CN104144706B - 靶向递送至表达α‑V‑β‑3的细胞的整联蛋白拮抗剂结合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)化合物：其中R1、R2和n在详细描述和权利要求中定义。特别是，本发明涉及式(I)化合物用于制备和递送结合部分，例如小分子、肽、核酸、荧光部分和聚合物，其连接至α‑V‑β‑3整联蛋白拮抗剂，靶向表达α‑V‑β‑3的细胞。

Description

靶向递送至表达α-V-β-3的细胞的整联蛋白拮抗剂结合物
发明领域
本发明涉及包含适合的连接体和官能团的有效且选择性小分子整联蛋白拮抗剂的合成和反应，所述的官能团与包含活性亲核基团例如硫醇的其它分子发生化学反应，以致在连接部分和靶向实体之间形成共价连接。小分子靶向拮抗剂结合同源受体系统，如整联蛋白α-V-β-3(αVβ3)型受体拮抗剂结合αVβ3二聚体。共价连接的部分包括小分子治疗剂、聚合物、肽和寡核苷酸。所包括的是含有5’-硫代的寡核苷酸，用于形成5’-硫代-siRNA衍生物，作为能靶向递送所述siRNAs的工具。与适合的转染试剂连接的衍生化的siRNAs有助于向表达整联蛋白受体的细胞选择性递送siRNAs，从而通过RNA干扰(RNAi)阻断靶基因的表达。
发明背景
整联蛋白αVβ3型是玻连蛋白的受体[Hermann,P.等人,“The vitronectinreceptor and its associated CD47molecule mediates proinflammatory cytokinesynthesis in human monocytes by interaction with soluble CD23”The Journal ofcell biology144(1999)：767-75]。它由两个组分组成，整联蛋白αV和整联蛋白β3(CD61)，并且通过血小板以及其它细胞类型表达。已经显示αVβ3的抑制剂例如伊瑞西珠可以用作抗血管生成剂。
RNA干扰是众所周知的方法，其中信使RNA(mRNA)翻译成蛋白质被互补或部分互补的寡核苷酸的关联或结合而干扰，所述的寡核苷酸例如小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小RNA(miRNA)或反义寡核苷酸。siRNA是双链RNA分子，通常长度范围在19-25个核苷酸，其与细胞质中一套蛋白质关联，称为RISC(RNA-诱导的沉默复合体)。RISC最终分离双链siRNA，使得一条链结合或与互补的mRNA分子或mRNA分子的部分互补部分关联，之后mRNA被RISC破坏或另外阻断翻译，从而抑制编码蛋白质或基因产物的表达。
核酸例如siRNA用于治疗应用(特别是用于人的全身施用)的一个问题存在于递送核酸至：(1)特定靶组织或细胞类型和(2)那些细胞的细胞质(即存在mRNA并且翻译成蛋白质的地方)。部分递送问题在于这样的事实：核酸带负电荷，并且容易降解(特别是如果没有修饰)，能被肾脏有效过滤，并且无法通过自身容易地转运至细胞质。因此，大量研究集中在用多种载体和制剂(包括脂质体、微团、肽、聚合物、结合物和适配体)解决递送问题。参见Ling等人,Advances in Systemic siRNA Delivery,Drugs Future34(9)：721(2009年9月)。一些更有希望的递送载体已经涉及使用脂质系统，包括脂质纳米粒。参见Wu等人,Lipidic Systems for In Vivo siRNA Delivery,AAPS J.11(4)：639-652(2009年12月)；Hope等人的国际专利申请公布号WO2010/042877(“Improved Amino Lipids And MethodsFor the Delivery of Nucleic Acids”)。然而，仍需要进一步改善向特定靶细胞和向细胞质靶向siRNA以及其它物质，例如小分子、肽、其它核酸、荧光部分和聚合物。
发明概述
本发明涉及式I化合物：
其中R1、R2和n在详细描述和权利要求中定义。特别的是，本发明涉及式I化合物用于改善向表达αVβ3二聚体的靶细胞递送结合部分，例如小分子、肽、核酸、荧光部分和聚合物的递送，用于多种治疗和其它应用。本发明还涉及制备和使用这类化合物的方法。
附图简述
图1a)：表1显示了特别的5’-衍生的siRNA单链和双链的组成。
图1b)：表2显示了小分子siRNA结合物的分析数据。
图1c)：表3显示了小分子siRNA结合物在整联蛋白拮抗剂分析中的能力和siRNAKD数据。
图1d)：表4显示了FITC异构体标记的试剂的鉴别、表征和结合能力。
图1e)显示了直方图(红双链体-27 500nM和实施例140 10μM；绿双链体-27)。
图2显示了代表性的siRNA摄取图(双链体-27(500nM))。
图3显示了与10μM实施例FITC-5结合的FITC(LFA-1拮抗剂-标记的FITC)的Jurkat细胞图。
图4显示了与10μM实施例FITC-14结合的FITC(VLA-4拮抗剂标记的FITC)的Jurkat细胞图。该直方图表示存在含有VLA-4靶向元件的siRNA双链体时的迁移。存在VLA-4拮抗剂实施例140时，这种迁移是扁圆形的。
图5显示了当用siRNA双链体处理时H1299细胞中AHA1表达的降低，所述的双链体在5’-正义链上用整联蛋白靶向小分子衍生化。y-轴表示观察到的AHA1表达水平。更低的棒表示更大程度的敲除(更高程度的siRNA转染)；高棒表示更低程度的敲除(即更低程度的siRNA转染)。蓝色的双链体在正义链的5’-末端上有靶向修饰；粉色那些在正义链的5’-末端上有靶向修饰以及Nu547荧光团连接到反义链的5’-末端。
图6显示了GAPDH mRNA表达水平，细胞健康的标志物。对于用衍生的siRNA处理的那些细胞，与模拟和未处理细胞类似的表达水平表明在处理浓度和过程中不存在细胞毒性。
发明详述
除非另外说明，否则下列描述和权利要求中所用的具体术语和短语如下定义：
术语“部分”表示原子或化学键合的原子的基团，其通过一个或多个化学键连接另外的原子或分子，从而形成分子的部分。例如，式I的变量R1和R2表示通过所示的共价键连接到式I所示结构的部分。
术语“结合部分”表示治疗或可用化合物、肽、聚合物、小分子、荧光部分、寡核苷酸或核酸部分。实例包括药物、治疗肽、反义寡核苷酸、siRNA和异硫氰酸荧光素(FITC)。
除非另外说明，否则术语“氢”表示氢原子部分(-H)，而不是H2。
术语“卤素”表示氟、氯、溴或碘部分。
术语“烷基”表示具有1至12个碳原子的单价直链或支链的饱和烃基团。在特别的实施方案中，烷基具有1至7个碳原子，并且在更特别的实施方案中具有1至4个碳原子。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
术语“TFA”表示三氟乙酸。
除非另外说明，否则术语“式…化合物”表示选自结构式定义的化合物类的任何化合物(如果没有另外说明，包括任何此类化合物的任何可药用盐或酯)。
术语“可药用盐”表示保留游离碱或游离酸的生物功效和性质的那些盐，其不是生物学的或另外不需要的。盐可以用无机酸形成，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，优选盐酸，可以用有机酸形成，例如乙酸、丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、水杨酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对-甲苯磺酸、N-乙酰基半胱氨酸等。此外，盐可以通过向游离酸中加入无机碱或有机碱而制备。无机碱衍生的盐包括但不限于钠、钾、锂、铵、钙和镁盐等。有机碱衍生的盐包括但不限于伯、仲、叔胺、取代的胺(包括天然存在的取代的胺)、环胺和碱性离子交换树脂，例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、聚胺树脂等的盐。取决于取代模式，本发明化合物还可以作为两性离子存在。
本发明化合物可以以可药用盐形式存在。本发明化合物还可以以可药用酯形式存在(即式I酸的甲酯和乙酯，用作前药)。本发明化合物还可以是溶剂化的，即水合的。溶剂化可以在制备过程中形成或由于最初的式I无水化合物的吸湿性引起(水合)。
具有相同分子式但性质或它们原子的键合顺序或它们原子空间排列不同的化合物称为“异构体”。它们原子空间排列不同的异构体称为“立体异构体”。非对映异构体是在一个或多个手性中心上存在对立构型的立体异构体，其不是对映异构体。存在一个或多个不对称中心且彼此不能重叠镜像的立体异构体称为“对映异构体”。当化合物含有不对称中心，例如，如果碳原子键合四个不同基团，一对对映异构体是可能的。对映异构体可以通过它的不对称中心的绝对构型来表征，并且通过Cahn、Ingold和Prelog的R-和S-顺位规则或通过其中分子旋转偏振光平面的方式描述，并命名为右旋或左旋(即分别为(+)或(-)-异构体)。手性化合物可以作为单个对映异构体或作为其混合物存在。含有等比例对映异构体的混合物称为“外消旋混合物”。
术语“治疗有效量”表示化合物的量，其能有效预防、缓解或改善疾病的症状或延长所治疗个体的生存。治疗有效量的确定在本领域技术内。本发明化合物的治疗有效量或剂量可以在宽泛的限量内变化，并且可以以本领域已知的方法测定。该剂量在每个具体病例中将调至单个需求，包括具体施用的化合物、施用途经、治疗的病症以及治疗的患者。日剂量可以以单个剂量或分开的剂量施用，或用于非肠道施用，它可以是连续输注给药。
术语“可药用载体”旨在包括任何和所有与药物施用相容的材料，包括溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂以及其它与药物施用相容的材料和化合物。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容之外，其在本发明组合物中的用途值得考虑。补充的活性化合物也可以掺入到组合物中。
具体而言，本发明涉及式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n为1-24，并且其中：R1选自：
(1)下式化合物：
其中m是0或1；
(2)下式化合物：
其中X是N或CH；
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
(5)下式化合物：
R2选自：
(1)下式化合物：
(2)下式化合物：
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
上面结构中所用的符号用于表示结构或部分通过共价键连接到基础分子的地方。此外，与上面符号一起使用的短语“至PEG”或“至S”或类似语言表示如果存在多重连接点，结构或部分连接到基础分子的地方或如何连接到基础分子。例如，如果R2是下式化合物：
其中X是下式化合物：
那么基于式I的结构是：
其中R1、R3和n如式I所定义的。
本发明还涉及制备和使用式I化合物的方法以及包含这类化合物的药物组合物。式I化合物可用于改善小分子、蛋白质、核酸、聚合物、荧光标志物和其它物质递送至表达αVβ3受体的靶细胞。在特别的实施方案中，本发明涉及包含式I化合物的组合物和制剂，其可用于将siRNA递送至表达αVβ3受体的靶细胞质，通过RNA干扰抑制某些靶蛋白的表达。
在更特别的实施方案中，本发明涉及式I化合物在制剂中有助于将核酸例如siRNA递送至表达αVβ3受体的肿瘤细胞和其它细胞类型的用途。而且，式I化合物在合成递送制剂治疗炎症和增殖性障碍例如癌症中的用途是本发明的部分。
R1表示小分子整联蛋白拮抗剂，其靶向式I化合物至整联蛋白受体复合物，从而有助于递送至表达这类受体的细胞。
在特别的实施方案中，靶向R1部分的小分子整联蛋白拮抗剂连接在这样位点，以致相比游离的小分子整联蛋白拮抗剂，小分子与整联蛋白受体的结合亲和力基本上没有降低。式I的R1部分靶向αVβ3整联蛋白二聚体。
在特别的实施方案中，R1是下式的αVβ3整联蛋白靶向部分：
或其可药用盐或酯，其中m是0或1。
在其它实施方案中，R1是下式的αVβ3整联蛋白靶向部分：
或其可药用盐或酯，其中X是N或CH。
在其它实施方案中，R1是下式的αVβ3整联蛋白靶向部分：
或其可药用盐或酯。
在其它实施方案中，R1是下式的αVβ3整联蛋白靶向部分：
或其可药用盐或酯。
在其它实施方案中，R1是下式的αVβ3整联蛋白靶向部分：
或其可药用盐或酯。
R2可以表示活性部分，其可以与治疗剂或其它有用化合物或含有强亲核基团的结合部分，例如含硫羟基的分子形成共价连接。这些活性部分的实例包括选自下列的部分：
