mL，30mL的CaCl2溶液中，200r/min匀速搅拌，搅拌30min，制得海藻酸钙核心微球；
(2)将步骤(1)得到的核心球加入到正在搅拌的溶有100mg万古霉素的质量体积比为1.0g：100mL，30mL的壳聚糖(CS)稀醋酸水溶液中，搅拌速度为500r/min，搅拌时间为10min，制得海藻酸钙-壳聚糖复合载药单层核心微球；
(3)将步骤(2)中制得的微球再次加入到含有0ug VEGF质量体积比为1.0g：100mL，30mL海藻酸钠溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠两层微球；
(4)将步骤(3)中制得的微球再次加入到含有200mg万古霉素的质量体积比为1.0g：100mL，30mL的壳聚糖含有0ug VEGF溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球；
(5)将上述微球于-20℃预冻12h，后于-63℃冻干直至重量不再变化，即得成品，保存备用。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的海藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物包封率与载药量的检测，VEGF包封率为39.64％，载药量为0.71ug/g；万古霉素包封率为4.17％，载药量为28.13mg/g。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物释放检测，VEGF药物的缓释时间为21天，累积释放量为95.71％。VCM药物的缓释时间为6天，累积释放量为97.53％。
实施例9
(1)取质量体积比为1.0g：100mL的海藻酸钠(SA)溶液20mL，与溶有0.8ug VEGF的0.4mL无菌水溶液搅拌混合均匀后，逐滴滴入质量体积比为5.0g：100mL的CaCl2溶液中，200r/min匀速搅拌，搅拌30min，制得海藻酸钙核心微球；
(2)将步骤(1)得到的核心球加入到正在搅拌的溶有100mg万古霉素的质量体积比为1.0g：100mL，30mL的壳聚糖(CS)稀醋酸水溶液中，搅拌速度为500r/min，搅拌时间为10min，制得海藻酸钙-壳聚糖复合载药单层核心微球；
(3)将步骤(2)中制得的微球再次加入到含有0ug VEGF质量体积比为1.0g：100mL，30mL的海藻酸钠溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠两层微球；
(4)将步骤(3)中制得的微球再次加入到含有200mg万古霉素的质量体积比为1.0g：100mL，30mL的壳聚糖稀醋酸水溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球；
(5)将上述微球于-20℃预冻12h，后于-63℃冻干直至重量不再变化，即得成品，保存备用。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的海藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物包封率与载药量的检测，VEGF包封率为32.82％，载药量为1.50ug/g；万古霉素包封率为6.05％，载药量为103.88mg/g。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物释放检测，VEGF药物的缓释时间为21天，累积释放量为97.25％。VCM药物的缓释时间为6天，累积释放量为98.58％。
实施例10
(1)取质量体积比为1.0g：100mL的海藻酸钠(SA)溶液20mL，与溶有0.8ug VEGF的0.4mL无菌水溶液搅拌混合均匀后，逐滴滴入质量体积比为5.0g：100mL的CaCl2溶液中，200r/min匀速搅拌，搅拌30min，制得海藻酸钙核心微球；
(2)将步骤(1)得到的核心球加入到正在搅拌的溶有200mg万古霉素的质量体积比为1.0g：100mL，30mL的壳聚糖(CS)稀醋酸水溶液中，搅拌速度为500r/min，搅拌时间为10min，制得海藻酸钙-壳聚糖复合载药单层核心微球；
(3)将步骤(2)中制得的微球再次加入到质量体积比为1.0g：100mL，30mL的溶有0.8ug VEGF的海藻酸钠溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠两层微球；
