CN104147111A - 复方丹参滴丸治疗氧化应激损伤 - Google Patents

Abstract

本发明公开了长期给予临床剂量的复方丹参滴丸(cardiotonic CP)可以抑制缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)引起的氧化应激损伤，降低I/R后组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)和外周血中过氧化物(peroxide)的含量；并且，通过对机制的深入研究，揭示了CP通过抑制尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶亚基的转位和活化来发挥其抗氧化应激的作用。

Description

复方丹参滴丸治疗氧化应激损伤

技术领域

本发明涉及一种药物的应用，特别涉及复方丹参滴丸治疗氧化应激损伤。

背景技术

复方丹参滴丸为天士力公司开发的活血化瘀、理气止痛中药，用于胸中憋闷、心绞痛，其主要成分为丹参、三七、冰片，其药理作用包括1增加冠脉血流量，2增加心肌耐缺氧保护缺血心肌，3抗血小板聚集防止血栓形成，4改善微循环。

缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)引起的死亡在各类缺血性疾病中占据绝大部分，然而临床上并没有非常有效的药物干预。前期实验证明复方丹参滴丸可以抑制I/R损伤，然而其作用机制尚未完全清晰。

本发明意外的发现，复方丹参滴丸可以抑制I/R引起的氧化应激损伤，降低I/R后组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)和外周血中过氧化物(peroxide)的含量；并且，本实验通过对机制的深入研究，揭示CP通过抑制尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenosine dinucleotide phosphateoxidase,NADPH oxidase)亚基的转位和活化来发挥其抗氧化应激的作用。

过氧化物损伤由两方面的因素决定，一是：体内抗过氧化物酶功能下降，体内清除过氧化物的能力降低；二是：过氧化物的生成增多。本次实验对抗过氧化物酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的含量进行检测，结果表明CP并不能显著性的增加体内抗过氧化物酶SOD、CAT的含量，证实复方丹参滴丸并不是通过增强抗过氧化酶来发挥其抗氧化功能的。

因此，本实验又检测产生过氧化物的主要来源之一NADPH oxidase的活性。在静息状态时，NADPH oxidase的催化亚基gp91^phox位于细胞内的囊泡膜上，而NADPH oxidase调节亚基p67^phox、p47^phox和p40^phox位于胞浆中，当NADPH oxidase被激活时，催化亚基和调节亚基结合形成一个复合体，并从细胞浆中转移到细胞膜上。转位到细胞膜上的NADPH oxidase将胞浆内NADPH的一个电子转移到细胞外的氧分子上，产生氧自由基。本次实验结果表明，复方丹参滴丸可以显著性的抑制由I/R引起的NADPH oxidase亚基从细胞浆到细胞膜的转位，抑制NADPHoxidase的活化，从而减少过氧化物的产生。

发明内容：

本发明提供一种复方丹参滴丸的新的治疗用途，特别是复方丹参滴丸的抗氧化应激的作用。

本发明所用药物复方丹参滴丸属于现有技术，为天士力公司独家生产的已经上市的药物，其由丹参三七冰片经提取加工制备而成，市场上可以购买得到。

为此本发明提供一种复方丹参滴丸在制备治疗或预防氧化应激损伤的药物中的应用。

本发明所述应用是复方丹参滴丸能减少心肌梗死区域，降低梗死面积的增加。

本发明所述应用是复方丹参滴丸能使再灌注后心肌细胞排列相对规整，细胞界限清楚，间质轻度水肿。

本发明所述应用是复方丹参滴丸能使再灌注后TUNEL阳性心肌细胞减少，逆转再灌注引起的心肌凋亡的增加。

本发明所述应用是复方丹参滴丸能抑制再灌注后过氧化物的产生。

本发明所述应用是复方丹参滴丸能抑制I/R诱导的丙二醛的含量的增高。

本发明所述应用是复方丹参滴丸能抑制I/R诱导的心肌细胞膜上gp91^phox、p67^phox、p47^phox蛋白表达量的增加。逆转由I/R诱导的心肌细胞浆中p67^phox和p47^phox蛋白表达量的降低。

本发明所述应用是指联长期连续用复方丹参滴丸所达到的。

本发明所述的治疗用途是通过以下实验证明的：

复方丹参滴丸通过抑制NADPH oxidase亚基转位改善缺血再灌注后的氧化应激损伤

1．实验摘要

我们已经的研究证实了复方丹参滴丸对缺血再灌注引起的心脏微循环障碍和心肌损伤有改善作用。本研究我们发现连续给投予复方丹参滴丸可以抑制尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenosine dinucleotide phosphateoxidase,NADPH oxidase)亚基的的转位和活化，降低I/R引起的氧化应激损伤。