或者，R2可以表示已经连接至结合部分的部分，所述的结合部分例如治疗剂或其它有用化合物、蛋白质或寡核苷酸(R3)。更特别地，R2可以表示下式部分：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
在特别的实施方案中，R3表示寡核苷酸。在更特别的实施方案中，R3表示RNA分子正义链的5’-末端，其可以以单链或双链体例如siRNA分子存在。该siRNA分子，也称为RNAi剂，抑制细胞中靶基因的表达。在特别的实施方案中，R3是siRNA分子，其基本上由长度15至30个核苷酸的寡核糖核苷酸链组成，其中正义寡核糖核苷酸链的5’端偶联至上面结构所示的R2，并且与对应于靶基因的mRNA的至少一部分互补。在其它实施方案中，R3是在它的5’-末端连接的DNA的寡核苷酸。这些衍生化的DNA可以以单链或与另一个寡核苷酸互补链杂交的一条链存在。寡核苷酸链可以是未修饰的或为了代谢稳定性而修饰的。这些修饰包括但不限于在磷酸酯(例如硫代磷酸酯)和2’-羟基(例如2’-O-甲基和2’-氟)上在特定位点取代。
在特别的实施方案中，式I的R2表示-X-S-CH2-R3，其中R3包括下面式5(基于式I)所示的RNA的正义链：
其中R1、n和X如式I所定义的。
在其它特别的实施方案中，正义链可以结合至反义链。
在其它特别的实施方案中，R2表示-X-S-CH2-R3，其中R3表示小分子或蛋白质，从而形成共价连接的，特别是式I的靶向实体。
在更特别的实施方案中，R2表示-X-S-CH2-R3，其中R3表示治疗小分子或蛋白质。
在其它特别的实施方案中，R2表示-X-S-CH2-R3，其中R3表示可用于使用细胞显微技术显影这些整联蛋白受体结合的荧光部分。
在其它特别的实施方案中，R2表示-X-S-CH2-R3，其中R3表示具有初级(primary)活性硫化物的聚合物。更特别地，R3可以表示可用于复合和递送siRNA至细胞表面和细胞质区域的阳离子聚合物。
在更特别的实施方案中，本发明涉及式I化合物，其中R3是下面所示的异硫氰酸荧光素(FITC)的一种结构异构体：
在其它更特别的实施方案中，本发明涉及式I化合物，其中R3是下面所示的FITC-14的一种结构异构体：
在其它实施方案中，本发明涉及式I化合物，其中n是9-13，优选12。
在更特别的实施方案中，本发明涉及选自下列化合物(或其可药用盐或酯)之一的式I化合物：
αVβ3配体试剂1：(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；
αVβ3配体试剂2：(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；
αVβ3配体试剂3：(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸三氟乙酸盐；
αVβ3配体试剂4：(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(四氢嘧啶-2-亚基氨基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；
αVβ3配体试剂5：(S)-N-[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]甲基]苯基]-3-[2-[[2-(3-苄基脲基)噻唑-4-羰基]氨基]乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；
αVβ3配体试剂6：(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；
αVβ3配体试剂7：(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙氧基]-苯基]-3-[2-[[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；
αVβ3配体试剂8：(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-乙酰基硫烷基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；
αVβ3配体试剂9：(R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-(2-{2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苄基}-脲基]-噻唑-4-羰基)-氨基}-乙酰基氨基]-苯基-3-基-丙酸；
αVβ3配体试剂10：3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苄基}-脲基]-噻唑-4-羰基)-氨基}-乙酰基氨基]-苯基-3-基-丙酸；
αVβ3配体试剂11：(R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-(2-{2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苄基}-脲基]-噻唑-4-羰基)-氨基}-乙酰基氨基]-3-吡啶-3-基-丙酸；
αVβ3配体试剂12：(R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苄基}-脲基]-噻唑-4-羰基)-氨基}-乙酰基氨基]-3-吡啶-3-基-丙酸；
此外，本发明涉及包含式I化合物的新组合物和制剂用于制备与siRNA组合的纳米粒，导致核酸例如siRNA向表达α4β3二聚体的靶细胞质的递送的改善。在特别的实施方案中，本发明涉及siRNA制剂，包含：(1)式I化合物，其中R2包含5’-siRNA寡核苷酸；和(2)聚阳离子转染剂。
本发明还涉及制备和使用这类化合物和组合物的方法。式I化合物可用作组合物或制剂的组分，其改善药物、核酸或其它治疗化合物向表达αVβ3二聚体的组织或细胞的递送。在特别的实施方案中，本发明涉及包含式I化合物的制剂，其可用于递送siRNA至表达αVβ3二聚体的靶细胞质，从而通过RNA干扰抑制某些蛋白质的表达。在更特别的实施方案中，本发明涉及式I化合物和包含这类化合物的组合物，其可以有效递送siRNA至表达αVβ3二聚体的肿瘤细胞和其它细胞类型，用于治疗癌症或炎性疾病。这类化合物和组合物更加有效，并且证明相比不含式I化合物的类似制剂，改善了敲除能力。
本发明化合物的通用合成
实施例中提供了合成式I化合物的适合的方法。通常，式I化合物可以根据下面所示的流程图制备。除非另外说明，否则下面流程图中变量n以及R1和R2是如先前式I定义的相同方式定义。
马来酰亚胺-(PEG)n-整联蛋白拮抗剂结合剂的通用合成
不同长度PEG的化合物例如流程图1中的26是可商购获得的(例如购自PierceBioScience)。这类化合物还可以通过将PEG氨基酸的氨基末端与3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酸在酰胺键形成条件下酰化，随后通过在成酯条件下N-羟基琥珀酸反应形成活性N-羟基琥珀酸酯而制备。如流程图1所示，化合物26与含有伯胺或仲胺的化合物例如27的反应是在非质子或质子溶剂中在碱性胺例如DIEA(二异丙基乙基胺)的存在下在室温进行，产生PEG化的中间体28。
含有不同长度PEG部分的化合物例如流程图2中的29(其中R4是硫代乙酰基或2-二硫代吡啶基)也是可商购获得的(例如购自Pierce BioScience)。含有结构29的化合物与含有伯胺或仲胺的化合物例如27的反应是在非质子或质子溶剂中在碱性胺例如DIEA(二异丙基乙基胺)的存在下在室温进行，产生PEG化的中间体30。
作为本发明的一个特别而非限制性实例，中间体26与31反应，产生马来酰亚胺中间体32，如流程图3所示：
以类似的方式，中间体26可以与33反应，产生马来酰亚胺中间体34，如流程图4所示：
以类似的方式，中间体29可以与35反应，产生中间体36，如流程图5所示，其中R4表示硫代乙酰基或2-二硫代吡啶基：
以类似的方式，中间体29可以与37反应，产生中间体38，如流程图6所示，其中R4表示硫代乙酰基或2-二硫代吡啶基：
对于通用结构26或29的化合物，不同PEG长度是可获得的或通过本领域技术人员易于制备；优选n＝8-24。这个主题已被充分报道和论述(例如Chemistry for peptide andprotein PEGylation,Advanced Drug Delivery Reviews第54卷,第4期,2002年6月17日,第459-476页)。
中间体31可以类似于已经报道的方式合成(例如Sidduri,A.等人Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2002,12,2475-2478)，如流程图7所示：
特别地，如流程图7所示，中间体41是由商购可获得的(S)-3-[4-硝基苯基]-2叔丁氧基羰基氨基-丙酸40制备。商购可获得的原料40的硝基在甲醇溶液中用锌粉在氯化铵存在下在室温还原数小时，产生苯胺41。硝基还原的其它方法是本领域技术人员已知的。苯胺41是用苯甲酰基卤化物衍生物例如2,6-二氯苯甲酰氯42在非质子溶剂例如二氯甲烷中在碱例如二异丙基乙基胺的存在下在室温酰化。在这个方法中，形成酰胺43。叔丁基羰基(Boc)胺保护基是根据本领域技术人员已知的标准方法除去，例如用HCl的二烷溶液在室温处理；这产生盐酸盐44。将盐酸盐44用酰胺键形成条件(本领域技术人员熟知的)在已知的1-(2-叠氮基-乙基)-环戊烷甲酸45的存在下处理，产生二酰胺46。中间体46的叠氮基是通过用三烷基膦在非质子溶剂例如四氢呋喃中在室温处理而被还原。进一步，甲酯是通过用氢氧化钠在溶剂混合物例如乙醇和四氢呋喃中在升高的温度例如50℃处理15小时而被皂化。这步处理形成中间体31，其还可以以两性离子存在。
PEG部分的连接也可以用中间体39，其是如流程图8所示的合成。特别地，3,5-二氯苯酚47是用三异丙基甲硅烷基氯在碱例如咪唑的存在下在极性非质子溶剂例如DMF中在与强碱例如丁基锂在无水四氢呋喃中在低温例如-78℃反应前被保护。产生的锂复合物用以干冰形式加入的二氧化碳猝灭，产生中间体48，苯甲酸衍生物。然后将中间体48通过在非质子溶剂例如甲苯中用磺酰氯(SOCl2)处理而被氯化形成酰基氯。同时，将酰基氯与胺盐酸盐49在碱例如二异丙基乙基胺(DIPEA)存在下在非质子溶剂例如二氯甲烷(DCM)中反应，从而形成中间体50。中间体50的甲硅烷基保护基是通过用四丁基氟化铵(TBAF)在质子溶剂例如四氢呋喃中在室温处理而被除去。该苯酚中间体在碱例如碳酸钾(K2CO3)存在下在非质子溶剂例如二甲基甲酰胺(DMF)中与3-N-叔丁基-氨基甲酸酯-1-溴丙烷反应。在该方法中形成中间体52，用三氟乙酸(TFA)脱保护，随后用碱例如氢氧化钠在质子溶剂例如乙醇中水解后其形成中间体39：
αVβ3拮抗剂衍生剂的合成
中间体117，αVβ3靶向模块，可以如下面流程图15所示的合成。简而言之，将间-氨基苯甲酸110与N,N-二-Boc-甲基硫脲111在DMF、二氯甲烷和吡啶中在乙酸汞的存在下反应。同时，将苄基酯保护的甘氨酸在标准肽形成条件下偶联至上面反应产物的羧酸。苄基酯是通过氢解条件除去的，从而提供游离酸112。在不同的反应顺序中，将对-硝基苯酚113与(2-羟基-乙基)氨基甲酸叔丁酯在三苯基膦和偶氮二甲酸二异丙酯的存在下在非质子溶剂例如四氢呋喃中偶联。该产物的硝基被还原成相应的苯胺114，在酰胺键形成条件下向其偶联N-α-Fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯。通过用哌啶处理除去氨基保护基Fmoc后，氨基末端在标准酰胺键形成条件下再次偶联至中间体115，形成中间体116。用强酸例如三氟乙酸处理后，形成中间体117，并且通过本领域技术人员熟知的纯化方法分离(例如制备型HPLC)。
可以以流程图15所示的类似方法制备117的3-碳链胺类似物，使用(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯代替(2-羟基乙基)氨基甲酸叔丁酯。
