CN104136012B - 制备装载有活性物质的纳米颗粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备装载有活性物质的纳米颗粒的新方法并涉及所述纳米颗粒作为药剂的用途。制备纳米颗粒的方法包括步骤：(a)将至少一种活性物质和至少一种聚合物溶解在有机溶剂中，(b)将在步骤(a)中制备的溶液与水相混合，(c)蒸发有机溶剂，(d)借助针对包含相同活性物质的水性透析溶液透析来纯化在步骤(c)中得到的装载有活性物质的纳米颗粒。

Description

制备装载有活性物质的纳米颗粒的方法
本发明涉及制备装载有活性物质的纳米颗粒的新方法并涉及所述纳米颗粒作为药剂的用途。
纳米颗粒是用于药用活性物质控制释放的新方案。特别是，近几十年来基于聚合物的纳米颗粒引起了相当大的兴趣。在这些体系中，活性物质被嵌入到聚合物基质中并且根据基质性质控制地释放。这种体系的主要优点是：1)提高疏水性活性物质的溶解性，2)通过目标特异性释放而减少了不期望的副作用，3)通过活性物质载体控制活性物质的制药代动力学和4)防止注射后活性物质的过早崩解。
与活性物质的单独给药相比，其用于治疗所需的给药总量因纳米颗粒中的聚合物含量而增加。因此，具有尽可能高的活性物质负载量的纳米颗粒是理想的，即，活性物质对辅料尽可能高的比例。
用于药剂的辅料在它们的生理无害性和质量方面必须满足高要求，这必须由负责批准机关在复杂的试验中证明。因此，用于纳米颗粒开发的辅料优选是那些已经被批准用于药剂的辅料。在纳米颗粒中可以考虑已证实的的辅料的实例是聚乳酸，聚乳酸-共-乙醇酸或聚己内酯。
然而，已证实的辅料的缺点在于：往往不表现出与活性物质显著的相容性且因此导致仅可低装载的体系。
改进辅料/活性物质相容性的方法是使用新聚合物。由于对于辅料的上述高要求，因此具有此类辅料(尚未批准)的纳米颗粒的开发非常耗时且昂贵。此外，新辅料也通常在药物所需的质量(GMP质量)中不可用。
可使用各种方法来制备基于聚合物的纳米颗粒。制备方法是：
1，溶剂蒸发法
a.溶剂/非溶剂法(也被称为O/W型乳液法)
将聚合物和活性物质溶解在与水不可混溶的有机溶剂中，特别是二氯甲烷中，并在恒定的搅拌/搅动下引入到水相中。随后在真空或者在大气压力下将有机溶剂从在此得到的溶液去除(参见例如V.P.Sant,D.Smith和J.C.Leroux.Enhancement of oralbioavailability of poorly water-soluble drugs by poly(ethylene glycol)-block-poly(alkyl acrylate-co-methacrylic acid)self-assemblies.J ControlRelease.104:289-300(2005))。在此方法中，形成装载的纳米颗粒。
b.多重乳液法(W/O/W型法)
W/O/W型乳液技术特别适合于具有略带亲水性且从而水溶性的活性物质的纳米颗粒的制备。在此，将聚合物溶解在水可不混溶的溶剂(例如二氯甲烷)中并与包含溶解的活性物质的水相合并。将合并的相均质化(例如通过搅拌或超声处理)，得到W/O型乳液。然后将W/O型乳液注入包含其它乳化剂作为稳定剂的水相中。作为随后的最终步骤，将溶剂在真空下或在常压下再次去除(K.Avgoustakis,A.Beletsi,Z.Panagi,P.Klepetsanis,A.G.Karydas,和D.S.Ithakissios.PLGA-mPEG nanoparticles of cisplatin:in vitronanoparticle degradation,in vitro drug release and in vivo drug residence inblood properties；J Control Release.79:123-135(2002)；C.X.Song,V.Labhasetwar,H.Murphy,X.Qu,W.R.Humphrey,R.J.Shebuski,and R.J.Levy.Formulation andcharacterization of biodegradable nano-particles for intravascular local drugdelivery.Journal of Controlled Release.43:197-212(1997))。
c.共溶剂蒸发
在该方法中，将活性物质和聚合物在有机溶剂中混合并注入到水相中。在真空下或在常压下去除有机溶剂。与乳液方法相反，在此使用的溶剂是完全可与水混溶的，这样不形成乳液。
2，透析
a.直接透析
