CN104116774A - 一种红景天提取物、提取方法和其在治疗/预防眼科病症中的用途及制品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种红景天提取物、其提取方法和在治疗/预防眼科疾病中的用途以及包含该提取物的制品,所述提取方法包括如下步骤:(1)原料处理,得到原料粉末;(2)膨胀体系提取,得到初提物浸膏;(3)无机溶液与有机溶剂的液液萃取,得到精制浸膏;(4)柱色谱分离,得到所述红景天提取物。该提取物具有良好的治疗/预防眼科疾病如视疲劳、干眼症和眼部神经疼痛的功效,可将其制备成眼贴剂型,从而方便使用且安全无毒,在医药临床领域具有良好的应用前景和工业化潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种名贵中药材的活性成分、提取方法及其用途和相应制品,更特别地涉及一种红景天提取物、提取方法和其在缓解视疲劳中的用途及其制品,属于天然植物的活性成分提取及其应用领域。
背景技术
在如今的快节奏现代生活中,眼科病症是眼科领域中常见的一种疾病,也是因眼或全身器质性因素与精神、心理因素相互交织而引起的综合征,例如常表现为眼部疼痛、烧灼感、酸胀、异物感、畏光、流泪、视物模糊、眼睛干涩和复视等症状,甚至出现头痛、呕吐、恶心等全身症状,严重影响了患者生活质量。
而随着社会的发展以及社会环境的变化、工作节奏的加快、视频终端(VDT)的普及,视觉的使用越来越超负荷,从而使视疲劳、干眼症、眼部神经疼痛等的患者急剧增加。
据不完全统计,我国电子计算机机房工作人员约有22.7%存在视疲劳和干眼症等症状,而对VDT操作者做调查后发现其中视疲劳患者和干眼症、眼部神经不适等病症的检出率为33.5%。2005年,我国学者发现渤海地区视屏终端作业者的视疲劳发生率高达69.1%,而2012年研究者对郑州市中心医院1503名医务人员进行问卷调查,其中有1356人主诉有不同程度的视疲劳、干眼症和眼部神经疼痛等病症,检出率高达90.2%。虽然以上的这些研究所针对的调查群体有一定的差异,但可以看出整体而言,各个行业的眼科疾病患病率有逐年增加的趋势。有关数据显示,目前我国患有眼科疾病的人数已达1.5亿人之多。
我国最早对眼科疾病如视疲劳的认识可以追溯到唐代,更早的古代医典籍中并没有记载涉及视疲劳的病症。被西方尊称为“医学论之父”的唐代孙思邈已经提出过度用眼会导致视疲劳,他在《千金要方·七窍门》中云:“其读书、搏弈等过度用目者,名曰肝劳”;本病常因用目不当或过度,病机主要有四:久视劳心伤神,耗气损血,以至目中经络涩滞,则气血不充,目窍失养;经脉瘀阻,三阳经脉郁结闭阻,气血不充,诸脉不利,目窍失养;劳瞻竭视,肝肾精血亏损不足,不能濡养目窍;脾气亏虚,清阳不升,以至气血精微不能上充目窍。但无论劳伤心脾或肝肾不足,亦或脉络瘀阻,均致气、血、津、精不能上荣于目,目中筋脉、肌肉调节失司,发为本病而见久视疲劳、头目胀痛诸症。综上所述,目中筋脉、肌肉调节失司为本病主要病机,治疗应以调畅筋脉为核心,方能达到解肌止痛之目的。
随着科技的进步和发展,现代眼科学认为,视疲劳、干眼症和眼部神经疼痛的发生与以下4方面的因素有关:1、眼部因素:包括屈光因素、眼外肌肌力不平衡、调节辐辏功能障碍、干眼症。2、神经因素:副交感神经和视皮层的高度兴奋与视疲劳的发生有关。3、环境因素:长时间近距离工作、工作或阅读环境照明不足、注视目标不稳定、VDT工作环境等都可以导致调节紧张产生视疲劳。4、体质因素:社会、家庭和工作等的压力过大在体质衰弱的患者极易引起视疲劳,社会和同事的承认支持、人际关系、个人性格特征、精神压力等也是影响视疲劳的相关因素。
目前对这些疾病的治疗已经做了大量研究,但由于影响因素复杂,仍然没有取得突破性的进展,面对呈现多样化的发展趋势,尚无公认的行之有效的方法。西医主要治疗方法是去除诱因、休息、口服维生素、眼局部滴用人工泪液等。
其中,七叶洋地黄双苷滴眼液是目前临床上应用最多的治疗视疲劳、干眼症的滴眼液,利于病症的缓解,但效果欠佳,至今尚无满意的有效药物,且价格较贵。
而中医理论认为视疲劳、干眼症等疾病是由经络不通,气血运行不畅导致。并有如下的几种治疗和缓解方法:
1、眼部热敷可以促进眼部的血液循环,增加眼部的血液供应,加强眼肌的调节功能,消除眼肌的过度紧张,起到缓解和消除视疲劳的作用;
2、按摩特定的穴位,如太阳穴、承泣穴、四百穴、精明穴、攒竹穴等可缓解眼部疲劳;
3、针刺对视疲劳有明显的缓解作用,针刺相应经穴,可使针感“气至病所”,激发经气,通过通经作用,改善气血运行障碍,达到气血调和,通经开窍的目的,消除眼疲劳和干眼症的症状。
在诸多天然植物中,红景天是一种非常重要的活性植物,其系蔷薇目景天科(Crassulaceae)红景天属(RhodiolaL.),为多年生草本或亚灌木野生植物,因其花、根、茎之浸液均成红色而得名。