如下面流程图16所示可以合成其它αVβ3靶向模块。已经报道了2-氨基-噻唑-4-甲酸甲酯120(Amide derivatives and their preparation and use as pesticides,ByKobayashi,Yumi；Daido,Hidenori；Katsuta,Hiroyuki；Nomura,Michikazu；Tsukada,Hidetaka；Hirabayashi,Atsushi；Takahashi,Yusuke；Aoki,Yoji；Kawahara,Atsuko；Fukazawa,Yasuaki；等人US Pat.Appl.Publ.(2011),US 20110201687 A120110818)。中间体120是在标准酰胺键形成条件下与丙氨酸甲酯盐酸盐121反应，从而产生酯中间体122。单独地，3-(2-(氨基甲基)苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯129是通过N-(2-羟基苄基)乙酰胺127在非质子溶剂例如DMF中与3-溴丙基氨基甲酸叔丁酯124在碱例如碳酸钾的存在下反应而制备。中间体129的氨基用水合肼处理而暴露。产生的游离胺130用三光气处理，产生异氰酸酯131，将其与[(2-氨基-噻唑-4-羰基)-氨基]-乙酸甲酯132在非质子溶剂例如DMF中混合，产生中间体133。中间体133的甲酯的转化是在标准皂化条件下实现的，随后与可商购获得的3-氨基-3-苯基丙酸甲酯盐酸盐146或3-氨基-3-(3-吡啶基)丙酸甲酯盐酸盐的对映异构纯的异构体147和148在标准酰胺键形成反应条件下偶联，从而形成中间体135。Boc保护基是在标准条件下除去，形成αVβ3靶向小分子136。
用于下列实施例的反应流程图16：αVβ3配体试剂9、αVβ3配体试剂10、αVβ3配体试剂11和αVβ3配体试剂12：
用途
式I化合物可用于递送结合部分例如治疗剂、小分子、肽、核酸、荧光部分和聚合物至表达αVβ3整联蛋白受体复合物的靶细胞，用于多种治疗和其它应用。因此，式I化合物可以用于治疗与αVβ3表达或过表达相关的多种疾病和病症。这些疾病和病症可以包括炎症、癌症和代谢相关的疾病。
在特别的实施方案中，本发明包括治疗或预防需要该治疗的哺乳动物(优选人)中的癌症，其中该方法包括施用治疗有效量的式I化合物。这些组合物可以以符合良好医学实践的方式施用。本文考虑的因素包括所治疗的具体障碍、所治疗的具体哺乳动物、单独患者的临床情况、障碍原因、活性剂的递送部位、施用方法、施用方案和医师所知的其它因素。施用的化合物的“有效量”通过这些考虑来调节，如治疗或预防疾病或病症(例如抑制靶蛋白的表达)所需的最小量并且避免不可接受的毒性。例如，该量可以低于对正常细胞或整个哺乳动物有毒的量。包含本发明的式I化合物的组合物可以通过非肠道、腹膜内和肺内施用。非肠道输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
实施例
本发明将通过参考下列实施例更全面地理解。然后，它们不应被理解为限制本发明范围。
试剂购自Aldrich、Sigma和Pierce BioScience或下面所示的其它供应商，并且无需进一步纯化而使用。毫克级至克级规模的纯化是通过本领域已知的方法完成的，例如硅胶快速柱洗脱。在某些情况下制备型快速柱纯化还通过使用一次性预装克级硅胶柱(RediSep)完成，用CombiFlash系统洗脱。BiotageTM和ISCOTM也是快速柱仪器，其可以用于本发明纯化中间体。
为了判断化合物真伪和纯度的目的，LC/MS(液相色谱/质谱)谱用下列系统记录。对于质谱测定，系统包括Micromass Platform II谱仪：ES离子化，正离子模式(质量范围：150-1200amu)。并行的色谱分离是用下列HPLC系统完成：ES Industries Chromegabond WRC-18 3u(3.2×30mm)柱；流动相A：水(0.02％TFA)，流动相B：乙腈(0.02％TFA)；梯度3分钟内由10％B至90％B；平衡时间1分钟；流速2mL/分钟。在某些情况下，20毫摩尔浓度的乙酸铵用作改性剂，用于制备型HPLC过程中的有效离子化。在此类情况下，分离铵盐。
对于某些分离，使用超临界流体色谱法也是有用的。超临界流体色谱法分离是用Mettler-Toledo Minigram系统进行的，使用下列典型条件：100巴，30℃，2.0mL/分钟洗脱12mm AD柱，在超临界流体CO2中使用40％MeOH。在含有碱性氨基的分析物情况下，向甲醇改性剂中添加0.2％异丙胺。
化合物是通过用Varian Inova400MHz NMR谱仪或Varian Mercury300MHz NMR谱仪的1H-NMR以及通过应用Bruker Apex-II高分辨4.7T FT-质谱仪的高分辨质谱法表征。最终化合物还通过使用Thermo Electron 销售的LTQ CL Orbitrap的高分辨质谱法表征。
本文所用的缩略语如下：
AIBN 2,2’-偶氮二异丁腈
Bu 丁基
DCE 1,2-二氯乙烷
DCM 二氯甲烷
DBU 1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一-7-烯
DIAD 偶氮二甲酸二异丙酯
DIEA 二乙胺
DIPEA 二异丙基乙基胺
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
EDC-HCl 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
FCC 快速柱色谱
h 小时
HBTU O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐
HOBt 羟基苯并三唑
HPLC 高压液相色谱
HRMS 高分辨质谱
LRMS 低分辨质谱
LC 液相色谱
L-Pro L-脯氨酸
MCPBA 间-氯过氧基苯甲酸
MeOH 甲醇
MW 微波
NIS N-碘琥珀酰亚胺
NBS N-溴琥珀酰亚胺
NMP 1-甲基-2-吡咯烷酮
PdCl2(dppf) [1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)
PEGn 重复n次的聚乙二醇(例如PEG2＝-OCH2CH2OCH2CH2-)
PG 保护基
PyBroP 溴-三-吡咯烷子基-磷六氟磷酸盐
rt 室温
TBAF 四丁基氟化铵
TBDMS 叔丁基二甲基甲硅烷基
TBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐
TMS 三甲基甲硅烷基
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱
TPP 三苯基膦
靶向αVβ3的化合物的合成
实施例1
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；αVβ3配体试剂1
步骤1：3-(N,N-二丁氧基羰基胍基)-苯甲酸的制备：
将3-氨基苯甲酸(82.3g，0.60摩尔)、N,N’-二(叔丁氧基羰基)-S-甲基异硫脲(1,3-二-boc-2-甲基异硫脲，CAS#107819-90-9)(174.2g，0.6摩尔)和吡啶(94.92g，97mL，1.20摩尔，2.0当量)的无水二甲基甲酰胺(600mL)和无水1,2-二氯乙烷(600mL)的混合物溶液用乙酸汞(95.6g，0.30摩尔，0.5当量)处理，并且在室温用悬臂式机械搅拌机搅拌5小时。然后，过滤除去固体，并且用二氯甲烷洗涤，并且将合并的滤液和洗涤液蒸发，得到粗产物(～307g)。向该粗产物中加入甲醇(240mL)，并且将混合物剧烈搅拌2小时。然后，缓慢加入2400mL水，同时剧烈搅拌。过滤，用水彻底洗涤固体，并且过夜吸干，得到超过理论产量的3-(N,N-二丁氧基羰基胍基)-苯甲酸。高真空泵干燥。
获得的重量超过理论值(理论值＝227.6g，实际值＝251.2g1H NMR表示存在～10％DMF)。
步骤2：2-(3-(N,N-二叔丁氧基羰基胍基)苯甲酰基)-氨基-乙酸苄酯的制备：
将淡棕色的3-(N,N-二叔丁氧基羰基胍基)苯甲酸(171.56g，0.4073摩尔)、2-氯-4,6-二甲氧基-三嗪(71.52g，0.4073摩尔)和N-甲基吗啉(41.2g，44.78mL，0.4073摩尔)的无水四氢呋喃(1600mL)溶液在室温搅拌(悬臂式机械搅拌机)2小时，然后加入甘氨酸苄酯p-TsOH盐(137.44g，0.4073摩尔)和第二个当量的N-甲基吗啉(41.2g，44.78mL，0.4073摩尔)。将产生的混合物在室温搅拌36小时。然后，在旋转蒸发仪上除去四氢呋喃，然后加入乙酸乙酯(2000mL)。将产生的混合物依次用冰冷的0.5N HCl(3×1000mL)、水(1×1000mL)、5％碳酸钠水溶液(1×1000mL)、水(1×1000mL)、饱和氯化钠水溶液(1×1000mL)洗涤，并且经硫酸钠干燥。过滤除去固体，并且蒸发溶剂，得到粗产物(228.5g)，为油状物。将粗产物在Waters Prep500(10次运行)上通过色谱纯化，使用40:45:15的二氯甲烷:己烷:乙酸乙酯为洗脱液，得到2-(3-(N,N-二叔丁氧基羰基胍基)苯甲酰基)-氨基-乙酸苄酯(79.3％产率)。(注意：第一次运行得到152g干净材料，两次再色谱运行中得到33g少量杂质)。ES(+)-HRMSm/e计算值C27H34N4O7(M+H)+527.2500，观察值527.2499。
步骤3：2-(3-(N,N-二叔丁氧基羰基胍基)苯甲酰基)-氨基-乙酸的制备
将2-(3-(N,N-二叔丁氧基羰基胍基)苯甲酰基)-氨基-乙酸苄酯(170.0g，0.323摩尔)的无水乙醇(2000mL)溶液经10％钯炭(20g湿的催化剂，其包含～50％水)在60psi和室温在高压装置中氢化过夜(18小时)。过滤除去催化剂，并且蒸发溶剂，得到产物。产物用甲苯共沸(3次)，除去所有乙醇，得到2-(3-(N,N-二叔丁氧基羰基胍基)苯甲酰基)-氨基-乙酸(97.88％产率)，为白色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C20H28N4O7(M+H)+437.2031，观察值437.2030。
步骤4：[3-(4-硝基-苯氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯的制备：
在室温和氮气气氛下向(3-羟基-丙基)-氨基甲酸叔丁酯(7.03g，40.1mmol)的无水THF(40mL)溶液中加入4-硝基苯酚(5.07g，36.5mmol)、三苯基膦(10.5g，40.1mmol)。将产生的溶液用冰水浴冷却至～0℃，然后历经15-20分钟滴加偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，8.1g，40.1mmol)。加入后，将溶液温至室温，并且搅拌15小时，同时LCMS分析表明存在16％的原料。然后，加入另外的0.1当量的所有上面试剂，并且将反应混合物再搅拌15小时。过滤除去固体并且用乙酸乙酯洗涤，然后将滤液用饱和氯化钠溶液洗涤，并且经无水硫酸镁干燥。过滤并且浓缩得到粗制残留物，其用ISCO(340g)柱色谱纯化，得到[3-(4-硝基-苯氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯(64％产率)，为白色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C14H20N2O5(M+Na)+319.1264，观察值319.1266。
步骤5：[3-(4-氨基-苯氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯的制备：
在室温向[3-(4-硝基-苯氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯(7.7g，26mmol)的甲醇(200mL，加热溶解原料)溶液中加入水(10mL)、氯化铵(20.9g，390mmol，15当量)和锌粉(16.4g，260mmol，10当量，3-份)。加入锌粉后，反应混合物是放热的，并且将反应混合物搅拌1-2小时，此时混合物的TLC分析表明原料不存在。然后，过滤除去固体，并且用水和乙酸乙酯洗涤，并且将滤液中的有机化合物用乙酸乙酯萃取(3×100mL)。合并的萃取物用盐水溶液洗涤，并且经无水硫酸镁干燥。过滤并且浓缩得到粗残留物，其用ISCO(330g)柱色谱纯化，分离得到[3-(4-氨基-苯氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯(79％产率)，为白色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C14H22N2O3(M+Na)+289.1522，观察值289.1523。