在该方法中，将活性物质和聚合物溶解在可与水混溶的有机溶剂 中并引入到透析装置中。透析可以针对水或缓冲液发生。随着内部和外部相的浓度梯度，通过溶剂的缓慢恒定交换来进行纳米颗粒的制备。非常值得注意的是，虽然所使用的透析膜可渗透小分子(活性物质)，但是聚合物由于排斥体积仍留在内部相中(H.J.Jeon,J.I.Jeong,M.K.Jang,Y.H.Park,和J.W.Nah.Effect of solvent on the preparation of surfactant-freepoly(DL-lactide-co-glycolide)nanoparticles and norfloxacin releasecharacteristics.International Journal of Pharmaceutics.207:99-108(2000))。
3.膜水化方法
这种方法是脂质体制剂制备的标准。在此，将脂质或聚合物溶解于有机溶剂中并在真空中蒸发。随后用缓冲液、活性物质溶液或水重组在玻璃设备中形成的膜。缺点是得到的聚合物-活性物质膜可能不可再分散或仅部分可再分散(A.Richter,C.Olbrich,M.Krause,J.Hoffmann,and T.Kissel.Polymeric micelles for parenteral deliveryof Sagopilone:physicochemical characterization,novel formulation approachesand their toxicity assessment in vitro as well as in vivo.Eur J PharmBiopharm.75:80-89(2010))。如果膜的再分散获得成功，则在制备粗颗粒之后，紧接所述方法大多数是尺寸分级的步骤(膜挤出，超声处理)(E.Blanco,E.A.Bey,Y.Dong,B.D.Weinberg,D.M.Sutton,D.A.Boothman,和J.Gao.Beta-lapachone-containing PEG-PLA polymer micelles as novel nanotherapeutics against NQO1-overexpressingtumor cells.J Control Release.122:365-374(2007)；Richter等人，如上引用的)。
借助上述方法制备具有已证实的聚合物的纳米颗粒通常导致对于其治疗用途不足够的活性物质装载量。期望的是，提供纳米颗粒的制备方法，尽管在此产生辅料/活性物质的相容性问题，但仍能够使用常规辅料制备具有高活性物质装载量的纳米颗粒。
由于活性物质嵌入在聚合物中，因此已知的方法得到活性物质仅以一定时间的延迟(滞后时间)从其中释放的纳米颗粒。其结果是在 纳米颗粒给药后仅在时间延迟后才能实现治疗活性物质的水平，因此，活性物质以迅速可用的形式的额外给药以达到快速起效是必要的。因此，还期望的是这样的纳米颗粒，其在给药后立即释放一定量的活性物质，以使活性物质在从聚合物的延迟释放之前已经提供了可用的治疗量。
因此，本发明的目的在于提供制备纳米颗粒的方法，其不具有现有制备方法的上述缺点。该方法特别是应当能够提供纳米颗粒，其比使用常规方法和常规聚合物制备的纳米颗粒具有更高的活性物质的装载量。此外，所制备的纳米颗粒在其施用后应当已经直接释放活性物质的初始剂量，从而导致即时起效。
这些目的已通过以下制备纳米颗粒的方法实现，其包括以下步骤：(a)将至少一种活性物质和至少一种聚合物溶解在有机溶剂中，(b)将在步骤(a)中制备的溶液与水相混合，(c)蒸发有机溶剂，(d)借助针对包含相同活性物质的水性透析溶液透析来纯化在步骤(c)中得到的装载有活性物质的纳米颗粒。因此，本发明涉及制备纳米颗粒的方法，包括步骤(a)将至少一种活性物质和至少一种聚合物溶解在有机溶剂中，(b)将在步骤(a)中制备的溶液与水相混合，(c)蒸发有机溶剂，(d)借助针对包含相同活性物质的水性透析溶液透析来纯化在步骤(c)中得到的装载有活性物质的纳米颗粒。
在步骤(a)中将活性物质和聚合物溶解在有机溶剂中形成的溶液，在上下文也称为有机相。
水可以用作水相，借助水来溶解水溶性物质，特别是盐如缓冲盐、酸或碱。在步骤(a)中制备的溶液与水相的混合可以通过将在步骤(a)中制备的溶液加入到水相或者将水相加入到在步骤(a)中制备的溶液来进行。优选以加强的搅拌或摇动并任选地使用超声波将一种溶液加入到另一种中。适当地，在混合期间将具有较小体积的相加入到具有较大体积的相，但相反的过程也是可能的。
水相由水性溶剂组成。在本发明的范围内，“水性溶剂”是水，其可以包含在其中溶解的物质，特别是电解质，例如盐、酸或碱。
有机溶剂的去除可以通过在标准条件下即在室温和大气压力下蒸发来进行，并且可以通过升高温度和/或降低压力即通过将压力降低至低于大气压的值来加速。蒸发优选在升高的温度下进行，特别优选在30至60℃，和/或在降低的压力下，优选在10-4至80mbar。蒸发可以适当地例如使用旋转蒸发器进行。