2.实验方法

2.1.动物

雄性SD大鼠，体重240-260g，购于北京大学医学部动物中心，合格证号：SCXK(京)2006－0008。动物饲养在温度为22±2℃，湿度为40±5%的条件下，自由饮食、饮水，12h光照/黑暗交替。动物于实验前禁食12h，但可自由饮水。实验操作规程按北京大学动物研究委员会指南执行。实验草案获北京大学医学部实验动物伦理委员会批准(LA2010-001)。

2.2.I/R模型建立

大鼠用20%的乌拉坦(1.25g/kg)肌肉注射麻醉，卧位固定，颈部去毛，切开皮肤，分离颈前肌，暴露气管，行气管插管。插管另一端连于小动物呼吸机行加压呼吸(吸比1∶1，呼吸频率75次/min，潮气量12ml/kg)胸部去毛、消毒，沿胸骨左，右缘2～4肋开胸暴露心脏，剪开心包膜，用穿有3-0缝合线的3/8弯针穿过肺动脉圆锥与左心耳交界稍下(1～2)mm处，结扎缝合线并在丝线与心肌组间放一根聚乙烯小管，拉紧丝线形成造成缺血，心肌颜色变白为结扎成功的标志。30分种后放松丝线即发生再灌注，缺血区域恢复红色为再灌注成功的标志，假手术组只穿线不结扎。

2.3.分组与给药

CP(天津天士力制药股份有限公司提供，批号：20040502)，常温下保存。实验选用的SD大鼠，随机分成5组(n=6)，假手术组(Sham)、I/R模型(I/R)组、CP0.1g/kg/day连续6天给药+I/R组[CP0.1(6)+I/R]、CP0.4g/kg/day连续6天给药+I/R组[CP0.4(6)+I/R]、CP0.8g/kg/day连续6天给药+I/R组[CP0.8(6)+I/R]。相应剂量的CP(0.1g/kg/day，0.4g/kg/day，0.8g/kg/day)分别用生理盐水溶解，灌胃给药，生理盐水4ml/kg，在实验前5天至实验前90分钟，每24h给药一次，假手术组和I/R组分别按照相同的给药方法，给予等体积的生理盐水。

2.4.心肌梗死面积的测定

再灌注60分钟后，取出大鼠心脏(n=6)，从心尖部开始延平行于房室间隔的方向切成1mm厚的5个薄片放入0.375%的TTC中在37℃下孵育15分钟，行TTC染色。非梗塞区被染成红色，梗塞区被染成白色，拍摄心肌图片，用图像分析软件Image-Pro plus5.0(Media Cybernetic,Maryland,USA)计算出每片心肌的梗死面积与左心室面积的百分比值，再以五片心脏切片的心肌梗死面积的百分比的平均值来表示梗死面积。

2.5.组织形态学染色

再灌注60分钟后，打开胸腔，取出心脏，置于4%的多聚甲醛溶液固定48h，经过脱水、透明、浸蜡、包埋，制备蜡块，最终制备成石蜡切片。石蜡切片(5μm)用于苏木精伊红染色(HE染色)，用生物光学显微镜(Digital Sight DS-5M-U1,Nikon,Tokyo,Japan)进行观察和拍照。

2.6.心肌细胞的TUNEL染色

在再灌60min，取大鼠心脏，灌流固定。冰冻切6μm的切片，行TUNEL染色。用激光扫描共聚焦(Axiovert200M,Carl Zeiss,Jena,Germany)在心脏I/R区选择5个视野,用图像分析软件Image-Pro plus5.0(Media Cybernetic,Maryland,USA)计数TUNEL阳性细胞数，计算出5个视野的平均值，用TUNEL阳性细胞数/视野表示。

2.7．心肌组织MDA的测定

再灌注60min后，立即取下心脏，取大鼠I/R区域的心肌组织100mg，液氮速冷，移入-80℃冰箱。本实验通过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰来测定MDA的含量,用考马斯亮兰法测定组织蛋白含量。MDA的含量常常可以反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞的损伤程度。实验选用考马斯亮兰蛋白定量试剂盒和MDA试剂盒(Nanjing Jiancheng,Nanjing,China)，实验过程参照试剂盒说明。MDA测试方法及测定值计算:按说明书加试剂及标本，混匀后，置沸水浴中40min，离心(3000rpm,20min)，取上清，分光光度计测532nm吸光度值。样品中的MDA含量(nmol/ml)=(测定管吸光度－测定空白管吸光度)/(标准管吸光度－测定空白管吸光度)×标准品浓度(10nmol/ml)÷蛋白含量(mgprot/mg)。