红景天属种类在全球有96种,主要分布于喜马拉雅地区、亚洲西部至北部,经我国、朝鲜、日本至北美洲,并以我国为分布中心。我国有红景天属植物73种,主要分布在西南、西北、华中、华北及东北,尤以云南、四川及西藏高寒地区种类最多。
国内学者对西藏、河北、长白山高山冻原带等地的红景天属植物进行了实地资源调查,部分红景天生长在海拔800-2500m的高寒无污染的灌木丛林中,大多数生长在海拔3500-5000m左右的高山流石上。由于其生长环境极其恶劣,缺氧、低温干燥、狂风、强紫外线照射、昼夜温差大,故它己从遗传上适应高寒多变的恶劣环境,而具有很强的生命力和特殊的适应性。
目前己从高山红景天中分离出40多种化学物质,其主要有效成分是红景天苷、苷元酪醇、超氧化物岐化酶等多种生物活性物质,此外还含有脂肪、蜡、甾醇、淀粉、蹂质、酚性化合物、黄酮、有机酸、蛋白质和水溶性挥发油等。
红景天在传统中医中具有“固本扶正”之功效,现代研究还证实,红景天能通过对糖和蛋自质两大能量来源的调节来对抗运动性疲劳的过早出现,目前普遍认为疲劳的产生是能量大量消耗的结果,而糖元是机体活动的能量物质,是从ATP的重要来源之一。肌酸磷酸激酶在能量转换中起重要作用,能使磷酸激酶的高能磷酸键转移到ADP分子上,形成人体所需要的自接能量ATP,红景天能够使肌酸磷酸酶升高,并有促进该酶功能的作用;红景天中含有较多的微量元素锌,锌是许多酶(包括乳酸脱氢酶等)的功能成分或活化剂,与糖代谢有密切关系,同时红景天能使机体更节省地利用糖原和ATP,为肌肉活动提供更充分的能量作用。
正是由于红景天具有如此的多种功效,经现代药理和临床研究发现,红景天有类似人参的补益作用,能抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗辐射、抗病毒、抑制癌细胞生长、提高工作效率、延缓机体衰老,目前已广泛应用于医疗保健等领域。
在治疗视疲劳领域,也有一些中药治疗方法,但均为口服液的形式,虽然具有一定的疗效、不良反应小、并发症少。但依然存在着对患者的依从性低、治疗周期长、见效缓慢、服用剂量大等诸多缺陷,尤其是在青少年群体中,其推广应用性低。
迄今为止,使用天然植物活性成分来制备可治疗和/或改善眼部疾病的特定眼贴剂型,以及其中特定活性成分的提取方法等均未见诸报道。因此,如何从天然植物中提取活性成分,并将其以眼贴或类似剂型的形式加以更方便使用、见效快、治疗简单等而用于视疲劳、干眼症和/或眼部神经疼痛等疾病的缓解和/或治疗,正是目前该领域内的一个重要发展方向和关注焦点。
发明内容
有鉴于此,为了得到一种能够有效治疗和/或缓解眼部疾病的天然植物活性成分的眼贴剂型,以及研究如何进行活性成分的提取、制品的制备等等诸多方面,本发明人对此进行了深入研究,在付出了大量创造性劳动后,从而完成了本发明。
本发明人发现,当采用特定的提取方法时,能够得到具有良好缓解和/或治疗眼部疾病的天然植物活性成分,并通过将其制成眼贴剂型,具有使用方便、安全、不口服、不会对肠胃道产生刺激,疗效显著且稳定的诸多优异特点,这是出人意料的。
具体而言,本发明主要涉及如下几个方面。
第一个方面,本发明涉及一种红景天提取物的提取方法,所述提取方法包括如下步骤:
(1)原料处理,得到原料粉末;
(2)膨胀体系提取,得到初提物浸膏;
(3)无机溶液与有机溶剂的液液萃取,得到精制浸膏;
(4)柱色谱分离,得到红景天提取物。
在本发明的所述提取方法中,所述步骤(1)具体为:称取红景天入药部位,干燥至恒重,然后粉碎、研磨,过50目筛,得到原料粉末。
其中,所述红景天入药部位可为红景天整株的叶、根茎或花,优选为根茎。
在本发明的所述提取方法中,所述步骤(2)具体为:将步骤(1)所得的原料粉末加入到醇类溶剂中,再加入二氧化碳,密封加压至2-4Mpa,从而形成膨胀溶剂体系,在50-60℃下搅拌提取1-2h,泄压至常压,趁热过滤,将滤液进行减压浓缩,得到初提物浸膏;
其中,所述醇类溶剂为C1-6醇,例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、正己醇等,优选为正丙醇或异丙醇,最优选为异丙醇。
其中,以克(g)计的所述原料粉末与毫升(ml)计的醇类溶剂的比值为1:6-10,即每1克(g)所述原料粉末使用6-10毫升(ml)所述醇类溶剂,例如可为1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。
其中,以毫升(ml)计的所述醇类溶剂与以克(g)计的所述二氧化碳的比值为1:5-7,即每1毫升(ml)所述醇类溶剂使用5-7克(g)二氧化碳,例如可为1:5、1:5.5、1:6、1:6.5或1:7,优选为1:6。
在本发明的所述提取方法中,所述步骤(3)具体为:将初提物浸膏用Na2CO3水溶液充分溶解,然后过滤,得到水相和不溶物;将不溶物加入到丙酮和正己烷的混合有机溶剂中,充分溶解,得到有机相;将所述水相和有机相加入到容器中,摇匀使其混合充分,然后静置分层,分离得到水相和有机相,将有机相减压浓缩,得到精制浸膏。
