CN104140432A

CN104140432A - 由罗丹明b、三亚乙基四胺和异硫氰酸苯酯合成的荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104140432A
Application number: CN201410341939.4A
Authority: CN
Inventors: 徐冬梅; 洪苗苗; 刘爱风
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Changshu intellectual property operation center Co.,Ltd.
Priority date: 2014-07-17
Filing date: 2014-07-17
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2034-07-17
Also published as: CN104140432B

Abstract

本发明公开了由罗丹明B、三亚乙基四胺和异硫氰酸苯酯合成的荧光探针及其制备方法和应用。具体而言，本发明首先使罗丹明B与三亚乙基四胺反应以形成性质稳定的螺环酰胺结构并引入含氮桥联片段，再与异硫氰酸苯酯反应以引入硫原子。利用汞离子的亲硫性，通过上述方案获得的新型罗丹明B-苯基硫脲衍生物RTTU的每一个分子能够结合三个汞离子，因而具备较高的选择性和检测灵敏度。该荧光探针分子可以在中性缓冲溶液，特别是水相中进行检测，还可以检测来自氯化汞的汞离子，具有更好的实用性。另外，该荧光探针分子在制备过程中可以直接析出而无需进一步分离纯化，合成方法简便易行。

Description

由罗丹明B、三亚乙基四胺和异硫氰酸苯酯合成的荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机合成领域，具体涉及一种作为汞离子荧光探针材料使用的罗丹明B-苯基硫脲衍生物及其制备方法与应用。

背景技术

汞是出现频率和毒性均名列前茅的重金属，影响范围较广，毒性较强。由于其对于功能蛋白质和酶中的硫醇基团具有较高的亲和性，汞或其衍生物通常会导致细胞发生功能失调，进而引发后续的健康问题（参见M. Harada, Minamata disease: methylmercury poisoning in Japan caused by environmental pollution, Crit. Rev. Toxicol., 1962, 2:40-57）。不幸的是，汞污染能够发生于一系列天然和人为环境中，例如海啸或火山喷发、金矿开采以及燃油废料。因此，有效地检测或监控生物样品或环境样品中的汞已成为近年来相关领域的研究热点。

由于检测灵敏、选择性高等优点，荧光技术长期以来一直受到极大关注。罗丹明类荧光分子因具有良好的光稳定性、长波长发射和高量子产率、响应机理独特等优点而成为该方法最重要的荧光母体之一。罗丹明类荧光探针在重金属和过渡金属离子的检测中得到了广泛应用。设计该类探针的基本思路是通过含有伯氨基的桥联剂将罗丹明类荧光母体与识别基团R相连接，罗丹明荧光母体中的羧基可与伯氨反应生成独特的内酰胺五元环结构（参见J-S. Wu, I-C. Hwang, K-S. Kim等人, Rhodamine-based Hg²⁺-selective chemodosimeter in aqueous solution: fluorescent off-on, Org. Lett., 2007, 9(5):907-910以及C. Kaewtong, J. Noiseephum, Y. Uppa等人, A reversible Em-FRET rhodamine-based chemosensor for carboxylate anions using a ditopic receptor strategy, New J. Chem., 2010, 34:1104-1108）。当R在羰基的协同作用下与某种重金属或过渡金属离子发生作用时，可使探针的内酰胺键断裂，形成开环结构，导致荧光强度显著增强，从而实现对该离子的选择性识别。

然而，已报道的Hg²⁺荧光探针大多数是一个探针分子结合一个Hg²⁺，而且有的荧光探针对于Hg²⁺的选择性较差，灵敏度不高；有的选择性好、灵敏度高，但水溶性差，无法在水相中完成检测；或者有的选择性好、灵敏度高，但合成困难。因此亟须一种新颖的、选择性高、灵敏度高且水溶性好的罗丹明型Hg²⁺荧光探针。

发明内容

为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明旨在提供一种来自罗丹明B、三亚乙基四胺和异硫氰酸苯酯的荧光探针及其制备方法和应用。

本发明的核心在于改变罗丹明B的细部结构，先使其与三亚乙基四胺反应以形成性质稳定的螺环酰胺结构并引入含氮桥联片段，再与异硫氰酸苯酯反应以引入硫原子。利用Hg²⁺的亲硫性，通过上述方案获得的新型罗丹明B-苯基硫脲衍生物RTTU（即罗丹明型Hg²⁺荧光探针RTTU）的每一个分子能够结合三个Hg²⁺，因而具备较高的选择性和检测灵敏度。