步骤6：(S)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-3-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-琥珀酰胺酸叔丁酯的制备：
在室温向[3-(4-氨基-苯氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯(5.41g，20.2mmol)和(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-琥珀酸叔丁酯的DMF(40mL)溶液中加入HOBT(3g，22.2mmol)和DIPEA(8.52g，66.6mmol)。将产生的溶液用冰浴冷却至0℃，并且历经5-10分钟分3批加入固体HBTU(8.43g，22.2mmol)。加入后，除去冷却浴，并且将反应混合物温至室温，并且搅拌2.5小时，此时LCMS分析表明原料不存在。然后，反应混合物用乙酸乙酯(400mL)稀释，并且用水(400mL)、饱和碳酸氢钠溶液(400mL)和盐水溶液(400mL)洗涤。经无水硫酸镁干燥后，浓缩滤液，并且将粗残留物用ISCO(330g)柱色谱纯化，分离得到(S)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-3-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-琥珀酰胺酸叔丁酯(95％产率)，为白色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C37H45N3O8(M+Na)+682.3099，观察值682.3105。
步骤7：(S)-3-氨基-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-琥珀酰胺酸叔丁酯的制备：
在室温向(S)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-3-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-琥珀酰胺酸叔丁酯(11g，16.67mmol)的THF(95mL)溶液中加入哌啶(4.26g，50mmol)。将产生的溶液搅拌4小时，此时LCMS分析表明原料不存在。然后，真空除去溶剂，并且将残留物与甲苯共沸，得到白色固体，将其在热条件下溶于最小量乙酸乙酯(25-30mL)中，然后将其用己烷(250-300mL)稀释，直至沉淀。过滤收集产生的固体，并且用己烷洗涤，空气干燥后得到(S)-3-氨基-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-琥珀酰胺酸叔丁酯(81％产率)，为白色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C22H35N3O6(M+Na)+460.2418，观察值460.2416。
步骤8：(S)-3-(2-(3-(N,N-二叔丁氧基羰基胍基)-苯甲酰基氨基)-乙酰基氨基)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-琥珀酰胺酸叔丁酯的制备：
在室温和氮气气氛下向(S)-3-氨基-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-琥珀酰胺酸叔丁酯(2.0g，4.58mmol)、2-(3-(N,N-二叔丁氧基羰基胍基)苯甲酰基)-氨基-乙酸(2.0g，4.58mmol)、HBTU(1.91g，5.04mmol)和HOBT(681mg，5.04mmol)的混合物中加入DMF(15mL)，随后加入DIPEA(1.95g，15.12mmol)。将产生的淡棕色溶液搅拌2天，此时形成大量凝胶样固体。然后加入水(～50mL)，并且将产生的淡棕色糊状物在热条件下溶于乙酸乙酯(～200mL)。然后，分离两层，并且将水层用乙酸乙酯(100mL)再萃取一次。合并的乙酸乙酯萃取物用饱和碳酸氢钠溶液、水和盐水溶液洗涤，然后将有机层经无水硫酸镁干燥。过滤并且浓缩得到粗淡棕色固体，其用ISCO(120g)柱色谱纯化，分离得到(S)-3-(2-(3-(N,N-二叔丁氧基羰基胍基)-苯甲酰基氨基)-乙酰基氨基)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-琥珀酰胺酸叔丁酯(94％产率)，为白色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C42H61N7O12(M+H)+856.4450，观察值856.4451。
步骤9：(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧基)-苯基]-3-(2-(3-(胍基)-苯甲酰基氨基)-乙酰基氨基)-琥珀酰胺酸三氟乙酸盐αVβ3配体-1的制备：
在0℃(冰浴)和氮气气氛下向(S)-3-(2-(3-(N,N-二叔丁氧基羰基胍基)-苯甲酰基氨基)-乙酰基氨基)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-琥珀酰胺酸叔丁酯(3.7g，4.32mmol)的二氯甲烷(80mL)溶液中加入过量的三氟乙酸(40mL)。将产生的无色溶液在该温度下搅拌1-2小时，然后除去冷却浴，将其温至室温。搅拌15小时后，真空除去溶剂，并且残留物与甲苯共沸。产生的深蓝色糊状物与叔丁基甲基醚研磨，但没有得到好的固体。然后，真空除去溶剂，残留物与二氯甲烷和乙醚研磨。过滤收集产生的淡棕色固体，并且用乙醚洗涤。空气干燥后，分离得到2.7g(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧基)-苯基]-3-(2-(3-(胍基)-苯甲酰基氨基)-乙酰基氨基)-琥珀酰胺酸，为三氟乙酸盐(85％产率)。ES(+)-HRMS m/e计算值C23H29N7O6(M+H)+500.2252，观察值500.2252。
步骤10：(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；αVβ3配体试剂1的制备：
在室温和氮气气氛下向(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧基)-苯基]-3-(2-(3-(胍基)-苯甲酰基氨基)-乙酰基氨基)-琥珀酰胺酸(245mg，0.289mmol)和3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(200mg，0.289mmol)的DMSO溶液(5mL)加入过量DIPEA(186mg，252uL，1.44mmol)。将产生的淡黄色溶液搅拌2小时，此时LCMS分析表明原料不存在。然后，真空除去过量的DIPEA，并且通过HPLC纯化分离所需的产物，得到212mg(68％产率)(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸，为淡黄色固体。ES(+)-HRMS m/e计算值C49H71N9O18(M+H)+1074.4990，观察值1074.4984。
实施例2
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的制备；αVβ3配体试剂2：
标题化合物是用实施例1步骤10中描述的类似方法制备，由(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧基)-苯基]-3-(2-(3-(胍基)-苯甲酰基氨基)-乙酰基氨基)-琥珀酰胺酸(245mg，0.289mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(250mg，0.289mmol)和DIPEA(373mg，503uL，2.89mmol)开始，HPLC纯化后，得到淡棕色油状物(312mg，86％)。ES(+)-HRMSm/e计算值C57H87N9O22。(M+H)+1250.6039，观察值1250.6032。
实施例3
(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸三氟乙酸盐的制备；αVβ3配体试剂3
标题化合物是用实施例1步骤10中描述的类似方法制备，由(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧基)-苯基]-3-(2-(3-(胍基)-苯甲酰基氨基)-乙酰基氨基)-琥珀酰胺酸(245mg，0.289mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(172mg，0.289mmol)和DIPEA(503uL，2.89mmol)开始，HPLC纯化后，得到淡黄色粘稠油状物(172mg，73％)。ES(+)-HRMSm/e计算值C44H67N7O16S(M+H)+982.4438，观察值982.4432。
实施例4
(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(四氢嘧啶-2-亚基氨基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；αVβ3配体试剂4：
步骤1：2-[3-(苄基氧基羰基甲基氨基甲酰基)苯基亚氨基]-二氢嘧啶-1,3-二甲酸二叔丁酯的制备：
标题化合物是用实施例1步骤2描述的类似方法制备，由2-[3-羧基苯基亚氨基]-二氢嘧啶-1,3-二甲酸二叔丁酯(4.85g，11.56mmol)、2-氯-4,6-二甲氧基-三嗪(2.03g，11.56mmol)、N-甲基吗啉(1.17g，1.27mL，11.56mmol)、甘氨酸苄酯p-TsOH盐(3.9g，11.56mmol)和第二份当量的N-甲基吗啉(1.17g，1.27mL，11.56mmol)的无水四氢呋喃(90mL)开始，ISCO柱色谱纯化后，得到无色粘稠油状物(3.19g，49％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C30H38N4O7(M+H)+567.2813，观察值567.2810。
步骤2：2-[3-(羧基甲基-氨基甲酰基)苯基亚氨基]-二氢嘧啶-1,3-二甲酸二叔丁酯的制备：
标题化合物是用实施例1步骤3描述的类似方法制备，由在无水乙醇(20mL)中的2-[3-(苄基氧基羰基甲基氨基甲酰基)苯基亚氨基]-二氢嘧啶-1,3-二甲酸二叔丁酯(475mg，0.84mmol)和10％钯炭(250mg)开始，得到无定形白色固体(355mg，89％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C23H32N4O7(M+H)+477.2344，观察值477.2344。
步骤3：2-[3-[[[(S)-2-叔丁氧基羰基-1-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)苯基氨基甲酰基]乙基氨基甲酰基]甲基]氨基甲酰基]苯基亚氨基]二氢嘧啶-1,3-二甲酸二叔丁酯的制备：
标题化合物是用实施例1步骤8描述的类似方法制备，由在DMF(5mL)中的2-[3-(羧基甲基-氨基甲酰基)苯基亚氨基]-二氢嘧啶-1,3-二甲酸二叔丁酯(332mg，0.69mmol)、(S)-3-氨基-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-琥珀酰胺酸叔丁酯(305mg，0.69mmol)、HBTU(290mg，0.76mmol)、HOBT(104mg，0.76mmol)和DIPEA(297mg，400uL，2.3mmol)开始，ISCO柱色谱纯化后，得到无定形白色固体(602mg，97％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C45H65N7O12(M+H)+896.4764，观察值896.4764。
步骤4：(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧基)苯基]-3-[2-[3-(四氢嘧啶-2-亚基氨基)苯甲酰基氨基]乙酰基氨基]琥珀酰胺酸的制备；αVβ3配体-2：