其中,Na2CO3水溶液的质量浓度为30-50%,例如可为30%、35%、40%、45%或50%,其用量并无严格的限定,只要能够将初提物浸膏充分溶解即可,也即能够使得最终的不溶物不再减少为止(也就是将可溶解的成分全部溶解掉)。
其中,在所述丙酮和正己烷的混合有机溶剂中,丙酮与正己烷的体积比为1:1-3,例如可为1:1、1:2或1:3,其用量并无严格的限定,只要能够将不溶物充分溶解即可。
在本发明的所述提取方法中,所述步骤(4)包括如下步骤:
(4.1)将精制浸膏用丙酮充分溶解,得到分离液;
(4.2)以色谱柱的体积计,自上而下在柱中依次填充20%中性硅胶、15%酸性硅胶、25%中性Al2O3、10%碱性硅胶和10%聚酰胺,在上端加入分离液,然后分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂进行洗脱,收集乙酸乙酯-正己烷-正丁醇洗脱部分,得到洗脱液;
(4.3)将洗脱液进行减压浓缩,得到浸膏,真空干燥,完全除去残留的有机溶剂,得到所述红景天提取物。
在本发明的所述方法中,所述步骤(4.1)中的丙酮用量并无特别的限定,只要能够将精制浸膏完全溶解即可,但为了后续的洗脱考虑,其用量为恰恰能够将精制浸膏完全溶解最为合适。
在本发明的所述方法中,在所述步骤(4.2)中,以色谱柱的体积计,自上而下在柱中依次填充20%中性硅胶、15%酸性硅胶、25%中性Al2O3、10%碱性硅胶和10%聚酰胺,从而填充满色谱柱的80%体积,上端剩余的20%体积用来装入洗脱溶剂和方便各种操作。
其中,所述中性硅胶即为市场上商业出售的中性硅胶,其粒度为100-400目,例如可为100目、200目、300目或400目。
其中,所述酸性硅胶和碱性硅胶均是由上述中性硅胶经过处理而制得,酸性硅胶的制备方法如下:
将中性硅胶在真空下于马弗炉中在600-700℃下放置6-8小时,然后自然冷却至室温,得到活化中性硅胶;将质量浓度为98%的浓硫酸滴入活化中性硅胶中,振荡均匀,得到酸性硅胶。
其中,所述活化中性硅胶与浓硫酸的质量比为10:2-4,例如可为10:2、10:3或10:4。
所述碱性硅胶的制备方法如下:将中性硅胶在真空下于马弗炉中在600-700℃下放置6-8小时,然后自然冷却至室温,得到活化中性硅胶;将NaOH水溶液滴入到活化中性硅胶中,振荡均匀,然后在50-70℃下干燥1-2小时,从而得到碱性硅胶。
其中,NaOH水溶液的摩尔浓度为1-3mol/L,例如可为1mol/L、2mol/L或3mol/L。
其中,所述活化中性硅胶与NaOH水溶液的质量比为10:1-3,例如可为10:1、10:2或10:3。
其中,所述中性Al2O3可商业购得,其粒度可为100-200目,在此不再赘述。
其中,所述聚酰胺是本领域中公知聚酰胺树脂柱所用的聚酰胺,其分子量为16000-20000。
其中,石油醚(即洗脱用石油醚)的体积用量为2-3BV(倍床层体积),例如可为2BV、2.5BV或3BV。所述床层体积即为色谱柱的填充体积,在本发明中由于色谱柱填充了其体积计的20%中性硅胶、15%酸性硅胶、25%中性Al2O3、10%碱性硅胶和10%聚酰胺,共80%体积,因此石油醚的体积用量为该色谱柱80%体积的2-3倍。下面对于氯仿、乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂的体积用量限定具有相同的对比基准和相同的BV定义。
其中,氯仿(即洗脱用氯仿)的体积用量为4-5BV(倍床层体积),例如可为4BV、4.5BV或5BV。
其中,乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂(即洗脱用乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂)的体积用量为2.5-4.5BV,例如可为2.5BV、3BV、3.5BV、4BV或4.5BV。
其中,在所述乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂中,乙酸乙酯、正己烷、正丁醇的体积比为1:1-3:2-4,例如可为1:1:2、1:1:3、1:1:4、1:2:2、1:2:3、1:2:4、1:3:2、1:3:3、1:3:4,优选为1:2:3。
第二个方面,本发明涉及通过上述方法提取得到的所述红景天提取物。
第三个方面,本发明涉及所述红景天提取物在治疗和/缓解眼部疾病中的用途,也即涉及所述红景天提取物在制备用于治疗视疲劳、干眼症和/或眼部神经疼痛的药品和/或制品中的用途。
在本发明的所述用途中,所述眼部疾病例如可为视疲劳、干眼症和/或眼部神经疼痛。
本发明人发现,通过上述方法提取得到的本发明红景天提取物对于视疲劳、干眼症和/或眼部神经疼痛具有良好的缓解和/或治疗效果,从而可用来制备用于治疗视疲劳、干眼症和/或眼部神经疼痛的药品和/或制品。