首先，为了达到上述目的，本发明提供了一种如式（I）所示的罗丹明B-苯基硫脲衍生物，

（I）。

其次，本发明提供了一种制备上述罗丹明B-苯基硫脲衍生物的方法，其包括以下步骤：

1）将罗丹明B（RB）溶于反应溶剂A中，然后按照罗丹明B与三亚乙基四胺（TETA）的摩尔比为1:10-15的用量逐滴滴加三亚乙基四胺，滴加完毕后在70-90℃下加热反应20-30小时，冷却至室温，减压除去溶剂后用水/二氯甲烷体系萃取，收集有机相，减压除去二氯甲烷，得到螺环酰胺中间体，

；

2）将步骤1）中获得的螺环酰胺中间体和异硫氰酸苯酯（PITC）按照1:6-12的摩尔比溶于反应溶剂B中，在20-80℃的条件下搅拌反应5-72小时，冷却至室温后析出固体，再静置12-48小时后，过滤、洗涤并干燥，无需纯化即得罗丹明B-苯基硫脲衍生物，

。

优选的，步骤1）中所述罗丹明B与三亚乙基四胺的摩尔比为1:10。

优选的，步骤1）中所述反应溶剂A选自乙醇、异丙醇、正丁醇中的任意一种，优选乙醇。

优选的，步骤1）的反应温度为80℃，反应时间为24小时。

优选的，步骤2）中所述螺环酰胺中间体与异硫氰酸苯酯的摩尔比为1:8。

优选的，步骤2）中所述反应溶剂B选自四氢呋喃、乙腈中的任意一种，优选乙腈。

优选的，步骤2）的反应温度为25℃，反应时间为5小时。

优选的，步骤2）中所述静置的时间为12小时。

最后，本发明还涉及上述罗丹明B-苯基硫脲衍生物用于检测Hg²⁺的用途，优选用于检测水相中存在的Hg²⁺。所述检测的具体实施方法如下所述：将1 mL待测水样放入10 mL容量瓶中，加入1 mM RTTU的CH₃CN溶液500 μL，然后用CH₃CN和HEPES缓冲溶液（pH=7.21）定容，得到CH₃CN/HEPES缓冲溶液（9/1，v/v，pH=7.21）的待测溶液，其中RTTU浓度为50 μM。以520 nm的光在10 nm狭缝宽度下激发，测定溶液的荧光光谱，根据RTTU的最大荧光强度与Hg²⁺浓度呈线性关系即可求得水样中Hg²⁺的浓度。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

（1）本发明的荧光探针分子可以从反应体系中沉淀析出，经过过滤、洗涤就可以得到纯品，无需进一步分离纯化，合成方法比较简单易行；

（2）本发明设计合成的罗丹明-苯基硫脲衍生物含有三个硫羰基识别基团，可以结合更多的Hg²⁺，有利于提高选择性和检测灵敏度；

（3）利用本发明的罗丹明-苯基硫脲衍生物可以在中性缓冲溶液，特别是水相中进行Hg²⁺检测；

（4）本发明可以检测来自HgCl₂的Hg²⁺，比检测来自Hg(ClO₄)₂的Hg²⁺具有更好的实用性。

附图说明

图1为不同金属离子对RTTU溶液的荧光光谱的影响示意图。其中，溶剂：CH₃CN/HEPES缓冲溶液（9/1，v/v，pH=7.21），浓度：50 μM（RTTU），250 μM（金属离子）。激发波长：520 nm，狭缝宽度：10 nm。

图2为Hg²⁺浓度对RTTU荧光光谱的影响示意图。其中，溶剂：CH₃CN/HEPES缓冲溶液（9/1，v/v，pH=7.21），浓度：50 μM（RTTU），0, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400 μM（Hg²⁺）。激发波长：520 nm，狭缝宽度：10 nm。

图3为共存离子对RTTU检测Hg²⁺的干扰性示意图。其中，溶剂：CH₃CN/HEPES缓冲溶液（9/1，v/v，pH=7.21），浓度：50 μM（RTTU），250 μM（Hg²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Fe²⁺、Cd²⁺），150 μM（K⁺、Pb²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Co²⁺）。激发波长：520 nm，狭缝宽度：10 nm。

图4为RTTU对Hg²⁺的Job’s-plot图。其中，溶剂：CH₃CN/H₂O（9/1，v/v），RTTU和Hg²⁺离子总浓度为90 μM，F₀和F分别表示波长583 nm处RTTU的荧光强度和RTTU-Hg²⁺体系的荧光强度，激发波长：520 nm，狭缝宽度：10 nm。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例一：Hg²⁺探针RTTU的制备。

以乙醇为溶剂，将0.5 g（1.05 mmol）罗丹明B溶于乙醇中，然后逐滴滴加1.57 mL（10.5 mmol）三亚乙基四胺，加热至80℃反应24 h，停止反应，旋转蒸发除去溶剂后用CH₂Cl₂和H₂O萃取3遍，收集有机层，旋转蒸发除去CH₂Cl₂，得到黄色固体RTTA。产率为86.6 %。