标题化合物是用实施例1步骤9描述的类似方法制备，由在二氯甲烷(20mL)中的2-[3-[[[(S)-2-叔丁氧基羰基-1-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)苯基氨基甲酰基]乙基氨基甲酰基]甲基]氨基甲酰基]苯基亚氨基]二氢嘧啶-1,3-二甲酸二叔丁酯(595mg，0.66mmol)和三氟乙酸(10mL)开始，得到淡棕色固体，为三氟乙酸盐(555mg，96％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C23H29N7O6(M+H)+500.2252，观察值500.2252。
步骤5：(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(四氢嘧啶-2-亚基氨基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸(αVβ3配体试剂4)的制备：
标题化合物是用实施例1步骤10描述的类似方法制备，由(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧基)苯基]-3-[2-[3-(四氢嘧啶-2-亚基氨基)苯甲酰基氨基]乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸(265mg，0.3mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(179mg，0.3mmol)和DIPEA(387mg，526uL，3.0mmol)，HPLC纯化后，得到淡黄色粘稠油状物(208mg，68％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C47H71N7O16S(M+H)+1022.4751，观察值1022.4742。
实施例5
(S)-N-[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]甲基]苯基]-3-[2-[[2-(3-苄基脲基)噻唑-4-羰基]氨基]乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的制备；αVβ3配体试剂5：
标题化合物是用实施例1步骤10中描述的类似方法制备，由(S)-N-[4-氨基甲基苯基]-3-[2-[[2-(3-苄基脲基)噻唑-4-羰基]氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸(166mg，0.3mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(232mg，0.3mmol)和DIPEA(387mg，522uL，3.0mmol)，并且HPLC纯化后，得到淡棕色油状物(362mg，99％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C54H81N7O20S2(M+H)+1212.5051，观察值1212.5058。
实施例6
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；αVβ3配体试剂6：
步骤1：2-氨基-噻唑-4-甲酸乙酯氢溴酸盐的制备：
向放置在油浴中的装有冷凝器、温度计和机械搅拌器的3L三颈烧瓶装入硫脲(48.2g，634mmol)和溴代丙酮酸乙酯(137g，88.3mL，634mmol)。将反应缓慢且小心加热(60℃)直至形成澄清溶液，此时反应变成放热反应(反应温度达到110℃)，并且搅拌，反应固化。向反应中加入EA(500mL)，将反应从加热移除，并且冷却至室温。过滤固体并且用EA和Et2O洗涤，得到2-氨基-噻唑-4-甲酸乙酯氢溴酸盐，为白色固体(157g，98％)。
步骤2：2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-甲酸乙酯的制备：
向含有2-氨基-噻唑-4-甲酸乙酯氢溴酸盐(66.6g，263mmol)、4-乙基吗啉(60.7g，67.1mL，527mmol)和无水DMF(660mL)的反应容器中加入异氰酸苄酯(42.1g，316mmol)，将反应在室温和氩气下搅拌7小时，加入更多异氰酸苄酯(42.1g，316mmol)，并且将反应在室温和氩气下搅拌过夜。第二天将反应浓缩2/3，用水(1.6L)稀释，并且过滤产生的沉淀物，并且过夜吸干，得到2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-甲酸乙酯，为类白色固体(146g，182％)。NMR分析表明物质仍为湿，含有水和DMF，并且直接使用。
步骤3：2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-甲酸的制备：
向含有湿2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-甲酸乙酯(146g，假设理论值263mmol)的反应容器中加入乙醇(1.2L)和1N NaOH(1.31L)。温热反应(60℃)并且在氩气下搅拌4小时。过滤反应，并且弃去固体。将滤液在冰浴中冷却并且用1N HCl(1.31L)酸化，并且过滤产生的沉淀物，并且用水洗涤，并且吸干两天，得到2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-甲酸(72g，99％)。
步骤4：{[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基}-乙酸乙酯的制备：
标题化合物是用实施例1步骤2描述的类似方法制备，由2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-甲酸(72g，259mmol)、2-氯-4,6-二甲氧基-三嗪(45.5g，259mmol)、N-甲基吗啉(26.2g，28.5mL，259mmol)、甘氨酸乙酯盐酸盐(36.2g，259mmol)和第二份当量的N-甲基吗啉(26.2g，259mmol)开始，结晶和色谱后，得到白色晶体，为固体(72.6g，76％)。
步骤5：{[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基}-乙酸的制备：
标题化合物是用实施例1步骤3描述的类似方法制备，由{[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基}-乙酸乙酯(72.3g，199mmol)、甲醇(200mL)、THF(1L)、1N NaOH(0.2L)和1N HCl(0.2L)开始，中和、蒸发并且结晶后，得到白色晶体(73.1g，109％)。NMR分析表明产物含有溶剂，直接使用。
步骤6：(S)-3-(2-{[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基}-乙酰基氨基)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-琥珀酰胺酸叔丁酯的制备：
标题化合物是用实施例1步骤8描述的类似方法制备，由{[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基}-乙酸、(S)-3-氨基-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-琥珀酰胺酸叔丁酯(1.5g，3.43mmol)、HBTU(1.43g，3.77mmol)、HOBT(0.51g，3.77mmol)和DIPEA(1.46g，1.97mL，11.3mmol)开始，得到白色固体(1.83g，70％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C36H47N7O9S(M+Na)+776.3048，观察值776.3050。
步骤7：(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧基)-苯基]-3-(2-{[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基}-乙酰基氨基)-琥珀酰胺酸的制备，(αVβ3配体试剂8，40389-052)αVβ3配体-3：
标题化合物是用实施例1步骤9描述的类似方法制备，由(S)-3-(2-{[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基}-乙酰基氨基)-N-[4-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苯基]-琥珀酰胺酸叔丁酯(1.83g，2.48mmol)开始，得到白色固体(1.29g，88％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C17H31N7O7S(M+H)+598.2079，观察值598.2077。
步骤8：(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的制备：
标题化合物是用实施例1步骤10中描述的类似方法制备，由(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧基)-苯基]-3-(2-{[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基}-乙酰基氨基)-琥珀酰胺酸αVβ3配体试剂8，40389-052)(242mg，0.405mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(280mg，0.405mmol)和DIPEA(262.2mg，353μL，2.03mmol)开始，HPLC纯化后，得到淡棕色胶状物(206mg，43％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C53H73N9O19S(M+H)+1172.4816，观察值1172.4806。
实施例7
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙氧基]-苯基]-3-[2-[[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的制备；(αVβ3配体试剂7，40389-058)：
标题化合物是用实施例1步骤10中描述的类似方法制备，由(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧基)-苯基]-3-(2-{[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基}-乙酰基氨基)-琥珀酰胺酸αVβ3配体试剂8，40389-052)(155mg，0.260mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(225mg，0.260mmol)和DIPEA(167mg，226μL，1.29mmol)开始，HPLC纯化后，得到淡黄色胶状物(149mg，42％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C61H89N9O23S(M+H)+1348.5865，观察值1348.5864。
实施例8
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-乙酰基硫烷基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸的制备；αVβ3配体试剂8：
标题化合物是用实施例1步骤10中描述的类似方法制备，由(S)-N-[4-(3-氨基-丙氧基)-苯基]-3-(2-{[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基}-乙酰基氨基)-琥珀酰胺酸，40389-052)(120mg，0.201mmol)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-乙酰基硫烷基-乙氧基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酸-2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(120mg，0.201mmol)和DIPEA(129.2mg，174μL，1.01mmol)开始，HPLC纯化后，得到淡棕色胶状物(206mg，43％)。ES(+)-HRMS m/e计算值C48H69N7O17S2(M+H)+1080.4264，观察值1080.4257。