其中,所述制品优选为眼贴,如此可以更为方便的使用、无需口服。
第四个方面,本发明涉及使用上述红景天提取物制得的眼贴,所述眼贴型具有使用方便、安全、不口服、不会对肠胃道产生刺激,疗效显著且稳定的诸多优异性能。
在本发明的所述眼贴中,除本发明的所述红景天提取物外,所述眼贴还包含冰片和基质材料。
其中,所述基质材料为卡波姆、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、三乙醇胺、聚丙烯酸酯压敏胶、柠檬酸、甘油和1,2-丙二醇。
本发明的所述眼贴的制备方法如下:
I.冰片纱布的加工
将冰片置于无菌纱布上,放置于不锈钢容器内,密闭高温消毒20-30分钟,自然冷却至室温,得到冰片纱布;
II.基质材料的制备
将卡波姆、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇分别加水溶胀,然后水浴溶解,混合,再加入三乙醇胺、聚丙烯酸酯压敏胶、柠檬酸、甘油和1,2-丙二醇搅拌均匀,得到基质材料;
III.眼贴制备
将上述红景天提取物用水分散后,加入到上述基质材料中,充分搅拌、混合均匀,得到胶粘液;
将所述胶粘液涂布于冰片纱布上,然后将冰片纱布的背层粘附到背衬层上,在烘箱中干燥,当冰片纱布的表面固化有弹性后,覆盖防粘层,再切割成椭圆形,即得本发明的所述眼贴。
在本发明的所述眼贴的制备方法中,步骤I中的无菌纱布的面积例如可为10×15cm,冰片的用量为每10-15片10×15cm的无菌纱布使用50-80g冰片。
在本发明的所述眼贴的制备方法中,步骤I中“密闭高温消毒”处理时的温度只要高于冰片的沸点温度即可,例如可为260-280℃,如此处理可使得冰片浸润在无菌纱布上,从而得到分布均匀的冰片纱布。
在本发明的所述眼贴的制备方法中,步骤II中卡波姆、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、三乙醇胺、聚丙烯酸酯压敏胶、柠檬酸、甘油和1,2-丙二醇的用量可进行合适的选择,例如其质量份可如下:
在本发明的所述眼贴的制备方法中,所述基质材料的一种示例性制备方法如下:
依质量份计,将卡波姆5份、羧甲基纤维素钠1.8份、聚乙烯醇1.5份加入到去离子水中,充分溶胀,然后加热水浴溶解,并充分搅拌均匀;然后加入三乙醇胺12份、聚丙烯酸酯压敏胶10份、柠檬酸3份、甘油75份和1,2-丙二醇80份,并搅拌均匀,得到基质材料。
在本发明的所述眼贴的制备方法中,步骤III中,将红景天提取物用适量去离子水分散,得到均匀的糊状物,以便后续与基质材料的充分混合均匀。
其中,红景天提取物的质量与卡波姆、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、三乙醇胺、聚丙烯酸酯压敏胶、柠檬酸、甘油、1,2-丙二醇的总质量的比为1:75-100,例如可为1:75、1:80、1:85、1:90、1:95或1:100。
在本发明的所述眼贴的制备方法中,步骤III中的背衬层、防粘层都是眼贴领域中的常用材料,均可商业购得,在此不再一一赘述。
通过上述的描述可知,本发明提供了一种红景天提取物、其提取方法、在制备用于治疗和/或缓解眼科疾病的药品或制品中的用途,以及包含所述红景天提取物的制品。
发明人发现,所述红景天提取物无任何毒副作用,而包含所述红景天提取物的眼贴能够有效的缓解和/或治疗眼科疾病,如视疲劳、干眼症和眼部神经疼痛等,且由于制成了眼贴的剂型,从而无需口服、使用方便、疗效显著且稳定,从而在医药临床领域具有广泛的应用前景和巨大的工业化潜力。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明,但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明,并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定,更非将本发明的保护范围局限于此。
其中,在所有实施例和对比例中,所使用的酸性硅胶和碱性硅胶都是下面制备例1和制备例2所制得的酸性硅胶和碱性硅胶。
制备例1:酸性硅胶的制备
将粒度为200-300目的中性硅胶在真空下于马弗炉中在650℃下放置7小时,然后自然冷却至室温,得到活化中性硅胶;
将质量浓度为98%的浓硫酸滴入上述活化中性硅胶中,所述活化中性硅胶与浓硫酸的质量比为10:3,然后充分振荡均匀,得到酸性硅胶。
制备例2:碱性硅胶的制备
将粒度为200-300目的中性硅胶在真空下于马弗炉中在650℃下放置7小时,然后自然冷却至室温,得到活化中性硅胶;
将摩尔浓度为2mol/L的NaOH水溶液滴加到上述活化中性硅胶中,其中,活化中性硅胶与NaOH水溶液的质量比为10:2,充分振荡均匀,然后在60℃下干燥90分钟,从而得到碱性硅胶。