将0.1 g（0.175 mmol）中间体RTTA、124.5 μL（1.05 mmol）异硫氰酸苯酯溶解于乙腈中，在80 ℃下搅拌反应48 h，冷却至20 ℃，析出白色固体，在20 ℃下搅拌2 h，静置12 h，过滤，用乙腈洗涤，干燥，得到白色粉末产物，即为罗丹明B-苯基硫脲衍生物（Hg²⁺探针）RTTU，产率为19.5%。

IR (KBr) cm^-1: 3245(NH), 1616, 1544, 1515 (ArH), 2969, 2929 (CH₃, CH₂), 1675 (C=O), 1379, 1450 (CH₂), 1675(C=O), 1119(C-O-C)。

MALDI-TOF MS m/z 理论值：976.41 [RTTU + H]⁺，实验值：976.42。

实施例二：Hg²⁺探针RTTU的制备。

以乙醇为溶剂，将0.5 g（1.05 mmol）罗丹明B溶于乙醇中，然后逐滴滴加1.88 mL（12.6 mmol）三亚乙基四胺，加热至70℃反应30 h，停止反应，旋转蒸发除去溶剂后用CH₂Cl₂和H₂O萃取3遍，收集有机层，旋转蒸发除去CH₂Cl₂，得到黄色固体RTTA。产率为84.3 %。

将0.1 g（0.175 mmol）中间体RTTA、207.5 μL（1.75 mmol）异硫氰酸苯酯溶解于乙腈中，在70 ℃下搅拌反应72 h，冷却至20 ℃，析出白色固体，在20 ℃下搅拌2 h，静置2天，过滤，用乙腈洗涤，干燥，得到白色粉末产物，即为罗丹明B-苯基硫脲衍生物（Hg²⁺探针）RTTU，产率为23.3%。

实施例三：Hg²⁺探针RTTU的制备。

以异丙醇为溶剂，将0.5 g（1.05 mmol）罗丹明B溶于异丙醇中，然后逐滴滴加1.88 mL（12.6 mmol）三亚乙基四胺，加热至80℃反应24 h，停止反应，旋转蒸发除去溶剂后用CH₂Cl₂和H₂O萃取3遍，收集有机层，旋转蒸发除去CH₂Cl₂，得到黄色固体RTTA。产率为76.9 %。

将0.1 g（0.175 mmol）中间体RTTA、249 μL（2.1 mmol）异硫氰酸苯酯溶解于四氢呋喃中，在60 ℃下搅拌反应72 h，冷却至20 ℃，析出白色固体，在20 ℃下搅拌2 h，静置12 h，过滤，用乙腈洗涤，干燥，得到白色粉末产物，即为罗丹明B-苯基硫脲衍生物（Hg²⁺探针）RTTU，产率为32.0%。

实施例四：Hg²⁺探针RTTU的制备。

以正丁醇为溶剂，将0.5 g（1.05 mmol）罗丹明B溶于正丁醇中，然后逐滴滴加1.57 mL（10.5 mmol）三亚乙基四胺，加热至90℃反应20 h，停止反应，旋转蒸发除去溶剂后用CH₂Cl₂和H₂O萃取3遍，收集有机层，旋转蒸发除去CH₂Cl₂，得到黄色固体RTTA。产率为73.4 %。

将0.1 g（0.175 mmol）中间体RTTA、124.5 μL（1.05 mmol）异硫氰酸苯酯溶解于乙腈中，在25 ℃下搅拌反应5 h，冷却至25 ℃，析出白色固体，在25 ℃下搅拌2 h，静置12 h，过滤，用乙腈洗涤，干燥，得到白色粉末产物，即为罗丹明B-苯基硫脲衍生物（Hg²⁺探针）RTTU，产率为52.4%。

实施例五：Hg²⁺探针RTTU的制备。

以乙醇为溶剂，将0.5 g（1.05 mmol）罗丹明B溶于乙醇中，然后逐滴滴加1.57 mL（10.5 mmol）三亚乙基四胺，加热至80℃反应30 h，停止反应，旋转蒸发除去溶剂后用CH₂Cl₂和H₂O萃取3遍，收集有机层，旋转蒸发除去CH₂Cl₂，得到黄色固体RTTA。产率为83.4 %。

将0.1 g（0.175 mmol）中间体RTTA、166 μL（1.40 mmol）异硫氰酸苯酯溶解于乙腈中，在25 ℃下搅拌反应5 h，冷却至25 ℃，析出白色固体，在25 ℃下搅拌2 h，静置12 h，过滤，用乙腈洗涤，干燥，得到白色粉末产物，即为罗丹明B-苯基硫脲衍生物（Hg²⁺探针）RTTU，产率为58.4%。