N-(2-甲氧基苄基)乙酰胺的制备
在冰水浴上向纯(neat)化合物2-甲氧基苄基胺(40g，0.29mol)滴加Ac2O(80mL，0.85mol)。然后将反应混合物在室温再搅拌2小时。将混合物倒入50mL水中，并且用乙酸乙酯(3×300mL)萃取。合并的有机层用水(3×150mL)、盐水(100mL)洗涤，并且经无水硫酸钠干燥。过滤并且浓缩后，残留物悬浮于石油醚(200mL)中，并且搅拌10分钟，然后过滤并且干燥，得到标题化合物(36.5g，69.9％)，为纯白色固体。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ7.31-7.25(m,2H),6.95-6.87(m,2H),6.01(brs,1H),4.44(d,2H,J＝6.0Hz),3.87(s,3H),1.98(s,3H)。
N-(2-羟基苄基)乙酰胺的制备
将N-(2-甲氧基苄基)乙酰胺(6.5g，0.036mol)溶于DCM(100mL)中，并且将溶液在氮气下冷却至-10℃。向该溶液中滴加BBr3(15mL，0.15mol)。加入后，移去冰浴，并且将反应混合物在室温搅拌2小时。将反应混合物再冷却至-10℃，并且通过水(20mL)猝灭。混合物用DCM(3×100mL)萃取，并且有机层用水(3×100mL)、盐水(100mL)洗涤，并且干燥，得到标题化合物(4.3g，71.7％)，为固体。其无需进一步纯化直接用于下一步。1H NMR(300MHz,DMSO)：δ9.56(brs,1H),8.27(brs,1H),7.09-7.03(m,2H),6.79-6.72(m,2H),4.16(d,2H,J＝6.0Hz),1.87(s,3H)。LC-MS：166.2[M+H]+，tR＝1.15分钟。
3-溴丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
向3-溴丙基胺氢溴酸盐(50g，0.228mol)的DCM(1000mL)混悬液中加入(Boc)2O(52g，0.238mol)和三乙胺(100mL，0.722mol)。然后将反应在室温再搅拌3小时。真空除去溶剂，并且残留物用石油醚(500mL)洗涤。过滤混合物，并且蒸发滤液，得到标题化合物(54g，99.2％)，为无色油状物。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ4.69(brs,1H),3.43(t,2H,J＝6.6Hz),3.27-3.23(m,2H),2.10-2.03(m,2H),1.27(s,9H)。
{3-[2-(乙酰基氨基-甲基)-苯氧基]-丙基}-氨基甲酸叔丁酯的制备
在室温向搅拌的N-(2-羟基苄基)乙酰胺(18.8g，0.11mol)的DMF(100mL)溶液中加入3-溴丙基氨基甲酸叔丁酯(32g，0.135mol)和K2CO3(47g，0.34mol)。然后将反应混合物在室温搅拌16小时。过滤混合物，并且真空除去溶剂，得到粗产物，其通过硅胶色谱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1:3-1:4)，得到标题化合物(23g，62.8％)，为固体。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ8.08(t,1H,J＝5.8Hz),7.20-7.13(m,2H),6.94-6.86(m,3H),4.21(d,2H,J＝5.4Hz),3.97(t,2H,J＝5.9Hz),3.14-3.08(m,2H),1.87(s,3H),1.82-1.86(m,2H),1.36(s,9H)。LC-MS：323.1[M+H]+，tR＝2.98分钟。
3-(2-(氨基甲基)苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
将{3-[2-(乙酰基氨基-甲基)-苯氧基]-丙基}-氨基甲酸叔丁酯(10.4g，0.032mol)悬浮于水合肼(150mL，85％)，并且将反应混合物在回流下搅拌20小时。将混合物冷却至室温，并且用乙醚(3×150mL)萃取。将合并的有机相用盐水(150mL)洗涤，并且经无水硫酸钠干燥。过滤并且浓缩后，将残留物通过硅胶色谱纯化(DCM/MeOH＝20:1～1:1)，得到标题化合物(4g，44.6％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ7.33-7.28(m,2H),7.01-6.90(m,2H),5.41-5.36(m,1H),4.15-4.11(m,2H),3.91(s,2H),3.44-3.40(m,2H),2.09-2.05(m,2H),1.90(brs,2H),1.50(s,9H)。LC-MS：281.1[M+H]+，tR＝2.33分钟。
化合物2-氨基噻唑-4-甲酸120的合成
历经1小时向化合物150(125g，0.525mol)的THF(2500mL)混悬液中滴加NaOH溶液(63g，在790mL水中)。将产生的混合物在室温搅拌2小时。蒸发溶剂，并且将残留物用2N HCl(770mL)处理，过滤并且干燥，得到化合物120(75g，99.1％)，为黄色固体。1H NMR(300MHz,DMSO)：δ7.38(s,1H),7.13(brs,2H)。
化合物[(2-氨基-噻唑-4-羰基)-氨基]-乙酸甲酯8的合成
向化合物120(1g，6.93mmol)的DMF(50mL)溶液中加入化合物121(0.97g，7.73mmol)、DIPEA(3.5mL，21.1mmol)和HATU(2.93g，7.7mmol)。将产生的溶液在室温搅拌过夜。在85℃真空蒸发反应溶液至干燥，将其用30mLTHF处理，并且在室温搅拌约0.5小时，然后过滤，用少量乙醇洗涤，并且干燥，得到化合物122(0.7g，46.9％)，为黄色固体。1H NMR(300MHz,DMSO)：δ8.07(t,1H，J＝6.0Hz),7.22(s,1H),7.12(brs,1H),3.97(d,2H,J＝6.0Hz),3.64(s,3H)。
[(2-{3-[2-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苄基]-脲基}-噻唑-4-羰基)-氨基]-乙酸甲酯的制备
向搅拌的3-(2-(氨基甲基)苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯(489mg，1.74mmol)的DCM(50mL)溶液中加入DIPEA(449mg，3.48mmol)的DCM(5.0mL)溶液。将该溶液在0℃和氮气下滴加至另一种三光气(180mg，0.61mmol)的DCM(5mL)溶液中。加入后，将混合物在0℃再搅拌15分钟。蒸发溶液，得到[3-(2-异氰酰基(cyanoato)甲基-苯氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯，为白色固体。将其溶于2.5mL DMF中，并且直接用于下一步。
在室温向[(2-氨基-噻唑-4-羰基)-氨基]-乙酸甲酯(374mg，1.74mmol)和DIPEA(449mg，3.48mmol)的DMF(2.5mL)溶液中加入[3-(2-异氰酰基甲基-苯氧基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯的DMF(2.5mL上面制备的)溶液。将反应混合物在80℃搅拌2小时。然后将混合物冷却并且倒入50mL水中，并且用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。有机相用盐水(20mL)洗涤，并且经无水硫酸钠干燥。过滤并且浓缩后，残留物通过色谱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1:2～1:1)，得到标题化合物(165mg，18.2％两步)，为黄色固体。
1H NMR(300MHz,CD3OD)：δ7.55(s,1H),7.17-7.14(m,2H),6.87-6.77(m,2H),4.34(s,2H),4.01-3.96(m,4H),3.64(s,3H),3.22-3.19(m,2H),1.91-1.86(m,2H),1.31(s,9H)。LC-MS：522.2[M+H]+，tR＝2.73分钟。
[(2-{3-[2-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苄基]-脲基}-噻唑-4-羰基)-氨基]-乙酸的制备
在室温向[(2-{3-[2-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苄基]-脲基}-噻唑-4-羰基)-氨基]-乙酸甲酯(0.165g，0.31mmol)的THF(5mL)溶液中滴加LiOH.H2O(0.132g，3.1mmol)的水溶液(1mL)。然后将溶液在该温度搅拌16小时。蒸发溶剂，并且残留物用5mL水稀释。水溶液用乙酸乙酯(10mL)萃取，并且水相用1N柠檬酸溶液酸化至pH～5。水溶液用乙酸乙酯萃取(3×15mL)，并且合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥。过滤并且浓缩后，得到标题化合物(0.080g，50.9％)，为固体。
1H NMR(300MHz,DMSO)：δ10.57(brs,1H),8.06(t,1H,J＝5.8Hz),7.63(s,1H),7.26-7.20(m,2H),6.98-6.88(m,4H),4.32(d,2H,J＝5.7Hz),4.03-3.91(m,4H),3.16-3.10(m,2H),1.90-1.83(m,2H),1.36(s,9H)。LC-MS：508.2[M+H]+，tR＝2.58分钟。
3-(2-(2-(3-(2-(3-(叔丁氧基羰基氨基)丙氧基)苄基)脲基)噻唑-4-甲酰氨基)乙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯的制备
在室温向[(2-{3-[2-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苄基]-脲基}-噻唑-4-羰基)-氨基]-乙酸(0.7g，1.38mmol)的THF(25mL)的溶液中加入DIPEA(1.4g，10.8mmol)和HATU(0.525g，1.38mmol)。然后将反应搅拌20分钟。一次性加入3-氨基-3-苯基丙酸甲酯盐酸盐(0.29g，1.34mmol)，并且将反应混合物搅拌16小时。减压除去溶剂，并且残留物溶于50mL乙酸乙酯，并且用1N NaOH溶液(3×15mL)洗涤，随后用1N HCl(3×15mL)和水(3×15mL)洗涤，再用盐水(15mL)洗涤，并且经硫酸钠干燥。过滤并且浓缩后，残留物通过硅胶色谱纯化(用乙酸乙酯/石油醚/甲醇＝25:25:2洗脱)，得到标题化合物(0.54g，58.6％)，为固体。1H NMR(300MHz,CD3OD)：δ7.67(s,1H),7.37-7.24(m,7H),6.99-6.92(m,2H),5.40(t,1H,J＝7.3Hz),4.46(s,2H),4.13-4.04(m,4H),3.67(s,3H),3.34-3.32(m,2H),2.90-2.86(m,2H),2.03-1.98(m,2H),1.43(s,9H)。LC-MS：669.2[M+H]+，tR＝3.11分钟。
3-(2-(2-(3-(2-(3-氨基丙氧基)苄基)脲基)噻唑-4-甲酰氨基)乙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯盐酸盐的制备
在室温向搅拌的HCl的乙酸乙酯(250mL)饱和溶液中滴加3-(2-(2-(3-(2-(3-(叔丁氧基羰基氨基)丙氧基)苄基)脲基)噻唑-4-甲酰氨基)乙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯(5.5g，8.23mmol)的乙酸乙酯(30mL)溶液，然后将混合物在室温搅拌16小时。减压除去有机溶剂，并且固体用乙醚(50mL)处理，然后过滤，得到标题化合物(4.7g，94.5％)，为白色固体。