实施例1
(1)原料处理,得到原料粉末
称取红景天根茎,干燥至恒重,然后粉碎、研磨,过50目筛,得到原料粉末。
(2)膨胀体系提取,得到初提物浸膏
将步骤(1)所得的原料粉末加入到异丙醇中,再加入二氧化碳,密封加压至2Mpa,从而形成膨胀溶剂体系,在50℃下搅拌提取2h,泄压至常压,趁热过滤,将滤液进行减压浓缩,得到初提物浸膏;
其中,以克(g)计的所述原料粉末与毫升(ml)计的异丙醇的比值为1:8;以毫升(ml)计的所述异丙醇与以克(g)计的所述二氧化碳的比值为1:6。
(3)无机溶液与有机溶剂的液液萃取,得到精制浸膏
将步骤(2)所得的初提物浸膏用质量浓度为30%的Na2CO3水溶液充分溶解,然后过滤,得到水相和不溶物;将不溶物加入到丙酮和正己烷的混合有机溶剂中,其中丙酮和正己烷的体积比为1:1,充分溶解,得到有机相;将所述水相和有机相加入到容器中,摇匀使其混合充分,然后静置分层,分离得到水相和有机相,将有机相进行减压浓缩,得到精制浸膏。
(4)柱色谱分离,得到红景天提取物
(4.1)将步骤(3)所得的精制浸膏用丙酮充分溶解,丙酮的量为恰好将精制浸膏完全溶解为宜,得到分离液;
(4.2)以色谱柱的体积计,自上而下在柱中依次填充20%粒度为200-300目的中性硅胶、15%酸性硅胶、25%粒度为100-200目的中性Al2O3、10%碱性硅胶和10%分子量为16000-20000之间的层析用聚酰胺,在上端加入分离液,然后分别用2倍床层体积(BV)的石油醚、4倍床层体积(BV)的氯仿、2.5倍床层体积(BV)的乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂进行洗脱,其中乙酸乙酯、正己烷、正丁醇的体积比为1:2:3,收集乙酸乙酯-正己烷-正丁醇洗脱部分,得到洗脱液;
(4.3)将洗脱液进行减压浓缩,得到浸膏,在60-90℃下真空干燥,完全除去残留的有机溶剂,得到所述红景天提取物,命名为TQ1。
实施例2
(1)原料处理,得到原料粉末
称取红景天根茎,干燥至恒重,然后粉碎、研磨,过50目筛,得到原料粉末。
(2)膨胀体系提取,得到初提物浸膏
将步骤(1)所得的原料粉末加入到异丙醇中,再加入二氧化碳,密封加压至3Mpa,从而形成膨胀溶剂体系,在55℃下搅拌提取1.5h,泄压至常压,趁热过滤,将滤液进行减压浓缩,得到初提物浸膏;
其中,以克(g)计的所述原料粉末与毫升(ml)计的异丙醇的比值为1:6;以毫升(ml)计的所述异丙醇与以克(g)计的所述二氧化碳的比值为1:5。
(3)无机溶液与有机溶剂的液液萃取,得到精制浸膏
将步骤(2)所得的初提物浸膏用质量浓度为40%的Na2CO3水溶液充分溶解,然后过滤,得到水相和不溶物;将不溶物加入到丙酮和正己烷的混合有机溶剂中,其中丙酮和正己烷的体积比为1:2,充分溶解,得到有机相;将所述水相和有机相加入到容器中,摇匀使其混合充分,然后静置分层,分离得到水相和有机相,将有机相进行减压浓缩,得到精制浸膏。
(4)柱色谱分离,得到红景天提取物
(4.1)将步骤(3)所得的精制浸膏用丙酮充分溶解,丙酮的量为恰好将精制浸膏完全溶解为宜,得到分离液;
(4.2)以色谱柱的体积计,自上而下在柱中依次填充20%粒度为200-300目的中性硅胶、15%酸性硅胶、25%粒度为100-200目的中性Al2O3、10%碱性硅胶和10%分子量为16000-20000之间的层析用聚酰胺,在上端加入分离液,然后分别用2.5倍床层体积(BV)的石油醚、4.5倍床层体积(BV)的氯仿、3.5倍床层体积(BV)的乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂进行洗脱,其中乙酸乙酯、正己烷、正丁醇的体积比为1:2:3,收集乙酸乙酯-正己烷-正丁醇洗脱部分,得到洗脱液;
(4.3)将洗脱液进行减压浓缩,得到浸膏,在60-90℃下真空干燥,完全除去残留的有机溶剂,得到所述红景天提取物,命名为TQ2。
实施例3
(1)原料处理,得到原料粉末
称取红景天根茎,干燥至恒重,然后粉碎、研磨,过50目筛,得到原料粉末。
(2)膨胀体系提取,得到初提物浸膏
将步骤(1)所得的原料粉末加入到异丙醇中,再加入二氧化碳,密封加压至4Mpa,从而形成膨胀溶剂体系,在60℃下搅拌提取1h,泄压至常压,趁热过滤,将滤液进行减压浓缩,得到初提物浸膏;
其中,以克(g)计的所述原料粉末与毫升(ml)计的异丙醇的比值为1:10;以毫升(ml)计的所述异丙醇与以克(g)计的所述二氧化碳的比值为1:7。
(3)无机溶液与有机溶剂的液液萃取,得到精制浸膏
将步骤(2)所得的初提物浸膏用质量浓度为50%的Na2CO3水溶液充分溶解,然后过滤,得到水相和不溶物;将不溶物加入到丙酮和正己烷的混合有机溶剂中,其中丙酮和正己烷的体积比为1:3,充分溶解,得到有机相;将所述水相和有机相加入到容器中,摇匀使其混合充分,然后静置分层,分离得到水相和有机相,将有机相进行减压浓缩,得到精制浸膏。