透析可以使用本领域技术人员已知的常规透析装置，例如使用在实验室中常规的透析管来进行。适当地选择透析膜的孔径，以使有机溶剂和活性物质可以自由通过透析膜，但聚合物不能。因此，合适的透析膜的筛上重量(分子量筛截(MWCO))优选高于活性物质和溶剂的分子量，但低于聚合物中存在的最小的聚合物分子的分子量。例如，在15kDa的较低分子量聚合物和例如300Da分子量的活性物质的情况下，可使用具有低于5kDa且高于1.5kDa的MWCO透析膜。在该实例中，具有3.5kDa或5kDa的MWCO的透析膜是常见的并且是可商购的。
如果透析溶液不含活性物质，则由于包含纳米颗粒侧与包含透析溶液侧之间的浓度差而通过透析发生活性物质从包含纳米颗粒侧减少。由于在包围纳米颗粒的溶剂中活性物质的损失，从纳米颗粒到这种溶剂出现活性物质浓度的陡峭梯度，其结果是活性物质能够离开纳米颗粒，然后由于浓度梯度通过至透析溶液并被运送走。通过使用根据本发明的其中溶解活性物质的透析溶液，至少减少了这种浓度梯度并因此抵抗活性物质从纳米颗粒的损失。在透析溶液中，活性物质可以从其所有浓度达到最大溶解度(饱和溶解度)而存在于透析溶液中，透析溶液优选用活性物质饱和。
通过扩散和对所采用的膜的粘附也可以降低纳米颗粒的活性物质装载量。因此，根据优选实施方式，在进行透析之前，将透析膜与包含活性物质的透析溶液接触，优选与用活性物质饱和的透析溶液接触，以使该膜相对地富含包含于透析溶液中的活性物质。根据本发明特别优选的实施方式，透析针对活性物质的饱和透析溶液和活性物质的饱和透析膜进行。
由于在透析溶液中包含活性物质，根据本发明方法制备的纳米颗粒还具有吸附于纳米颗粒的活性物质的量。这种活性物质的量在向患者给药时有利地直接作为初始剂量提供。
根据本发明有利的实施方式，除了活性物质之外，透析溶液还包含溶解的物质，尤其是电解质，特别优选缓冲液和/或盐，其也存在于提供用于纳米颗粒的给药的制剂中。由于因透析的液体交换，可以有利的和简单的方式通过该路线获得已存在于适合给药至患者的溶剂中的纳米颗粒。因此，在给药至患者之前，还要确保免于微生物，这可以通过简单的方式例如无菌过滤来进行。或者，整个制备过程也可在无菌条件下进行，使得无需进行后续的杀菌。
透析后，纳米颗粒存在于水性溶剂中。如上所述，如果在适合于给药至患者的溶剂中得到纳米颗粒，那么在给药至患者时，除了吸附在纳米颗粒的活性物质之外，溶解在溶剂中的活性物质也可以作为初始剂量来提供。
如果例如为了稳定化将水性溶剂从纳米颗粒去除(这例如优选可以通过冷冻干燥的方法或者还通过喷雾干燥的方法进行)，那么在去除水的过程中，溶解在溶剂中的活性物质至少部分地沉积在纳米颗粒上，使得这在给药至患者同样作为初始剂量来提供。
在根据本发明的方法中，优选采用在水中具有低饱和溶解度的活性物质，优选具有<200μg/ml的饱和溶解度，特别优选具有<100μg/ml的饱和溶解度(均在25℃下测量)。因此，本发明还涉及方法，其特征在于，活性物质在水中具有<200μg/ml的饱和溶解度，优选<100μg/ml的饱和溶解度，均在25℃下测量。
特别优选用作活性物质的活性物质选自以下：化学治疗剂，尤其是紫杉醇衍生物、喜树碱衍生物、铂配合物或N-芥化合物；抗风湿药，例如糖皮质激素，特别是地塞米松、莫米松、倍氯米松或泼尼松龙；抗感染剂，例如HIV治疗剂，特别是利托那韦；以及抗霉菌剂，尤其是酮康唑、伊曲康唑、灰黄霉素；降脂剂，例如非诺贝特；抗氧化剂和维生素，例如生育酚衍生物、视黄酸衍生物、胆钙化醇；抗生素， 例如万古霉素或肽可霉素(teicomycin)；还有胆固醇和脂肪酸。因此，本发明还涉及方法，其特征在于，用作活性物质的活性物质选自以下：
化学治疗剂，尤其是紫杉醇衍生物、喜树碱衍生物、铂配合物或N-芥化合物；抗风湿药，例如糖皮质激素，特别是地塞米松、莫米松、倍氯米松或泼尼松龙；抗感染剂，例如HIV治疗剂，特别是利托那韦；以及抗霉菌剂，尤其是酮康唑、伊曲康唑、灰黄霉素；降脂剂，例如非诺贝特；抗氧化剂和维生素，例如生育酚衍生物、视黄酸衍生物、胆钙化醇；抗生素例如万古霉素或肽可霉素；还有胆固醇和脂肪酸。
根据本发明一个有利的实施方式，在该方法中用作聚合物的是两性聚合物。本发明因此也涉及根据本发明的方法，其特征在于所采用的聚合物是两性聚合物。两性聚合物是由亲水性(“喜水”)和疏水性(“憎水”)结构部分构建。由于这种结构，两性聚合物在由水和与水不可混溶的溶剂(特别是有机溶剂，例如二氯甲烷)的非均质混合物中，优选在水相与有机相之间的界面处积聚。
根据本发明的一个特别有利的实施方式，用作两性聚合物的是嵌段共聚物。因此，本发明还涉及方法，其特征在于，用作两性聚合物是嵌段共聚物。嵌段共聚物由一种或多种不同嵌段组成，所述嵌段由亲水性组分a)和疏水性组分b)组成，其中各个嵌段可以含有不同的单体或者具有相同或不同链长的相同单体。组分a)和b)可同时或彼此独立地是直链或支链、梳形或星形。组分b)也可以是交联聚合物。
特别适合作为疏水性组分b)的是可生物降解的聚合物，例如聚酯、聚-ε-己内酯、聚-α-羟基酯、聚-β-羟基酯、聚酐、聚酰胺、聚磷酸酯(polyphospazene)、聚二烷酮、聚苹果酸、聚酒石酸(polytartaricacid)、聚原酸酯、聚碳酸酯、多糖、肽和蛋白质。
