CN104109650A - 一株贪铜菌及其在金合成中的应用 - Google Patents

Abstract

一株贪铜菌及其在金合成中的应用，属于微生物技术领域。该菌株分离于大连理工大学牛角山泥土样品，2014年6月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9266。该菌株SHE为革兰氏阴性菌，菌体为短杆状，经16SrRNA基因序列测定，其与Cupriavidussp.具有最高的相似性，因此该菌分类命名为Cupriavidussp.SHE，菌株16SrRNA基因序列的GenBank登录号为KJ875863。该菌株具有合成金颗粒的能力，可催化氯金酸合成不同形态及尺寸的金颗粒，显示了其在金合成领域具有潜在的应用价值。

Description

一株贪铜菌及其在金合成中的应用

技术领域

本发明涉及一株贪铜菌及其在金合成中的应用，属于微生物技术领域。 

背景技术

随着工业化进程的发展，传统矿石资源的需求持续增加，从而导致矿山的开采力度随之增强。目前世界上矿产资源原矿品位下降严重，嵌布的粒度也越来越小。因此，对于低品位、尾矿以及难处理矿产的进一步开发利用成为了目前冶金领域的一个重要研究方向。相比于传统的物化冶金技术，微生物冶金不仅具有过程简单、环境友好无污染等优点，在对低品位矿石中的金属回收、难开发矿石的预处理以及矿区的尾矿污染治理等方面具有潜在的优势。在目前流行的生物氧化提金技术中，关键步骤是利用微生物还原吸附的络合金粒子，实现变废为宝，该领域正成为国内外的研究热点。 

目前已有较多关于微生物或其代谢产物还原Au⁺/Au³⁺络合物生成单质金的报道。He等人利用Rhodopseudomonas capsulate可将氯金酸 (HAuCl₄)中的Au³⁺还原为不同大小和形貌的金纳米颗粒；Nangia等对细菌Stenotrophomonas maltophilia 的Au³⁺还原机理进行了考察，认为该还原过程是由依赖于辅酶NADPH的还原酶实现的；Xie等人发现牛血清蛋白可在室温下对Au³⁺进行还原从而生成纳米金颗粒。然而已有报道中，绝大多数微生物所介导的Au⁺/Au³⁺还原反应生成的金颗粒均为纳米级大小 (直径小于200 nm)，并不利于实际废水中金的回收，因此获取可直接合成大粒径金颗粒的菌株具有重要意义。2006年Science上一篇报道指出Ralstonia metallidurans CH34 (随后被重新鉴定为Cupriavidus metallidurans)可以将HAuCl₄中的Au³⁺还原为肉眼可见的24 K纯金，首次证明微生物能直接合成金颗粒，但相关研究屈指可数，特别是国内对该领域的相关研究十分匮乏。 

发明内容

本发明的目的在于提供一株贪铜菌及其在金合成中的应用，该菌株可以催化HAuCl₄合成不同形态的金颗粒，在金合成领域中具有重要应用价值。 

本发明所涉及一株贪铜菌 (拉丁文分类命名为Cupriavidus sp. SHE)，所述菌株的登记入册编号为CGMCC No. 9266，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2014年6月4日。所述贪铜菌是革兰氏阴性菌，菌体为短杆状,其16S rRNA基因序列的Genbank登录号为KJ875863。 

所述菌株筛选自大连理工大学牛角山泥土样品，菌株的培养条件：LB培养基的组成为NaCl 10 g/L、蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5 g/L、pH 7.0；将100 mL培养基于121℃高温高压灭菌20 min，在30℃，150 rpm条件下培养菌株至对数中后期。 

所述的一株贪铜菌株应用于金颗粒的合成。 

本发明的有益效果是：一株贪铜菌分离自大连理工大学牛角山泥土样品，其对金颗粒具有较好的合成能力，该菌株SHE在HAuCl₄浓度为0.1-5 mM条件下均能够合成金颗粒，因此该菌株在金合成领域具有一定的应用潜力。 

  

附图说明

图1贪铜菌株SHE扫描电镜图片。 

图2贪铜菌株SHE的系统发育树。 

图3贪铜菌株SHE的在LB培养基中的生长曲线。 

图4不同HAuCl₄浓度下SHE合成金颗粒紫外全波扫描图。 

图5贪铜菌株SHE合成金颗粒的透射电镜表征。 

图6不同HAuCl₄浓度下SHE合成金颗粒的质量。 

  

具体实施方式

实施例1：本发明菌株的获得 

本发明有关一株贪铜菌SHE，2014年于大连理工大学牛角山上的泥土样品经过反复的平板稀释涂布法，将样品涂布在无机盐 ((NH₄)₂SO₄ 2.0 g/L、KH₂PO₄ 2.0 g/L、Na₂HPO₄12H₂O 3.28 g/L、FeCl₃ 0.00025 g/L、吲哚100 mg/L) 平板上，30 ℃， 150rpm条件下培养获得菌液。菌株SHE的细胞形态为短杆状，大小为0.5 μm左右，扫描电镜照片如图1。