2.8.外周血粒细胞过氧化物的测定

再灌注时，从股静脉缓慢注入过氧化物敏感的荧光探针-罗达明123(2μmol/kg溶解在3ml生理盐水中)。再灌注60分钟后，腹主动脉取血，肝素抗凝，用流式细胞仪(FACS Calibur,BD Company,New Jersey,USA)在激发光500nm，发射光在536nm的波长下测定粒细胞罗达明的荧光强度。

2.9．酶联免疫吸附(ELISA)测定SOD、CAT

在再灌注60分钟后，取缺血部位心肌组织100mg，加入PBS制成10%的组织均浆-20℃冰箱中保存。本实验采用SOD Assay Kit(R&D,Minnesota,USA)、CAT Assay Kit(R&D,Minnesota,USA)测量SOD和CAT的含量。操作按试剂盒说明进行，具体如下。检测前从冰箱取出试剂盒及待测标本，室温平衡20分钟。除空白孔外(蒸馏水)，分别将标本和不同浓度的标准品(100μl/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃温箱孵育120分钟。洗板：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静置30秒后甩尽液体，在吸水纸上拍干，洗板5次。除空白孔外，分别加入SOD、CAT第一抗体工作液(50μl/孔)，封住板孔，37℃孵箱孵育60分钟。洗板5次。除空白孔，加入酶标抗体工作液(100μl/孔)，封住板孔，37℃孵箱孵育。洗板5次。加入底物工作液(100μl/孔)，37℃避光显色10分钟。加入终止液(100μl/孔)，混匀后即刻用酶标仪，测吸光值(OD)。每个标准品和标本的OD值减去零孔的OD值即为实际OD值，在标准曲线上查出其浓度，即为蛋白浓度。

2.10.免疫印迹分析NADPH oxidase亚基转位

在再灌注60分钟后，取缺血部位心肌组织200mg，-80℃冰箱中保存。用胞核-胞浆-胞膜制备试剂盒(Applygen Technologies,Beijing,China)提出膜蛋白和浆蛋白。取样品加等体积的2×电泳样品缓冲液混合后，经10%SDS-PAGE电泳后(30mA,2hour)，电转膜至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭1hour，TBS-Tween漂洗3次×10min，剪取目的蛋白区域标记gp91^phox(1:2000；Abcam)、p67^phox(1:800；Abcam)、p47^phox(1:300；Santa Cruz)、p40^phox(1:300；Santa Cruz)、GADPH(1:3000；cell signaling technology)、Tublin(1:3000；cell signaling technology)。一抗，4℃孵育过夜，TBS-Tween冲洗3次×10min，用过氧化物酶标记的二抗孵育，室温1h，TBS-Tween冲洗3次×10min。ECL显色5min，暗盒曝光。X光片上的显色条带进行光密度扫描，用Image-Pro plus5.0(Media Cybernetic,Maryland,USA)图像分析软件进行半定量分析。以GADPH、Tublin的值为基础值，计算其它各组值与基础值比较的变化率。

3.实验结果

3.1.CP连续给药对大鼠心肌I/R后心肌梗死面积的影响(图1)

图1A表示Sham组(A1)、I/R组(A2)、CP0.1(6)+I/R组(A3)、CP0.4(6)+I/R组(A4)、CP0.8(6)+I/R组(A5)大鼠再灌注60分钟时心脏TTC染色图。Sham组大鼠心脏未见梗死区域，I/R组大鼠心脏可见较大的呈白色染色的梗死区域。CP0.1(6)+I/R组、CP0.4(6)+I/R组和CP0.8(6)+I/R组心肌梗死区域与I/R组相比明显地减少。

图2B表示Sham组、I/R组、CP0.1(6)+I/R组、CP0.4(6)+I/R组、CP0.8(6)+I/R组大鼠再灌注60分钟时心脏心肌梗死面积统计分析结果。I/R组大鼠心肌梗死区面积较Sham组显著性增加，而0.1g/kg/day，0.4g/kg/day，0.8g/kg/day CP连续给药显著性地降低由I/R引起的梗死面积的增加。

3.2.CP连续给药对心肌I/R损伤诱发组织学改变的影响(图2)