实施例六： RTTU检测Hg²⁺的选择性和灵敏度。

在RTTU（50 μM）的CH₃CN/HEPES缓冲溶液（v/v，9:1，pH 7.21）中，加入5倍当量的Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Pb²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Cd²⁺和Hg²⁺离子，以波长为520 nm的光激发，测定加入离子前后的荧光光谱，结果如图1所示。

从图1中可以发现，只有Hg²⁺可使RTTU的荧光增强，其荧光增强指数达到23.7倍，其他常见的金属离子对RTTU的荧光光谱影响很小。该结果表明：在CH₃CN和HEPES缓冲溶液（v/v，9:1，pH 7.21）中，50 μM的RTTU对Hg²⁺有较高的选择性和灵敏度。

实施例七：Hg²⁺浓度对RTTU荧光光谱的影响。

在RTTU（50 μM）的CH₃CN/HEPES缓冲溶液（v/v，9:1，pH 7.21）中，加入不同浓度的Hg²⁺（0, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400 μM），以波长为520 nm的光激发，测定加入离子前后RTTU的荧光光谱，结果如图2所示。

从图2中可以发现，随着Hg²⁺离子浓度的增加，RTTU的荧光强度逐渐增强。在Hg²⁺浓度0~200 μM范围内，RTTU的最大荧光强度与Hg²⁺浓度呈较好的线性关系。据此计算得到RTTU检测Hg²⁺的检测限为3.04*10^-7mol/L，说明RTTU可以定量检测Hg²⁺。

实施例八：共存离子对RTTU检测Hg²⁺的干扰性。

在RTTU（50 μM）的CH₃CN/HEPES缓冲溶液（9:1，v/v，pH 7.21）中，加入5倍当量的Hg²⁺，再分别加入与Hg²⁺等摩尔浓度的干扰离子Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Fe²⁺、Cd²⁺ 和150 μM 的 K⁺、Pb²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Co²⁺，以波长为520 nm的光激发，测定加入离子前后RTTU的荧光光谱，其结果如图3所示。

从图3中可以发现，在这个体系下，含有其他离子的溶液的荧光光谱与只有汞离子时相比变化很小。所以RTTU检测Hg²⁺有很强的抗干扰性，从侧面印证了RTTU对Hg²⁺的选择性较高。

实施例九：分析RTTU与Hg²⁺的结合比。

为了了解RTTU识别Hg²⁺的机理，进行了Job’s实验，在CH₃CN/H₂O（9/1，v/v，pH 7.21）中，控制RTTU与Hg²⁺体系物质总浓度为90 μM，测定溶液荧光光谱，绘制Job’s-Plot曲线，其结果如图4所示。

由图4可以得知，当体系中Hg²⁺的摩尔分率x为 0.75 时，RTTU-Hg²⁺体系的荧光增强最大，根据计算公式n = x / (1-x)，算得 n = 3，表明RTTU与Hg²⁺的结合比为1:3，即一个RTTU分子可以结合三个Hg²⁺，有利于提高探针的选择性和灵敏度。

Claims

1.一种如式（I）所示的罗丹明B-苯基硫脲衍生物，

（I）。

2.一种制备如权利要求1所述的罗丹明B-苯基硫脲衍生物的方法，其包括以下步骤：

1）将罗丹明B溶于反应溶剂A中，然后按照罗丹明B与三亚乙基四胺的摩尔比为1:10-15的用量逐滴滴加三亚乙基四胺，滴加完毕后在70-90℃下加热反应20-30小时，冷却至室温，减压除去溶剂后用水/二氯甲烷体系萃取，收集有机相，减压除去二氯甲烷，得到螺环酰胺中间体，

；

2）将步骤1）中获得的螺环酰胺中间体和异硫氰酸苯酯按照1:6-12的摩尔比溶于反应溶剂B中，在20-80℃的条件下搅拌反应5-72小时，冷却至室温后析出固体，再静置12-48小时后，过滤、洗涤并干燥，无需纯化即得罗丹明B-苯基硫脲衍生物，

。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1）中所述罗丹明B与三亚乙基四胺的摩尔比为1:10。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1）中所述反应溶剂A选自乙醇、异丙醇、正丁醇中的任意一种。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1）的反应温度为80℃，反应时间为24小时。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2）中所述螺环酰胺中间体与异硫氰酸苯酯的摩尔比为1:8。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2）中所述反应溶剂B选自四氢呋喃、乙腈中的任意一种。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2）的反应温度为25℃，反应时间为5小时。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2）中所述静置的时间为12小时。

10.根据权利要求1所述的罗丹明B-苯基硫脲衍生物用于检测Hg²⁺的用途。