1H NMR(300MHz,CD3OD)：δ7.69(s,1H),7.36-7.27(m,7H),7.02-6.95(m,2H),5.40(t,1H,J＝7.4Hz),4.48(s,2H),4.19(t,2H,J＝5.6Hz),4.06(d,2H,J＝2.1Hz),3.63(s,3H)3.24(t,2H,J＝7.2Hz),2.90-2.86(m,2H),2.24-2.15(m,2H)。LC-MS：569[M+H]+，tR＝3.00分钟。HPLC：99.85％，214nm，99.14％，254nm，tR＝4.05分钟。
3-{2-[(2-{3-[2-(3-氨基-丙氧基)-苄基]-脲基}-噻唑-4-羰基)-氨基]-乙酰基氨基}-3-苯基-丙酸的制备，αVβ3配体-4：
向3-{2-[(2-{3-[2-(3-氨基-丙氧基)-苄基]-脲基}-噻唑-4-羰基)-氨基]-乙酰基氨基}-3-苯基-丙酸甲酯盐酸盐(2.0g，3.31mmol，Eq：1.00)的甲醇(10mL)溶液中加入2M氢氧化钠(33.1mmol，Eq：10.00)。将反应混合物在55℃搅拌过夜。用1N HCl中和过程中沉淀出粗产物，并且过滤收集(2.19g)。粗产物通过反相HPLC纯化，得到1041mg的标题化合物，为TFA盐。
HRMS m/e555.2006(M+H)+。
(R)-3-(2-(2-(3-(2-(3-(叔丁氧基羰基氨基)丙氧基)苄基)脲基)噻唑-4-甲酰氨基)乙酰氨基)-3-(吡啶-3-基)丙酸乙酯的制备
在室温和氮气下向[(2-{3-[2-(3-叔丁氧基羰基氨基-丙氧基)-苄基]-脲基}-噻唑-4-羰基)-氨基]-乙酸(7.08g，13.9mmol)和HATU(5.8g，15.2mmol)的THF(150mL)溶液中加入DIPEA(13.9g，107.7mmol)。然后将反应混合物在室温再搅拌20分钟。一次性加入化合物(R)-3-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸乙酯盐酸盐(4.45g，16.8mmol)，并且将反应在该温度搅拌16小时。蒸发溶剂，并且残留物溶于500mL乙酸乙酯中，用0.3N HCl(2×100mL)、盐水(100mL)洗涤，并且干燥，得到粗产物，其通过硅胶色谱纯化(用在乙酸乙酯中的10％甲醇洗脱)，得到标题化合物(7.2g，77.3％)，为固体。LC-MS：684.2[M+H]+，tR＝2.60分钟。
(R)-3-(2-(2-(3-(2-(3-氨基丙氧基)苄基)脲基)噻唑-4-甲酰氨基)乙酰氨基)-3-(吡啶-3-基)丙酸乙酯盐酸盐的制备
在0℃向搅拌的(R)-3-(2-(2-(3-(2-(3-(叔丁氧基羰基氨基)丙氧基)苄基)脲基)噻唑-4-甲酰氨基)乙酰氨基)-3-(吡啶-3-基)丙酸乙酯(2.3g，3.36mmol)的乙醇(50mL)溶液中加入乙酰氯(5mL)。然后将溶液在室温搅拌1小时。减压除去溶剂，并且残留物用乙酸乙酯(100mL)洗涤，得到标题化合物(1.1g，52.6％)，为白色固体。1HNMR(300MHz,CD3OD)：δ8.97(s,1H),8.83-8.81(m,1H),8.73(d,1H,J＝8.1Hz),8.13(d,1H,J＝7.0Hz),7.73-7.75(m,1H),7.34-7.28(m,2H),7.04-6.96(m,2H),5.56-5.51(m,1H),4.49(s,2H),4.23-4.07(m,6H),3.26(t,2H,J＝6.9Hz),3.11(d,2H,J＝6.9Hz),2.26-2.22(m,2H),1.24(t,3H,J＝7.0Hz)。LC-MS：584.0[M+H]+，tR＝2.17分钟。HPLC：100％，214nm，100％，254nm，tR＝5.91分钟。
(R)-3-(2-(2-(3-(2-(3-氨基丙氧基)苄基)脲基)噻唑-4-甲酰氨基)乙酰氨基)-3-(吡啶-3-基)-丙酸的制备，αVβ3配体-5
向(R)-3-(2-(2-(3-(2-(3-氨基丙氧基)苄基)脲基)噻唑-4-甲酰氨基)乙酰氨基)-3-(吡啶-3-基)丙酸乙酯二盐酸盐(1.99g，3.1mmol)的MeOH(10mL)溶液中加入2N氢氧化钠(15.5mL，31.0mmol)，并且将产生的反应混合物在55℃搅拌过夜。然后将其用1N盐酸中和并且通过反相HPLC纯化，得到1.10g标题化合物。
实施例11
αVβ3配体试剂9的制备
标题化合物是以实施例7所示的类似方法制备，使用3-{2-[(2-{3-[2-(3-氨基-丙氧基)-苄基]-脲基}-噻唑-4-羰基)-氨基]-乙酰基氨基}-3-苯基-丙酸和3-(2-{2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯。HRMS m/e883.2978(M+Na)+。
实施例12
αVβ3配体试剂10的制备
标题化合物是以实施例7所示的类似方法制备，使用3-{2-[(2-{3-[2-(3-氨基-丙氧基)-苄基]-脲基}-噻唑-4-羰基)-氨基]-乙酰基氨基}-3-苯基-丙酸和1-(S-乙酰基)-巯基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九-39-酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯。HRMS m/e1213.5248(M+H)+。
实施例13
αVβ3配体试剂11的制备
标题化合物是以实施例7所示的类似方法制备，使用(R)-3-(2-(2-(3-(2-(3-氨基丙氧基)苄基)脲基)噻唑-4-甲酰氨基)乙酰氨基)-3-(吡啶-3-基)-丙酸TFA和3-(2-{2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯。HRMS m/e884.2924(M+H)+。
实施例14
αVβ3配体试剂12的制备
标题化合物是以实施例7所示的类似方法制备，使用(R)-3-(2-(2-(3-(2-(3-氨基丙氧基)苄基)脲基)噻唑-4-甲酰氨基)乙酰氨基)-3-(吡啶-3-基)-丙酸TFA和1-(S-乙酰基)-巯基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九-39-酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。HRMS m/e1214.5205(M+H)+。
荧光素(FITC)标记的靶向试剂的制备
靶向试剂可以用荧光团衍生化，所述的荧光团可以用于研究跟踪表达靶向小分子受体的细胞的结合。这类分子可以以一种或两种方法制备。首先，可能完成靶向马来酰亚胺与2-[(5-荧光素基(fluoroseinyl))氨基羰基]乙基硫醇反应。或者，整联蛋白拮抗剂小分子靶向配体与2-[(5-荧光素基)氨基羰基]乙基硫醇和双功能PEG试剂的一锅法反应，如流程图17和18所示。
方法a)的实施例
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸-FITC的制备
在室温和氮气气氛下向(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸(37.5mg，0.03mmol)和2-[(5-荧光素基)氨基羰基]乙基硫醇(FITC试剂)(15.6mg，0.036mml)的甲醇(5mL)黄色混悬液中加入过量的DIPEA(38.7mg，52uL，0.3mmol)。将产生的淡黄色混悬液搅拌2小时，此时LCMS分析表明原料不存在。然后，真空除去过量的DIPEA，并且将所需的产物通过HPLC纯化分离，得到25mg(50％产率)的(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸-FITC衍生物，为棕色固体。
ES(+)-HRMS m/e计算值C80H104N10O28S(M+2H)2+843.3444，实测值843.3437。LCMS数据＝M+H，1687.6。
方法b)的实施例
步骤1.将胱胺二盐酸盐(68mg，0.301mmol)和DIEA(110μL，2.1当量)溶于DMF(10mL)中，随后加入NHS-荧光素、5-和6-羧基荧光素的混合物(300mg，0.634mmol)，并且将产生的反应混合物在室温搅拌过夜。然后将其用乙酸乙酯稀释，并且用水洗涤三次，并且用盐水洗涤一次。萃取物经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，重溶于少量甲醇和乙酸乙酯中，然后用乙醚研磨，得到140mg荧光素-胱胺加合物，为鲜橙色固体。
步骤2.将荧光素-胱胺加合物(80mg，0.092mmol)溶于3:1的甲醇和水混合物(4mL)中，并且加入TCEP盐酸盐(80mg，3当量)。产生的反应混合物在室温搅拌2小时。产物通过HPLC纯化，得到78mg产物。LRMS(ESI)435.0。
荧光素标记的小分子-PEG结合物的制备
通用方法：向配体(1当量)的DMSO溶液中加入DIEA(2当量)和SM(PEG)4n(1当量)。将产生的反应混合物在室温搅拌1小时。然后，加入含有硫羟基柄的荧光素(1当量)，并且将反应混合物再搅拌10分钟。产物通过HPLC纯化。
用于共价连接小分子整联蛋白靶向配体至5’-硫羟基-siRNA寡核苷酸的方法
siRNA制备
寡核糖核苷酸合成
寡核糖核苷酸是根据亚磷酰胺技术在固相上用ABI394合成仪(AppliedBiosystems)以10μmol规模合成。RNA序列信息参见表1和2。相应的siRNA靶向管家基因AHA1。合成是在可控孔度玻璃制成的固体支持物(CPG，载量75μmol/g，从PrimeSynthesis,Aston,PA,USA获得)上进行。规则的RNA亚磷酰胺，2’-O-甲基亚磷酰胺以及辅助试剂购自Proligo(Hamburg,Germany)。特别地，使用下列合成试剂(amidite)：(5’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-(苯甲酰基)-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-腺苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-N4-(乙酰基)-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胞苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、(5’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-(异丁酰基)-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-鸟苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺和5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺。2’-O-甲基亚磷酰胺带有相同的保护基，作为规则的RNA合成试剂。所有的合成试剂溶于无水乙腈(100mM)中，并且加入分子筛为了在寡聚体的5’-末端上产生巯基连接体，使用购自Glen Research(Sterling,Virginia,USA)的1-O-二甲氧基三苯甲基-己基-二硫化物、1’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺连接体。在小分子结合前，使用三-(2-羧基乙基)膦(TCEP，见下)还原二硫化物连接体。为了用Nu547荧光团标记5’-末端，使用从Thermo Fisher(Milwaukee,Wisconsin)获得的相应亚磷酰胺。5-乙基硫代四唑(ETT，500 mM，在乙腈中)用作活化剂溶液。偶联时间6分钟。为了引入硫代磷酸连接，使用100mM的3-乙氧基-1,2,4-二噻唑啉-5-酮(EDITH，从LinkTechnologies,Lanarkshire,Scotland获得)的无水乙腈溶液。
支持物结合的寡聚体的裂解和脱保护
完成固相合成后，将干燥的固体支持物转移至15mL试管中，并且用在甲醇中的甲胺(2M，Aldrich)在45℃处理180分钟。离心后，将上清液转移至新的15mL试管中，并且将CPG用1200μLN-甲基吡咯烷-2-酮(NMP,Fluka,Buchs,Switzerland)洗涤。将洗涤液与甲醇化的甲胺溶液合并，并且加入450μL三乙胺三氢氟酸盐(TEA·3HF，Alfa Aesar,Karlsruhe,Germany)。将混合物加热至65℃达150分钟。冷却至室温后，加入0.75mL NMP和1.5mL乙氧基三甲基硅烷(Fluka,Buchs,Switzerland)。10分钟后，离心收集沉淀的寡核糖核苷酸，弃去上清液，并且将固体重构于1mL缓冲液A(见下)。