(4)柱色谱分离,得到红景天提取物
(4.1)将步骤(3)所得的精制浸膏用丙酮充分溶解,丙酮的量为恰好将精制浸膏完全溶解为宜,得到分离液;
(4.2)以色谱柱的体积计,自上而下在柱中依次填充20%粒度为200-300目的中性硅胶、15%酸性硅胶、25%粒度为100-200目的中性Al2O3、10%碱性硅胶和10%分子量为16000-20000之间的层析用聚酰胺,在上端加入分离液,然后分别用3倍床层体积(BV)的石油醚、5倍床层体积(BV)的氯仿、4.5倍床层体积(BV)的乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂进行洗脱,其中乙酸乙酯、正己烷、正丁醇的体积比为1:2:3,收集乙酸乙酯-正己烷-正丁醇洗脱部分,得到洗脱液;
(4.3)将洗脱液进行减压浓缩,得到浸膏,在60-90℃下真空干燥,完全除去残留的有机溶剂,得到所述红景天提取物,命名为TQ3。
对比例1-12
1、除将实施例1-3的步骤(2)中的异丙醇分别替换为甲醇外,分别以与实施例1-3的相同方式实施了对比例1-3,得到的最终红景天提取物分别命名为D1、D2和D3。
2、除将实施例1-3的步骤(2)中的异丙醇分别替换为乙醇外,分别以与实施例1-3的相同方式实施了对比例4-6,得到的最终红景天提取物分别命名为D4、D5和D6。
3、除将实施例1-3的步骤(2)中的异丙醇分别替换为正丙醇外,分别以与实施例1-3的相同方式实施了对比例7-9,得到的最终红景天提取物分别命名为D7、D8和D9。
4、除将实施例1-3的步骤(2)中的异丙醇分别替换为正丁醇外,分别以与实施例1-3的相同方式实施了对比例10-12,得到的最终红景天提取物分别命名为D10、D11和D12。
对比例13-15
除省略掉步骤(3),即将步骤(2)得到的初提物浸膏直接进行步骤(4)的柱色谱分离外,分别以与实施例1-3的相同方式实施了对比例13-15,得到的最终红景天提取物分别命名为D13、D14和D15。
对比例16-30
1、除步骤(4.2)的色谱柱中用粒度为200-300目的中性硅胶填充色谱柱的80%体积外(即将酸性硅胶、中性Al2O3、碱性硅胶和分子量为16000-20000之间的层析用聚酰胺均替换为粒度为200-300目的中性硅胶),分别以与实施例1-3的相同方式实施了对比例16-18,得到的最终红景天提取物分别命名为D16、D17和D18。
2、除步骤(4.2)的色谱柱中用酸性硅胶填充色谱柱的80%体积外(即将粒度为200-300目的中性硅胶、中性Al2O3、碱性硅胶和分子量为16000-20000之间的层析用聚酰胺均替换为酸性硅胶),分别以与实施例1-3的相同方式实施了对比例19-21,得到的最终红景天提取物分别命名为D19、D20和D21。
3、除步骤(4.2)的色谱柱中用粒度为100-200目的中性Al2O3填充色谱柱的80%体积外(即将粒度为200-300目的中性硅胶、酸性硅胶、碱性硅胶和分子量为16000-20000之间的层析用聚酰胺均替换为粒度为100-200目的中性Al2O3),分别以与实施例1-3的相同方式实施了对比例22-24,得到的最终红景天提取物分别命名为D22、D23和D24。
4、除步骤(4.2)的色谱柱中用碱性硅胶填充色谱柱的80%体积外(即将粒度为200-300目的中性硅胶、酸性硅胶、粒度为100-200目的中性Al2O3和分子量为16000-20000之间的层析用聚酰胺均替换为碱性硅胶),分别以与实施例1-3的相同方式实施了对比例25-27,得到的最终红景天提取物分别命名为D25、D26和D27。
5、除步骤(4.2)的色谱柱中用分子量为16000-20000之间的层析用聚酰胺填充色谱柱的80%体积外(即将粒度为200-300目的中性硅胶、酸性硅胶、粒度为100-200目的中性Al2O3和碱性硅胶均替换为分子量为16000-20000之间的层析用聚酰胺),分别以与实施例1-3的相同方式实施了对比例28-30,得到的最终红景天提取物分别命名为D28、D29和D30。
对比例31-33
除步骤(4.2)中的洗脱液仅仅使用石油醚并收集石油醚洗脱部分,以及石油醚的使用量分别为原三种洗脱溶剂的总量(即石油醚为原来的石油醚、正己烷、乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂三者的总量)外,分别以与实施例1-3的相同方式实施了对比例31-33,得到的最终红景天提取物分别命名为D31、D32和D33。
对比例34-36
除步骤(4.2)中的洗脱液仅仅使用正己烷并收集正己烷洗脱部分,以及正己烷的使用量分别为原三种洗脱溶剂的总量(即石油醚为原来的石油醚、正己烷、乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂三者的总量)外,分别以与实施例1-3的相同方式实施了对比例34-36,得到的最终红景天提取物分别命名为D34、D35和D36。