图2显示表示Sham组(A)、I/R组(B)、CP0.1(6)+I/R组(C)、CP0.4(6)+I/R组(D)、CP0.8(6)+I/R组(E)大鼠再灌注后心脏HE染色图。从图中可以看到Sham组：心肌细胞结构基本正常，心肌纤维染色均匀，细胞界限清晰，间质无水肿及炎性细胞侵润。I/R组：心肌细胞水肿严重，细胞界限不清，间质水肿明显，有大量炎性细胞浸润。CP0.1(6)+I/R组：肌浆分布不匀，间质中度水肿，有少量炎细胞浸润。CP0.4(6)+I/R组和CP0.8(6)+I/R组心肌细胞排列相对规整，细胞界限清楚，间质轻度水肿，散在极少量炎性细胞浸润。

2.3.CP连续给药对心肌I/R后心肌细胞凋亡的影响(图3)

图3A为Sham组(A1)、I/R组(A2)、CP0.1(6)+I/R组(A3)、CP0.4(6)+I/R组(A4)、CP0.8(6)+I/R组(A5)大鼠再灌注90时心脏TUNEL染色的图象。Sham组大鼠偶见TUNEL阳性的心肌细胞，I/R组大鼠心脏可以观察到大量的TUNEL阳性的心肌细胞,CP0.1(6)+I/R组、CP0.4(6)+I/R组、CP0.8(6)+I/R组的TUNEL阳性心肌细胞均明显地减少。

图3B表示Sham组、I/R组、CP0.1(6)+I/R组、CP0.4(6)+I/R组、CP0.8(6)+I/R组大鼠心脏TUNEL阳性心肌细胞结果。I/R组大鼠心肌凋亡细胞较Sham组显著性增加，而0.1g/kg/day，0.4g/kg/day，0.8g/kg/day CP连续给药显著性的逆转由I/R引起的心肌凋亡的增加。

2.4.CP连续给药对I/R后外周血粒细胞过氧化物的影响(图4)

图4表示Sham组、I/R组、CP0.1(6)+I/R组、CP0.4(6)+I/R组、CP0.8(6)+I/R组大鼠在再灌注60分钟时外周血粒细胞过氧化物的结果。I/R后外周血粒细胞过氧化物的荧光强度值显著性高于假手术组的荧光强度值。0.1g/kg/day CP连续给药组的过氧化物的荧光强度值与缺血再灌组比较没有明显的差异。0.4g/kg/day，0.8g/kg/day CP连续给药组过氧化物的荧光强度值分别显著性低于I/R组，结果显示CP可对I/R后过氧化物的产生有显著的抑制作用。

2.5.CP对心脏I/R后心肌细胞内MDA含量的影响(图5)

图5表示在灌60min后，Sham组、I/R组、CP0.1(6)+I/R组、CP0.4(6)+I/R组、CP0.8(6)+I/R组大鼠心脏左心室I/R区域组织的MDA含量。I/R60分钟后心肌组织MDA的含量相比于假手术组显著增加。CP连续预给药各剂量组均可以显著地抑制I/R诱导的丙二醛的含量的增高。CP0.1g/kg/day，0.4g/kg/day，0.8g/kg/day连续给药组和I/R组相比，MDA含量显著性的降低。结果显示CP可对I/R后氧化应激损伤的产生显著的抑制作用。

2.6．CP连续给药对心肌I/R后大鼠心肌SOD，CAT的影响(图6)

图6表示Sham组、I/R组、CP0.1(6)+I/R组、CP0.4(6)+I/R组、CP0.8(6)+I/R组大鼠心肌组织SOD(A)，CAT(B)的含量。假手组，I/R组以及CP连续预给药各剂量组SOD，CAT含量没有明显差异。

2.7.CP连续给药对心肌I/R后大鼠心肌NADPH oxidase亚基gp91^phox、p67^phox、p47^phox和p40^phox的影响(图7)

图7A显示各组大鼠心肌组织中细胞膜上gp91^phox、p67^phox、p47^phox和p40^phox蛋白表达的蛋白质印迹分析图像。与假手术组相比，I/R组大鼠心肌组织gp91^phox、p67^phox、p47^phox蛋白表达明显增加；CP连续给药各剂量组显著性的逆转由I/R诱导的大鼠心肌细胞膜上gp91^phox、p67^phox、p47^phox蛋白表达量的增加。假手组，I/R组以及CP连续预给药各剂量组p40^phox蛋白表达没有明显差异。

图7B显示各组大鼠心肌组织中gp91^phox、p67^phox、p47^phox和p40^phox蛋白表达量的统计结果。以各组大鼠心肌组织中gp91^phox、p67^phox、p47^phox和p40^phox蛋白表达量/GADPH为100%，I/R组大鼠心肌组织中gp91^phox、p67^phox和p47^phox蛋白表达量与假手术组相比显著性增加。CP连续给药各剂量组可以显著性抑制I/R引起的大鼠心肌组织细胞膜上gp91^phox、p67^phox和p47^phox蛋白表达的增加。各组p40^phox蛋白表达量均没有明显差异。