亲水性组分a)由至少双官能和优选水溶性构建嵌段建立，合适的聚合物的实例是聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、多糖(例如改性的纤维素和淀粉)、藻酸盐、肽和蛋白质。
根据本发明可采用的嵌段共聚物可含有以下作为亲水性组分，例 如聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、多糖或其共聚物，优选聚乙二醇-聚丙二醇共聚物、聚乙二醇-聚丙二醇-聚丙二醇共聚物；和作为疏水性组分的聚乳酸、聚乙醇酸、聚羟基丁酸、聚羟基戊酸、或其共聚物，优选聚乳酸-共-乙醇酸，还有聚丙烯酸和其衍生物、特别是羟基丙基乙基丙烯酸或羟基丙基甲基丙烯酸，聚硅氧烷和其衍生物、特别是与丙烯酸的共聚物，聚苯乙烯或其共聚物、特别是与聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物。因此，本发明还涉及方法，其特征在于，嵌段共聚物含有作为亲水性组分的聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、多糖或其共聚物，优选聚乙二醇-聚丙二醇共聚物，聚乙二醇-聚丙二醇-聚丙二醇共聚物；和作为疏水性组分的聚乳酸、聚乙醇酸、聚羟基丁酸、聚羟基戊酸、或其共聚物，优选聚乳酸-共-乙醇酸，还有聚丙烯酸和其衍生物、特别是羟基丙基乙基丙烯酸或羟基丙基甲基丙烯酸，聚硅氧烷和其衍生物、特别是与丙烯酸的共聚物，聚苯乙烯或其共聚物、特别是与聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物。
根据本发明一个有利的实施方式，用作嵌段共聚物的是聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚乙醇酸、聚乙二醇-聚乳酸-共-乙醇酸、聚乙二醇-聚羟基戊酸、聚乙二醇-聚硅氧烷、聚乙二醇-聚硅氧烷-共-丙烯酸、聚乙二醇-聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙二醇-聚乙基丙烯酸甲酯(polymethylethacrylic)、聚乙二醇-聚异丙基丙烯酸(polyisoprylacrylic)、聚乙二醇-聚苯乙烯。因此，本发明还涉及方法，其特征在于，用作嵌段共聚物的是聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚乙醇酸、聚乙二醇-聚乳酸-共-乙醇酸、聚乙二醇-聚羟基戊酸、聚乙二醇-聚硅氧烷、聚乙二醇-聚硅氧烷-共-丙烯酸、聚乙二醇-聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙二醇-聚乙基丙烯酸甲酯、聚乙二醇-聚异丙基丙烯酸、聚乙二醇-聚苯乙烯。
根据另一个有利的实施方式，在根据本发明的方法中用作有机溶剂是这样的溶剂，其至少部分、优选完全地可与水混溶的溶剂。因此，本发明还涉及方法，其特征在于，用作有机溶剂的是至少部分、优选 完全可与水混溶的溶剂。
在本发明的范围内，至少部分可与水混溶的溶剂是在室温下(25℃)可与水以至少40/60v/v(有机溶剂/水)的体积比混合，得到均一的均质相的溶剂。如果超过得到均质相的可混合的水的最大比例，那么在含均质有机和水的第一相与由水组成的第二相之间发生相分离。与水充分混溶的有机溶剂是在室温下(25℃)与水可以任何体积比混合得到均一均质相的有机溶剂。
在根据本发明的方法中，用作有机溶剂的可以是直链或支链醇，优选甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇或叔丁醇，丙酮，二甲基甲酰胺，四氢呋喃或二甲亚砜。因此，本发明还涉及方法，其特征在于，用作有机溶剂的是直链或支链醇，优选甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇或叔丁醇，丙酮，二甲基甲酰胺，四氢呋喃或二甲亚砜。
根据本发明的是酸或碱的活性物质优选在每种情况下以互补的方式与酸或碱混合，以提高其溶解性。如果活性物质是酸，则向其中加入碱；如果是碱则加入酸。酸或碱可以在根据权利要求1的步骤(a)或步骤(b)中加入。因此，本发明还涉及一个根据本发明的方法的实施方式，其特征在于，在根据权利要求1的步骤(a)中，除了聚合物和活性物质之外，还将酸或碱溶于有机溶剂中，和/或将酸或碱溶于权利要求1的步骤(b)中的水性溶剂中。
适合的酸是有机酸，优选甲酸、乙酸或三氟乙酸；或无机酸，优选盐酸、硝酸或硫酸。合适的碱是有机碱，优选二甲基胺或三甲基胺；或无机碱，优选氢氧化钠、氢氧化钾或氨。因此，本发明还涉及方法，其特征在于，所述酸是有机酸，优选甲酸、乙酸或三氟乙酸，或无机酸，优选盐酸、硝酸或硫酸；碱是有机碱，优选二甲胺或三甲胺，或无机碱，优选氢氧化钠、氢氧化钾或氨。