对比例37-39
除步骤(4.2)中的洗脱液仅仅使用乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂并收集乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂洗脱部分,以及乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂的使用量分别为原三种洗脱溶剂的总量(即石油醚为原来的石油醚、正己烷、乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂三者的总量)外,分别以与实施例1-3的相同方式实施了对比例37-39,得到的最终红景天提取物分别命名为D37、D38和D39。
红景天眼贴的制备
I.冰片纱布的加工
在不锈钢容器内,将50-80g冰片放置于每片面积为10×15cm的10-15片无菌纱布上,密闭,在270℃下消毒25分钟,然后自然冷却至室温,得到冰片纱布。
在以下的所有眼贴中,使用的均为如此处理得到的冰片纱布。
II.基质材料的制备
依质量份计,将卡波姆5份、羧甲基纤维素钠1.8份、聚乙烯醇1.5份加入到去离子水中,充分溶胀,然后加热水浴溶解,并充分搅拌均匀;再加入三乙醇胺10份、聚丙烯酸酯压敏胶10份、柠檬酸3份、甘油75份和1,2-丙二醇80份搅拌均匀,得到基质材料。
在以下的所有眼贴中,使用的均为如此处理得到的基质材料。
III.眼贴制备
将实施例或对比例中得到的红景天提取物适量去离子水分散,得到均匀的糊状物,然后加入到上述基质材料中,充分搅拌、混合均匀,得到胶粘液,其中红景天提取物的质量与卡波姆、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、三乙醇胺、聚丙烯酸酯压敏胶、柠檬酸、甘油、1,2-丙二醇的总质量的比为1:85。
将所述胶粘液涂布于冰片纱布上,然后将冰片纱布的背层粘附到背衬层上,在烘箱中干燥,当冰片纱布的表面固化有弹性后,覆盖防粘层,再切割成最大长度和最大宽度为4cm×2cm的椭圆形,即得本发明的所述眼贴。
毒性测试及眼科疾病治疗测试
在如下的三种测试,均选用山东中医药大学实验动物中心提供的清洁级Wistar大鼠,每次实验采用10只,雌雄各半,平均个体体重为205.6-223.3g。
皮肤急性毒性测试
试验方法:按5000mg/kg体重的剂量,剪取眼贴样品(受试物),贴在动物背部脱毛区(面积30-40cm2),用两层硫酸试纸覆盖,用无刺激性胶布封闭固定24h,24h后去除受试物,观察动物中毒体征,观察期7天,第7天称重一次,称重结束后处死动物并观察身体病理改变。
试验结果:所有测试组的数据结果和背部脱毛区刺激性症状见下表1,其中:
“√”表示背部裸露皮肤无任何异常;
“△”表示背部裸露皮肤有些许刺激性红斑出现;
“×”表示背部裸露皮肤受到严重刺激,出现红肿或大量红色斑点。
表1.皮肤急性毒性实验结果
由此可见,当使用受试物TQ1-TQ3制得的制品后,动物未出现中毒体征,观察期动物无死亡,病理解剖学检查未见异常,由此可见,本发明TQ1-TQ3制品的LD50均大于5000mg/kg体重,皮肤急性毒性测试结果优异,对大鼠皮肤无任何毒性和皮肤刺激副作用。
而当将步骤(2)中膨胀体系中的异丙醇替换为其它醇时,虽然背部裸露皮肤无任何异常,但平均体重增长近乎停滞,证明D1-D12存在一定的副作用,能够影响到身体的正常生长和发育。即便是采用与异丙醇非常类似的正丙醇(将D7-D9),也具有同样的负面影响。这证明了在步骤(2)中异丙醇具有最好的提取效果。
而当省略掉步骤(2)时,发现所得制品具有严重的毒副作用,不但体重显著降低,而且产生了1例死亡例,且背部裸露皮肤受到严重刺激,出现红肿或大量红色斑点。
而当改变步骤(4)中的色谱柱填充物时,也导致了体重显著降低,虽然没有死亡例,但背部裸露皮肤受到严重刺激,出现红肿或大量红色斑点。
而当步骤(4)的洗脱液进行改变时,均导致了体重显著降低,且出现了死亡例,同时背部裸露皮肤受到严重刺激,出现红肿或大量红色斑点。
由上述表1可见,在步骤(2)中使用异丙醇的膨胀体系以及步骤(4)中使用不同洗脱液进行顺次洗脱非常重要,当省略步骤(2)以及改变洗脱液时,导致最终的制品具有强烈的毒副作用,严重至产生死亡例。而色谱柱的填充物种类也对最终制品的性能有显著影响,只有采用本发明的多种不同填充物顺次填充,方可取得最好的效果。
急性眼刺激性测试
试验方法:将包含实施例和对比例提取物的不同眼贴(受试物)用蒸馏水浸泡24小时,每片眼贴使用10ml蒸馏水。然后取浸提液0.1ml滴入大鼠右侧眼结膜囊中,使上、下眼睑被动闭合1s,另一眼睛做自身对照。