图7C显示各组大鼠心肌组织胞浆中p67^phox、p47^phox和p40^phox蛋白表达的蛋白质印迹分析图像。与假手术组相比，I/R组大鼠心肌组织中p67^phox和p47^phox蛋白表达明显降低；CP连续给药各剂量组显著性的逆转由I/R诱导的大鼠心肌细胞浆中p67^phox和p47^phox蛋白表达量的降低。假手组，I/R组以及CP连续预给药各剂量组p40^phox蛋白表达没有明显差异。

图7D显示各组大鼠心肌组织胞浆中p67^phox,p47^phox和p40^phox蛋白表达量的统计结果。以各组大鼠心肌组织胞浆中p67^phox,p47^phox和p40^phox蛋白表达量/Tublin为100%，I/R组大鼠心肌组织胞浆中p67^phox和p47^phox蛋白表达量与假手术组相比显著性降低。CP连续给药各剂量组可以显著性抑制I/R引起的大鼠心肌组织细浆中p67^phox和p47^phox蛋白表达的降低。各组p40^phox蛋白表达量均没有明显差异。

实验结果表明，CP可以显著性抑制由I/R引起的膜上gp91^phox含量的增加，以及NADPH oxidase亚基p67^phox和p47^phox从细胞浆中转移到细胞膜上。

4.实验结论

CP连续给药可以通过抑制NADPH oxidase亚基的转位和活化，降低I/R引起的氧化应激损伤。

附图说明

图1CP连续给药对大鼠心肌I/R后心肌梗死面积的影响

图2CP连续给药对心肌I/R损伤诱发组织学改变的影响

图3CP连续给药对心肌I/R后心肌细胞凋亡的影响

图4CP连续给药对I/R后外周血粒细胞过氧化物的影响

图5CP对心脏I/R后心肌细胞内MDA含量的影响

图6CP连续给药对心肌I/R后大鼠心肌SOD，CAT的影响

图7CP连续给药对心肌I/R后大鼠心肌NADPH oxidase亚基gp91^phox、p67^phox、p47^phox和p40^phox的影响

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

配方：丹参82.87%，三七16.21%，冰片0.92%。

制备方法：

步骤1，丹参、三七用8倍重量的水煮沸提取2次，第一次2小时，第二次1小时，混合提取液。

步骤2,提取液过滤浓缩。

步骤3，以提取物和冰片一起作为药物活性成分，基质为聚乙二醇，投料比为：提取物药物：基质=1：5.5，加入冰片，液体石蜡为冷凝剂，药物温度90℃，化料时间1.5小时，冷凝液温度1℃，滴距7cm，滴速每分钟35滴制备成滴丸。

实施例2

配方：丹参20%，三七79%，冰片1%。

步骤1，丹参、三七用2倍重量的水提取，提取次数为2次，每次提取1小时,混合提取液。

步骤2,提取液过滤浓缩。

步骤3，用步骤2提取物和冰片一起作为药物活性成分，基质为木糖醇与淀粉低共熔混合物，投料比为：提取物药物：基质=1：3，加入冰片，液体石蜡为冷凝剂，药物温度85℃，化料时间1小时，冷凝液温度‐2℃，滴距5cm，滴速每分钟30滴。

实施例3

市售复方丹参滴丸说明书

【功能主治】

活血化瘀，理气止痛，用于气滞血瘀所致的胸痹，症见胸闷，心前区刺痛冠心病心绞痛见上述证候者。

【主要成分】

复方丹参滴丸主要成分：丹参、三七、冰片。

【包装规格】

薄膜衣滴丸每丸重27mg，180丸/瓶。

【用法用量】

口服或舌下含服，一次10丸，一日3次，4周为一个疗程：或遵医嘱。

Claims (5)

1.复方丹参滴丸在制备治疗或预防氧化应激损伤的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，其中所述的应用是通过抑制NADPH氧化酶亚基的转位和活化实现的。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是复方丹参滴丸能抑制再灌注诱导的心肌细胞膜上gp91phox、p67phox、p47phox蛋白表达量的增加，逆转由再灌注诱导的心肌细胞浆中p67phox和p47phox蛋白表达量的降低。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是复方丹参滴丸能降低再灌注后组织中丙二醛和外周血中过氧化物的含量。

5.如权利要求1-4所述的应用，其特征在于，所述应用是指长期连续用复方丹参滴丸所达到的。