根据本发明的方法的一个有利的实施方式，按照如下所述的来选择用于溶解活性物质和聚合物的有机溶剂。在此，在可与水至少部分混合的溶剂的选择中，在每种情况下加入并溶解会嵌入溶剂中的一定量的活性物质。根据本发明的一个有利的实施方式，选择的溶剂包括， 例如，醇类(甲醇、乙醇、异丙醇、1-丙醇、叔丁醇)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二烷、四氢呋喃(THF)、乙腈(ACN)和丙酮。如果活性物质是酸或碱，那么在每种情况下根据如上所述方法向其中加入酸或碱。
对于溶液而言，在每种情况下将各个等量的活性物质溶于等量的有机溶剂中。在每种情况下采用的活性物质和有机溶剂的量是可变的，关键在于，活性物质与溶剂的比例在每种情况下是相同的。对于实际实施而言，已证明适当的是，在每种情况下将1mg活性物质溶于100μl有机溶剂中。
如果活性物质不溶于有机溶剂，那么该溶剂不适合用于制备纳米颗粒。如果要得到澄清溶液，那么在每种情况下逐步加入相等限定量的水性溶剂并各自混合，直到在加入和混合之后活性物质的沉淀可见(视觉溶解度)。视觉溶解度的评估是在合适的容器中(优选在具有小直径的玻璃管中，例如在气相色谱(直径为0.5cm，高度为3cm)的常规的玻璃管中)，在冷光下(所述光优选向上对黑暗的表面照射，优选对着黑色表面作为背景)目视进行。该过程的示意图示于图1中。
根据本发明一个优选实施方式，用作水性溶剂是与根据权利要求1步骤(b)中使用的水性溶剂具有相同组分的溶剂。
可以与最大比例的水性溶剂混合而不使活性物质从溶液沉淀的有机溶剂特别适用于根据本发明的方法。因此，本发明还涉及所述方法的实施方式，其特征在于，在根据权利要求1步骤(a)中的纳米颗粒的制备中使用的有机溶剂是这样的有机溶剂，当连续混合水性溶剂时，在制备包含给定量的活性物质的溶液期间，与在其他有机溶剂中在每种情况下包含相同量的活性物质的那些溶液相比，最大比例的水性溶剂可混入该有机溶剂中而活性物质不从溶液沉淀出来
通过使用在连续水性溶液混合时可与最大比例的水性溶剂混合的有机溶剂可以确保，与使用其它溶剂相比，在根据权利要求1的步骤(c)中有机溶剂的蒸发期间，活性物质和聚合物较长期留在溶液中。
根据权利要求1在步骤(c)中有机溶剂从在根据步骤(b)中制 备的溶剂混合物的蒸发因在溶剂混合物中有机溶剂的比例降低而导致活性物质和聚合物在溶剂混合物中的溶解度连续降低。如果对于与水性溶剂混合的有机溶剂而言，在蒸发期间，即使在溶剂混合物中有机溶剂的比例仅仅稍微降低也会出现活性物质的溶解性不足，那么在活性物质已经沉淀时聚合物仍然完全或者基本上以溶解的形式存在并且还形成没有纳米颗粒。如果在纳米颗粒形成之前活性物质沉淀，那么它不再被包封在聚合物中，使得在进一步蒸发的过程中获得很少或根本没有活性物质嵌在其中的纳米颗粒。
就使用在连续与水性溶剂混合时可与最大比例的溶剂混合的有机溶剂而言，可以延长在蒸发期间活性物质存在于溶液中的时间，并可以防止活性物质过早的不期望的沉淀。由于延长了在蒸发期间活性物质存在于溶液中的时间，优选地首先形成同时封装一些活性物质的纳米颗粒。通过继续蒸发，由于共溶剂效应混合物中下降比例的有机溶剂不再足以保持溶液中的活性物质。最后，在此过程中尚未被封装的活性物质分布在纳米颗粒的疏水性核中。
根据本发明有利的实施方式，通过以下方法确定有机溶剂：
(a)在不同有机溶剂中制备各个具有相同活性物质含量的活性物质溶液，
(b)向在步骤(a)中制备的溶液的每个中加入相同量的水性溶液，
(c)检查在每种情况下所述活性物质是否完全溶解在步骤(b)的所述溶液中，
(d)采用根据步骤(c)的活性物质完全溶解其中的溶液，重复执行步骤(b)和(c)，直到根据步骤(c)活性物质不再完全溶解，
(e)在所述活性物质不再完全溶解之前，鉴别根据步骤(d)可累积混合最大量的水性溶液的有机溶剂。因此，本发明还涉及方法的实施方式，其特征在于，
通过以下方法确定有机溶剂：
(a)在不同有机溶剂中制备各个具有相同活性物质含量的活性物质溶液，
(b)向在步骤(a)中制备的溶液的每个中加入相同量的水性溶液，
(c)检查在每种情况下所述活性物质是否完全溶解在步骤(b)的所述溶液中，
(d)采用根据步骤(c)的活性物质完全溶解其中的溶液，重复执行步骤(b)和(c)，直到根据步骤(c)活性物质不再完全溶解，
(e)在所述活性物质不再完全溶解之前，鉴别根据步骤(d)可累积混合最大量的水性溶液的有机溶剂。
根据本发明一个有利的实施方式，用于确定所述有机溶剂的方法是使用有机溶剂甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基甲酰胺、四氢呋喃和二甲基亚砜。因此，本发明还涉及根据本发明的方法的实施方式，其特征在于，用作有机溶剂的是甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基甲酰胺、四氢呋喃和二甲亚砜。