滴入浸提液后1h、24h、48h、72h及第4天和第7天,观察受试眼刺激反应情况,并按眼损伤的评分标准记录眼刺激反应的积分,积分越大证明对眼睛的刺激性越大,其中做自身对照的眼睛作为基准,数值为0,以0.5作为划分衡量梯度,测试结果见下表2:
表2.急性眼刺激性测试结果
由表2可见,使用TQ1-TQ3制得的制品后,对大鼠急性眼无刺激性副作用。而当改变步骤(2)中的异丙醇(即便是替换为正丙醇)时,也会产生轻微的副作用。而当改变步骤(4)的色谱柱填充物以及洗脱液时,都将导致产生严重的眼急性刺激副作用,而导致无任何实际使用的可能。
缓解视疲劳测试
该测试按照《保健用品功能学评价程序和检验方法》进行。
测试方法:筛选70例长期用眼、视力易疲劳的自愿受试者,贴敷使用TQ1-TQ3制得的红景天眼贴(每天贴敷3贴,每次贴敷1小时),10天后,根据《保健用品功能学评价程序和检验方法》中的判断标准和方法对测试者进行效果评价,结果见下表3。
表3.缓解视疲劳测试结果
由此可见,使用本发明红景天提取物的眼贴具有显著的缓解视疲劳的功效和作用,可用来缓解和/或预防视疲劳。
如上所述,本发明提供了一种红景天提取物、其提取方法以及其在治疗和/或预防眼科疾病中的用途,以及包含该提取物的制品如眼贴,该提取物具有良好的缓解和/或治疗和/或预防眼科疾病的功效,从而具有良好的治疗应用前景和工业化潜力。
应当理解,这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外,也应理解,在阅读了本发明的技术内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型,所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种红景天提取物的提取方法,所述提取方法包括如下步骤:
(1)原料处理,得到原料粉末;
(2)膨胀体系提取,得到初提物浸膏;
(3)无机溶液与有机溶剂的液液萃取,得到精制浸膏;
(4)柱色谱分离,得到红景天提取物。
2.如权利要求1所述的提取方法,其特征在于:所述步骤(2)具体为:将步骤(1)所得的原料粉末加入到醇类溶剂中,再加入二氧化碳,密封加压至2-4Mpa,从而形成膨胀溶剂体系,在50-60℃下搅拌提取1-2h,泄压至常压,趁热过滤,将滤液进行减压浓缩,得到初提物浸膏。
3.如权利要求1-2任一项所述的提取方法,其特征在于:所述步骤(3)具体为:将初提物浸膏用Na2CO3水溶液充分溶解,然后过滤,得到水相和不溶物;将不溶物加入到丙酮和正己烷的混合有机溶剂中,充分溶解,得到有机相;将所述水相和有机相加入到容器中,摇匀使其混合充分,然后静置分层,分离得到水相和有机相,将有机相减压浓缩,得到精制浸膏。
4.如权利要求1-3任一项所述的提取方法,其特征在于:所述步骤(4)包括如下步骤:
(4.1)将精制浸膏用丙酮充分溶解,得到分离液;
(4.2)以色谱柱的体积计,自上而下在柱中依次填充20%中性硅胶、15%酸性硅胶、25%中性Al2O3、10%碱性硅胶和10%聚酰胺,在上端加入分离液,然后分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂进行洗脱,收集乙酸乙酯-正己烷-正丁醇洗脱部分,得到洗脱液;
(4.3)将洗脱液进行减压浓缩,得到浸膏,真空干燥,完全除去残留的有机溶剂,得到所述红景天提取物。
5.如权利要求4所述的提取方法,其特征在于:所述乙酸乙酯-正己烷-正丁醇混合溶剂中,乙酸乙酯、正己烷、正丁醇的体积比为1:1-3:2-4。
6.根据权利要求1-5任一项所述的提取方法提取得到的红景天提取物。
7.权利要求6的所述红景天提取物在制备用于治疗视疲劳、干眼症和/或眼部神经疼痛的药品和/或制品中的用途。
8.包含权利要求6所述红景天提取物的制品,所述制品优选为眼贴。
9.如权利要求8所述的眼贴,还包含冰片和基质材料。
10.权利要求8或9的眼贴的制备方法,所述方法包括如下步骤:
I.冰片纱布的加工
将冰片置于无菌纱布上,放置于不锈钢容器内,密闭高温消毒20-30分钟,自然冷却至室温,得到冰片纱布;
II.基质材料的制备
将卡波姆、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇分别加水溶胀,然后水浴溶解,混合,再加入三乙醇胺、聚丙烯酸酯压敏胶、柠檬酸、甘油和1,2-丙二醇搅拌均匀,得到基质材料;
III.眼贴制备
将上述红景天提取物用水分散后,加入到上述基质材料中,充分搅拌、混合均匀,得到胶粘液;
将所述胶粘液涂布于冰片纱布上,然后将冰片纱布的背层粘附到背衬层上,在烘箱中干燥,当冰片纱布的表面固化有弹性后,覆盖防粘层,再切割成椭圆形,即得所述眼贴。
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