寡核糖核苷酸的纯化
粗制的寡核糖核苷酸是通过强阴离子交换(SAX)HPLC纯化，在AKTA Explorer系统(GE Healthcare)上使用制备型22×250mm DNA Pac100柱(Dionex,Idstein,Germany)。缓冲液A包含10mM NaClO4、1mM EDTA、10mM Tris、pH7.4、6M尿素和20％乙腈。缓冲液B含有在缓冲液A中的500mM NaClO4。使用4.5mL/分钟的流速。在260nm和280nm处记录UV迹线。使用在55分钟内20％B至45％B的梯度。合并适当的级分，并且用3M NaOAc，pH＝5.2和70％乙醇沉淀。
粗制的Nu547标记的寡聚体是通过RP HPLC纯化，在AKTA Explorer系统(GEHealthcare)上使用XTerra Prep MS C810×50 mm柱(Waters,Eschborn,Germany)。缓冲液A是100mM三乙基乙酸铵(Biosolve,Valkenswaard,The Netherlands)，并且缓冲液B含有在缓冲液A中的50％乙腈。使用5mL/分钟的流速。在260、280和547nm(在Nu547标记的寡核糖核苷酸情况下)处记录UV迹线。使用58个柱体积(CV)5％B至60％B的梯度。合并适当的级分，并且用3M NaOAc，pH＝5.2和70％乙醇沉淀。
最后，纯化的寡聚体是通过尺寸排阻色谱在含有Sephadex G-25(GE Healthcare)的柱上脱盐。溶液的浓度是通过UV光度计(Beckman Coulter,Krefeld,Germany)在260nm处吸光度测量来测定。退火后将单个链以冷冻溶液保存于-20℃。
小分子RNA结合物的制备
将马来酰亚胺官能团装配的小分子通过硫醚连接共价结合至RNA上。为了完成该化学反应，将～60mg含有5’-二硫化物连接体的RNA在水(5mL)中用1mL TCEP(0.5M，在水中，购自Sigma Aldrich)还原成相应的硫醇。一旦分析型阴离子交换HPLC表明反应完成(室温～2小时)，用30mL乙醇/3M NaOAc(pH5.4)32:1(v/v)在-20℃过夜沉淀RNA。离心收集沉淀物，并且用于随后的小分子结合。
在典型的结合反应中，将10mg RNA溶于2mL磷酸钠缓冲液(0.1M，pH7.0)中。历经5分钟向该溶液中加入在ACN/NMP1:1(v/v)中的小分子(0.12mM)。一旦RPLC-ESI MS显示耗尽投入的RNA，将混合物用水(～10mL)稀释，并且加入～40mL乙醇/3M NaOAc(pH5.4)32:1(v/v)，在-20℃过夜沉淀结合的RNA。离心收集沉淀物，溶于水中，并且如果需要，采用上述方法通过阴离子交换HPLC纯化。如果结合物足够纯，通过尺寸排阻柱(Sephadex G-25，GEHealthcare)过滤反应混合物。
寡核糖核苷酸的退火，产生siRNA
通过混合等摩尔RNA溶液退火互补链。冷冻干燥混合物，并且用适合体积的退火缓冲液(100mM NaCl，20mM磷酸钠，pH6.8)重构，得到所需的浓度。将该溶液放入95℃水浴中，在3小时内将其冷却至室温。
下列分析方法用于评价本发明的靶向αVβ3化合物的αVβ3结合亲和力。
人αVβ3固相分析：
用αVβ3(R&D,Cat#3050-AV)包被Immuno96-孔板(NUNC,Part#439454)，向每孔加入100uLαVβ3(1×)并且在40℃温育该板过夜。所用的缓冲液是缓冲液A：20mM Tris、150mMNaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、pH7.4。除去包被试剂后，向每孔加入150uL在缓冲液A中的3.5％BSA，在37℃将板封闭105分钟。封闭后，板用200uL缓冲液B(缓冲液A+1mM MnCl2)洗涤5次。然后向每孔加入50uL在5％DMSO中的试验化合物溶液(2×)和50uL纤维蛋白原(2×)(Innovative Research,Cat#IFIB)。将板振摇2分钟，然后在37℃温育2小时。用200uL缓冲液B将板洗涤5次后，分别向板加入100uL/孔量的兔抗人纤维蛋白原一抗(InnovativeResearch,Cat IASHFBGN-GF)和50uL/孔量的羊抗兔IgG辣根过氧化物酶结合物二抗(Invitrogen,Cat#G21234)。加入一抗和加入二抗后，将板振摇2分钟，并且在37℃温育60分钟，然后用200uL缓冲液B洗涤5次。固相分析方法的最后条件是：[αVβ3]＝1.25ug，[纤维蛋白原]＝0.75ug/mL，[Anti-FG]＝1/2400(稀释的)，[HPR-抗兔]＝1/1000(稀释的)。当完成结合分析时，向板中加入100uL/孔的检测试剂ABTS(试剂A和试剂B的混合物)(KPL,Cat#50-62-00)。将板在RT振摇5-8分钟，并且逐渐显示出绿色。加入100uL/孔的终止缓冲液(1.0M磷酸(HPO4))后，在450nm吸收模式的Envision上读取板。
测定对照化合物(141)，其具有约2nM的IC50(即50％的细胞不会结合至孔表面上的αVβ3，因为细胞的αVβ3受体被认为结合至对照化合物货与对照化合物相关)。下表3和4显示了这些结果。
为了靶向递送而将整联蛋白拮抗剂共价连接至FITC荧光团和siRNA的小分子衍生物的细胞渗透性和定位的证据
方法
将在生长培养基(含有10％FBS的RPMI1640)中的AML MV4-11细胞与双链体-27(500nM)在37℃温育1小时。为了测定VLA-4非依赖性结合，将140(10μM)包含在一种条件中以阻断VLA-4依赖性结合。温育后，将细胞用D-PBS洗涤两次，并且在1％低聚甲醛中固定10分钟。使用ImageStreamx(Aminis Corporation,Seattle)通过成像流式细胞术分析siRNA的摄取。表A和图1-4显示了结果。
表A
化合物(浓度) Cy3平均强度
无 638
140(10μM) 663
双链体-27(500nM) 4007
140(10μM)+双链体-27(500nM) 2273
5’-正义链修饰的siRNA敲除细胞体系中AHA1 mRNA的分析
材料与方法
参考基因：GAPDH
细胞系：H1299_Nut-Onc
平板接种密度：5,000个细胞/孔
平板接种形式：96-孔
平板接种至处理的时间：0
对照处理：模拟试验、未处理、对照siRNA
转染试剂：DharmaFect1
转染方法：反向TF
TF试剂体积/孔：0.15mL
siRNA终浓度：50nM
分析方法：第1天操作/第2天清洗
反向转染：用终浓度50nM的所示siRNA转染H1299细胞，使用0.15μL/孔的DharmaFect-1转染试剂。然后将细胞以5000个细胞/孔铺在96-孔板中，并且在37℃温育48小时。
用商家报道的Branched DNA分析测量siRNA敲除的功效；图5显示了敲除的结果。通过相同孔中GAPDH的绝对表达评价相对细胞活力(图6)。
除非相反地陈述，否则如所描述的那样制备和表征实施例中的所有化合物。将本文所引的所有专利和出版物的全部内容并入本文作为参考。

Claims (19)

1.式I化合物：
或其可药用盐或酯；其中n为1-24，并且其中：R1选自：
(1)下式化合物：
其中m是0或1；
(2)下式化合物：
其中X是N或CH；
(3)下式化合物：
(4)下式化合物：
和
(5)下式化合物：
R2选自：
(1)下式化合物：
(2)下式化合物：
(3)下式化合物：
和
(4)下式化合物：
其中R3是结合部分，并且X表示硫或下式化合物：
2.权利要求1的化合物，其中R1是下式化合物：
其中m是0或1。
3.权利要求1的化合物，其中R1是下式化合物：
其中X是N或CH。
4.权利要求1的化合物，其中R1是下式化合物：
5.权利要求1的化合物，其中R1是下式化合物：
6.权利要求1的化合物，其中R1是下式化合物：
7.权利要求1至6的任意一项的化合物，其中R2是下式化合物：
8.权利要求1至6的任意一项的化合物，其中R2是下式化合物：
9.权利要求1至6的任意一项的化合物，其中R2是下式化合物：
10.权利要求1至6的任意一项的化合物，其中R2是下式化合物：
其中R3是单链或双链寡核苷酸，并且X表示硫或下式化合物：
11.权利要求10的化合物，其中R3是siRNA分子。
12.权利要求1至6的任意一项的化合物，其中R2是下式化合物：
其中R3是异硫氰酸荧光素，并且X表示硫或下式化合物：
13.权利要求1的化合物，其选自：
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；和
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(胍基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；
(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-[胍基]-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸三氟乙酸盐；和(S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]-1-氧代丙基]氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[3-(四氢嘧啶-2-亚基氨基)-苯甲酰基氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；
(S)-N-[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]甲基]苯基]-3-[2-[[2-(3-苄基脲基)噻唑-4-羰基]氨基]乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；和
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]乙氧基]-苯基]-3-[2-[[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸；和
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-乙酰基硫烷基-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]丙氧基]-苯基]-3-[2-[[2-(3-苄基-脲基)-噻唑-4-羰基]-氨基]-乙酰基氨基]-琥珀酰胺酸。
14.权利要求1的化合物，其是：(R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-乙酰基硫烷基-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苄基}-脲基]-噻唑-4-羰基)-氨基}-乙酰基氨基]-苯基-3-基-丙酸。
15.权利要求1的化合物，其是：3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苄基}-脲基]-噻唑-4-羰基)-氨基}-乙酰基氨基]-苯基-3-基-丙酸。
16.权利要求1的化合物，其是：(R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-乙酰基硫烷基-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苄基}-脲基]-噻唑-4-羰基)-氨基}-乙酰基氨基]-3-吡啶-3-基-丙酸。
17.权利要求1的化合物，其是：(R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-乙酰基硫烷基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙酰基氨基)-丙氧基]-苄基}-脲基]-噻唑-4-羰基)-氨基}-乙酰基氨基]-3-吡啶-3-基-丙酸。
18.药物组合物，该药物组合物包含权利要求1至17的任意一项的化合物和可药用载体。
19.权利要求1至17的任意一项的化合物在制备用于治疗或预防炎症、癌症或者代谢疾病或病症的药物中的用途。
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