如果在根据权利要求1的步骤(b)中(有机相和水相的混合)采用过大量的水相，那么由于活性物质和聚合物的溶解度相应降低，可能会发生活性物质的沉淀，然后活性物质不再嵌入到纳米颗粒中。根据本发明有利的实施方式，如此选择水相的量，使得在根据权利要求1的步骤(b)中有机相和水相混合后，水相相对于有机相以低于与有机相混合的最大量而无需活性物质不再完全溶解的量存在。因此，本发明还涉及方法的实施方式，其特征在于，选择水相的量，使得在权利要求1步骤(b)中有机相和水相混合后，水相相对于有机相以低于与有机相混合的最大量而无需活性物质不再完全溶解的量存在。
为了确保蒸发开始之前活性物质完全溶解，如此合理地选择在方法中水相相对于有机相的量，使得其显著低于可以与有机相混合的最大量而无需活性物质不再完全溶解的量存在。例如，如果有机和水相的混合物导致活性物质自3:2v/v的体积比起沉淀，那么在共溶剂蒸发中有机相和水相可以采用4:1v/v的体积比，这样确保两个组分完全溶解。
优选的是，根据第11-12页所描述的用于测定有机溶剂的方法的步骤(a)至(d)来进行对可与有机相混合的最大量的水相的测定。因此，本发明还涉及一个实施方式，其特征在于，根据第11-12页所描述的用于测定有机溶剂的方法的步骤(a)至(d)来进行对可与有机相混合的最大量的水相的测定。
实施根据本发明的方法有利地导致具有增加的活性物质装载量和活性物质双相释放的纳米颗粒，所述双相释放是在给药后活性物质首先快速释放(起始剂量)，随后是活性物质更持久的释放。因此，本发明还涉及纳米颗粒，其特征在于，它们通过根据本发明的方法制备。
实施例在不限制其的情况下解释本发明。
实施例
实施例1
将活性物质地塞米松和5-[2-(2-氟-苯基)-1,8-萘啶-4-基]-2,6-萘啶-1-基胺(以下也称为活性物质B)用于装载量实验。将活性物质分别以1mg/100μl的浓度溶于下列溶剂中用于选择溶剂：四氢呋喃(THF)、乙腈(ACN)、丙酮、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇。另外，向活性物质B的各有机溶液中再加入0.1％的三氟乙酸(v/v)，以建立明显的“pH”。依次向各溶液加入10μl水并混合，直至活性物质开始沉淀(视觉溶解度)。图2显示地塞米松的视觉溶解度。图3显示活性物质B的视觉溶解度。
对于地塞米松而言，由于其在四氢呋喃中增加的视觉溶解度，因此选择此溶剂作为制备纳米颗粒的有机溶剂。确定4:1v/v(THF：水)作为起始比。
对于活性物质B而言，由于其在该溶剂中增加的视觉溶解度，因此选择该溶剂作为生产纳米颗粒的有机溶剂。确定5:1v/v(乙腈：水)为起始比。
实施例2
使用以下聚合物制备和装载纳米颗粒：来自加拿大Montreal的 PolymersourceInc.的PEG-PDLLA[5-b-23]、PEG-PCL[5-b-32.5]、PEG-PVPy[5-b-20]。此外，使用德国Ingelheim的Boehringer Ingelheim的PEG-PLGA[5-b-28](Resomer RGP 50155d)。所有聚合物以研究质量存在。
为了能够将在不同聚合物中具有共溶剂蒸发和封装的其它制备方法彼此比较，按照以下制备纳米颗粒并装载地塞米松：
·由丙酮的直接透析：
将10mg或20mg嵌段共聚物和1mg或2mg地塞米松溶解于1ml丙酮中。将该溶液引入透析管(MWCO 6-8kDa，Spectrumlabs Inc.,Breda，荷兰)中并密封。透析针对5l水进行24小时；4小时换一次水。随后将形成的制剂从透析管移出，通过0.2μm的过滤器，并调整至2ml的体积。
·O/W型乳液：
首先按照2.a“直接透析”的描述制备没有活性物质的预成型的胶束。为了装载活性物质，将2mg地塞米松溶解在1ml二氯甲烷中(VWR，Darmstadt，德国)。将此有机溶液注入到5ml含水胶束相中并加强搅拌。形成O/W型乳液，将其进一步在室温下搅拌过夜。随后进行通过0.2μm过滤器的过滤步骤并将体积调整至5ml。
·利用随后透析的共溶剂蒸发：
将10mg嵌段共聚物和2mg地塞米松溶解在6ml THF中。向该溶液中加入2ml水。在25℃的温度和30mbar的压力下将此溶液在圆底烧瓶中蒸发10分钟。将得到的制剂引入到Float-A-Lyzer G2透析管(MWCO 8-10kDa，Spectrumlabs Inc.，Berda，荷兰)，其在随后的透析的情况下，已相对在地塞米松饱和的水中的饱和溶液预平衡。然后将制剂针对5l水或者地塞米松饱和水透析24小时。最后，将该制剂通过0.2μm过滤器，并将体积调整至2ml。
对根据各种方法制备的纳米颗粒的活性物质装载量和粒径及其粒径分布进行表征。
通过HPLC测定活性物质的装载量
将100μl所得的胶束制剂溶于900μl乙腈中。经UV检测器(检测波长：282nm)采用HPLC系统(Merck Hitachi La Chrom Elite)检测该溶液。在30℃下在Agilent EclipsePlus C18柱(粒径3.5μm，长度5cm)上进行分离。使用梯度法用于分离。在此，流动相A由90％的乙腈和10％的乙酸铵缓冲液pH4.5组成(v/v)，流动相B具有相反的组成。通过校准曲线来确定地塞米松样品浓度。