(4)将步骤(3)中制得的微球再次加入到含有400mg万古霉素的质量体积比为1.0g：100mL，30mL的壳聚糖稀醋酸水溶液中，500r/min，搅拌10min，制得海藻酸钙-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖三层微球；
(5)将上述微球于-20℃预冻12h，后于-63℃冻干直至重量不再变化，即得成品，保存备用。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的海藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物包封率与载药量的检测，VEGF包封率为32.85％，载药量为1.39ug/g；万古霉素包封率为10.58％，载药量为102.50mg/g。
对该实施例制得的载有VEGF和万古霉素的藻酸盐-壳聚糖多层微球进行药物释放检测，VEGF药物的缓释时间为21天，累积释放量为97.32％。VCM药物的缓释时间为6天，累积释放量为98.60％。所得VEGF释放量的结果与实施例9接近，因此在2层海藻酸钠中投入一定量的VEGF对其结果影响不大，可以不加入。所得万古霉素释放量较实施例9有所提高，因此可以考虑加大万古霉素的投药量。
Claims (3)
1.一种载VEGF和万古霉素的多层缓释微球制剂的制备方法，其步骤如下：
(1)将海藻酸钠SA的去离子水溶液与血管内皮细胞生长因子VEGF的无菌水溶液混合后，得到含有VEGF的海藻酸钠溶液；然后将该溶液逐滴滴入到交联剂溶液中，搅拌后制得VEGF均匀分布于海藻酸盐微球中的载VEGF的海藻酸盐核心球CA；其中海藻酸钠、VEGF、交联剂的用量质量比为2～8：8×10-6：15～45，交联剂为CaCl2，对应的海藻酸盐为海藻酸钙；
(2)将上述步骤制备得到的载有VEGF的海藻酸盐核心球加入到搅拌的含有万古霉素和壳聚糖CS的稀醋酸水溶液中，通过正负电荷的相吸引及交替自组装，制得海藻酸盐-壳聚糖核壳结构的复合载药单层核心微球；
(3)将步骤(2)制得的海藻酸盐-壳聚糖核壳结构的复合载药单层核心微球再次加入到含有VEGF的海藻酸钠溶液中，搅拌下制得海藻酸盐-壳聚糖-海藻酸钠复合微球；然后再将该复合微球加入到含有万古霉素和壳聚糖CS的稀醋酸水溶液中，搅拌下制得海藻酸盐-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖复合微球CA-CS-SA-CS；
(4)将步骤(3)得到的复合微球于-20～-30℃下预冻12h～24h，后于-60～-70℃冻干直至重量不再变化，即可得载有VEGF和万古霉素的海藻酸盐-壳聚糖多层复合缓释微球；
步骤(1)中，海藻酸钠SA的去离子水溶液是将0.2～0.8g海藻酸钠溶于20mL去离子水中得到的溶液；VEGF的无菌水溶液是将0.8ug的VEGF投入到0.4mL的无菌水中得到的溶液；交联剂溶液是将1.5～4.5g的CaCl2溶于30mL水所配置的溶液；搅拌速度为200～300r/min，搅拌时间为20～40min；
步骤(2)中，是将100～200mg的万古霉素投入到含有0.3～0.9g壳聚糖的30mL稀醋酸水溶液中，稀醋酸水溶液中稀醋酸的体积分数为1％～3％；搅拌速度为500～800r/min，搅拌时间为10～20min；
步骤(3)中，含有VEGF的海藻酸钠溶液是将0～0.8ug的VEGF投入到含有0.15～0.6g海藻酸钠SA的30mL去离子水中；含有万古霉素和壳聚糖CS的稀醋酸水溶液是将200～400mg的万古霉素投入到含有0.3～0.9g壳聚糖的30mL稀醋酸水溶液中，稀醋酸水溶液中稀醋酸的体积分数为1％～3％；搅拌速度为500～800r/min，搅拌时间为10～20min；
步骤(4)中，所得载有VEGF和万古霉素的海藻酸盐-壳聚糖多层复合缓释微球的平均粒径为500～600um。
2.一种载VEGF和万古霉素的多层缓释微球制剂，其特征在于：其为多层核壳结构，核心球为载有VEGF的海藻酸盐，第一层壳为载有万古霉素的壳聚糖，第二层壳为载有VEGF的海藻酸钠，第三层壳为载有万古霉素的壳聚糖；且由权利要求1所述的方法制备得到。
3.权利要求2所述的一种载VEGF和万古霉素的多层缓释微球制剂在制备治疗骨缺损、骨组织再生或创伤愈合的药物中的应用。
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