经以下式1进行活性物质装载量的计算：
通过动态光散射(DLS)法测定粒径
DLS技术测定流体动力学颗粒半径或直径。为此，以1:100(v/v)用水稀释样品，并在Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd.，Worcestershire，UK)中以背散模式测量。经累积量计算粒径。此外，计算多分散性指数(PdI)，其被认为是粒径分布的散射的量度。PdI可以具有0和1之间的值，其中0表示单分散而1表示(全)多分散。
结果列于下表1。
在表1中，其中PEG-PDLLA表示聚乙二醇化的聚(D，L-乳酸)，PEG-PLGA表示聚乙二醇化的聚(乳酸-共-乙醇酸)，PEG-PCL表示聚乙二醇化的聚(己内酯)，PEG-PVPy表示聚乙二醇化聚-4-(乙烯基吡啶)，LOQ表示量的限定(HPLC法的测定限)，共溶剂蒸发表示共溶剂蒸发和THF表示四氢呋喃。
实施例3
用活性物质B装载的纳米颗粒的制备和装载
根据本发明中所述的方法以共溶剂蒸发和相对活性物质饱和溶液的透析之间的结合进行纳米颗粒的制备和装载。
在超声处理下将10mg嵌段共聚物和1mg活性物质溶解在8ml乙腈/0.1％三氟乙酸中(v/v)。将得到的溶液与2ml水混合。随后将混合物引入到圆底烧瓶中，并在减压(30mbar)和在25℃下蒸发有机溶剂(10分钟)。将得到的纳米颗粒引入Float-A-Lyzer G2透析管(MWCO 8-10kDa，Spectrumlabs Inc.,Berda，荷兰)，并针对5l用活性物质B饱和的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)透析24小时，pH为7.4。最后，将该制剂通过0.2μm过滤器过滤，并将制剂的体积调整至2ml。
活性物质装载量的测定
将100μl所得的制剂溶于900μl乙腈中。经UV检测器(检测波长：254nm)采用HPLC系统(Merck Hitachi La Chrom Elite)检测该溶液。在30℃下，在Agilent Eclipse PlusC18柱(粒径3.5μm，长度5cm)上进行分离。使用梯度法用于分离。在此，流动相A由90％的乙腈和10％的具有0.1％三氟乙酸的水组成(v/v)，流动相B具有相反的组成。通过校准曲线来确定活性物质B样品浓度。
在此，根据式1进行活性物质装载量的计算。类似于实施例2测定粒径和粒径分布。
在使用不同嵌段共聚物时的用最佳装载技术的结果总结于表2中。
表2中，其中PEG-PDLLA指聚乙二醇化的聚(D，L-乳酸)，PEG-PLGA表示聚乙二醇化的聚(乳酸-共-乙醇酸)，PEG-PCL表示聚乙二醇化的聚(己内酯)，PEG-PVPy表示聚乙二醇化聚-4-(乙烯基吡啶)，LOQ表示量的限定(HPLC方法的测定限)，共溶剂蒸发表示共溶剂蒸发和ACN表示乙腈和TFA表示三氟乙酸。

Claims (27)

1.制备纳米颗粒的方法，包括以下步骤
(a)将至少一种活性物质和至少一种聚合物溶解在有机溶剂中，
(b)将在步骤(a)中制备的溶液与水相混合，
(c)蒸发有机溶剂，
(d)借助针对包含相同活性物质的水性透析溶液透析来纯化在步骤(c)中得到的装载有活性物质的纳米颗粒；
其中在纳米颗粒的制备中步骤(a)中使用的有机溶剂是这样的有机溶剂，当连续混合水性溶剂时，在制备包含给定量的活性物质的溶液期间，与在其他有机溶剂中在每种情况下包含相同量的这种活性物质的那些溶液相比，最大比例的水性溶剂可混入该有机溶剂中而活性物质不从溶液沉淀出来；
所述活性物质在水中的饱和溶解度<200μg/ml，在25℃下测量。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述活性物质在水中的饱和溶解度<100μg/ml，在25℃下测量。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，用作活性物质的是选自以下的活性物质：化学治疗剂；抗风湿药；抗感染剂；以及抗霉菌剂；降脂剂；抗氧化剂和维生素；抗生素；还有胆固醇和脂肪酸。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述抗风湿药是糖皮质激素。
5.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述抗感染剂是HIV治疗剂。
6.根据权利要求3的方法，其特征在于，用作活性物质的是选自以下的活性物质：紫杉醇衍生物、喜树碱衍生物、铂配合物或N-芥化合物；地塞米松、莫米松、倍氯米松或泼尼松龙；利托那韦；酮康唑、伊曲康唑、灰黄霉素；非诺贝特；生育酚衍生物、视黄酸衍生物、胆钙化醇；万古霉素或肽可霉素。
7.根据权利要求1至6任一项的方法，其特征在于，用作聚合物的是两性聚合物。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于，用作聚合物的是嵌段共聚物。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述嵌段共聚物含有作为亲水性组分的聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、多糖、或其共聚物；和作为疏水性组分的聚乳酸、聚乙醇酸、聚羟基丁酸、聚羟基戊酸或其共聚物，还有聚丙烯酸和其衍生物，聚硅氧烷和其衍生物，聚苯乙烯或其共聚物。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述嵌段共聚物含有聚乙二醇-聚丙二醇共聚物或聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇共聚物作为亲水性组分。
11.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述嵌段共聚物含有聚乳酸-共-乙醇酸作为疏水性组分。
12.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述聚丙烯酸的衍生物是羟基丙基乙基丙烯酸或羟基丙基甲基丙烯酸。
13.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述聚硅氧烷的衍生物是与丙烯酸的共聚物。
14.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述聚苯乙烯的共聚物是与聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物。
15.根据权利要求9的方法，其特征在于，用作嵌段共聚物的是聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚乙醇酸、聚乙二醇-聚乳酸-共-乙醇酸、聚乙二醇-聚羟基戊酸、聚乙二醇-聚硅氧烷、聚乙二醇-聚硅氧烷-共-丙烯酸、聚乙二醇-聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙二醇-聚甲基乙基丙烯酸、聚乙二醇-聚异丙基丙烯酸、聚乙二醇-聚苯乙烯。
16.根据权利要求1至6任一项的方法，其特征在于，用作有机溶剂的是与水至少部分混溶的溶剂。
17.根据权利要求16的方法，其特征在于，用作有机溶剂的是与水完全混溶的溶剂。
18.根据权利要求16的方法，其特征在于，用作有机溶剂的是直链或支链醇，丙酮，二甲基甲酰胺，四氢呋喃或二甲亚砜。
19.根据权利要求18的方法，其特征在于，所述醇是甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇或叔丁醇。
20.根据权利要求1至6任一项的方法，其特征在于，在根据权利要求1的步骤(a)中，除了聚合物和活性物质之外还将酸或碱溶于所述有机溶剂中，和/或将酸或碱溶于在权利要求1的步骤(b)中的所述水相中。
21.根据权利要求20的方法，其特征在于，所述酸是有机酸，或者无机酸，并且所述碱是有机碱，或无机碱。
22.根据权利要求21的方法，其特征在于，所述酸是甲酸、乙酸、三氟乙酸、盐酸、硝酸或硫酸。
23.根据权利要求21的方法，其特征在于，所述碱是二甲胺、三甲胺、氢氧化钠、氢氧化钾或氨。
24.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述有机溶剂是通过以下方法确定：
(a)在不同有机溶剂中制备在每种情况下具有相同活性物质含量的活性物质溶液，
(b)向在步骤(a)中制备的溶液的每个中加入在每种情况下相同量的水性溶液，
(c)检查在每种情况下所述活性物质是否完全溶解在步骤(b)的溶液中，
(d)采用根据步骤(c)的活性物质完全溶解其中的溶液，重复执行步骤(b)和(c)，直到根据步骤(c)的活性物质不再完全溶解，
(e)在所述活性物质不再完全溶解之前，鉴别根据步骤(d)可累积混合最大量的水性溶液的有机溶剂。
25.根据权利要求24的方法，其特征在于，用作有机溶剂的是甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基甲酰胺、四氢呋喃和二甲基亚砜。
26.根据权利要求1至6任一项的方法，其特征在于，选择水相的量，使得在步骤(b)中混合有机相和水相之后，水相相对于有机相以低于可以最大量混入有机相而没有出现活性物质不再完全溶解的量存在。
27.根据权利要求26的方法，其特征在于，根据权利要求24的步骤(a)至(d)确定可以最多量混入有机相中的水相的量。
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