实施例2：菌株的16S rRNA分子鉴定 

提取贪铜菌SHE的基因组DNA，通过PCR扩增16S rRNA基因序列，利用BLAST程序对序列进行同源对比，得到与其最相近的菌种为贪铜菌，二者16S rRNA基因序列相似性为99%，因此判定SHE为贪铜菌。图2为16S rRNA基因的系统发育树，SHE菌株的16Sr RNA基因序列如下：

>SHE 16S rRNA gene sequence

GTCGAACGGCAGCGCGGACTTCGGTCTGGCGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTACCCTGTTGTGGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGTGGGGGACCGCAAGGCCTCACGCAGCAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCGCGCTGGTTAATACCTGGCGTGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGACAGGCGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAATTGCGCTTGTGACTGCAAGGCTAGAGTGCGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGACGTGACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTTCTCAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATTAGGTGCCCGAAAGGGAAAGTGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTGCGTACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACGCATCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAGGG

实施例3：贪铜菌SHE的生长曲线

利用实施例1中的菌液，采用121 ℃ ，20 min高压灭菌的LB培养基 (NaCl 10 g/L、蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5 g/L、pH 7.0)，30 ℃，150 rpm下培养，接菌量为5%。菌株SHE的生长情况如图3，菌株6-26 h为对数生长期,生长26 h进入稳定期，。

实施例4：不同HAuCl₄浓度下SHE合成金颗粒紫外全波扫描图 

将实施例3中培养16 h (对数中后期) 得到的菌液，8000 rpm离心5min，用超纯水洗涤菌体2-3次，并用超纯水悬起菌体，使菌液OD₆₆₀值为2.5。在6 mL的上述菌液中加入终浓度分别为0.1、0.5、1.0、5.0 mmol/L的HAuCl₄溶液，于30 ℃，150 rpm摇床中培养48 h。将反应液于3000 rpm离心5 min，可将纳米金颗粒留在上清液中，金颗粒和菌体于沉淀中。采用紫外全波扫描，观察溶液中纳米金生成情况如图4所示。在HAuCl₄浓度为0.1和0.5 mmol/L条件下，由于生成的金颗粒浓度较低，在紫外全波谱图中没有对应的特征吸收峰，当HAuCl₄浓度为1.0 mmol/L时，反应体系呈紫色，离心后紫色物质留在上清液中，同时在紫外全波谱图中出现了紫色纳米金颗粒的特征吸收峰。而当HAuCl₄浓度为5.0 mmol/L时，反应液呈黄色，离心后黄色物质在沉淀中，紫外全波谱图中没有特征吸收峰，说明金颗粒的存在状态由紫色的纳米金变为黄色的颗粒金。

实施例5：贪铜菌SHE合成金颗粒的透射电镜表征 

将实施例4中1.0 mmol/L HAuCl₄条件下合成的产物及5.0 mmol/L HAuCl₄条件下合成的产物分别进行透射电镜表征。结果如图5。由图5中a可知，HAuCl₄浓度为1.0 mmol/L时，合成的金颗粒尺寸为纳米级，而由图5中b可知，HAuCl₄浓度为5.0 mmol/L时，合成的金颗粒尺寸为微米级。

[0021] 实施例6：不同HAuCl₄浓度条件下SHE合成金颗粒的质量 

将实施例4中反应48 h后的混合物于12000 rpm离心5 min，沉淀物在105 ℃条件下烘干。称量烘干混合物的总质量，并用电感耦合等离子体发射光谱仪测量金颗粒的质量百分比，计算合成的金颗粒质量，实验结果如图6，结果表明菌株能催化1.0及5.0 mmol/L的HAuCl₄溶液合成2000μg的金颗粒，而低浓度的HAuCl₄溶液合成的金颗粒明显减少。

<110>大连理工大学

<120>一株贪铜菌及其在金合成中的应用

<210> 1

<211> 1389

<212> DNA

<213> 贪铜菌（Cupriavidus sp.）

<400> 1

GTCGAACGGCAGCGCGGACTTCGGTCTGGCGGCGAGTGGCGAACGGGTGA50

GTAATACATCGGAACGTACCCTGTTGTGGGGGATAACTAGTCGAAAGATT100

AGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGTGGGGGACCGCAAGGCCT150

CACGCAGCAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGG200

CCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACAC250

TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATT300

TTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAG350

GCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCGCGCTGGTTAA400

TACCTGGCGTGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGT450

GCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTG500

GGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGACAGGCGTGAAATCCCCGG550

GCTTAACCTGGGAATTGCGCTTGTGACTGCAAGGCTAGAGTGCGTCAGAG600

GGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAA650

TACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGACGTGACTGACGCTCATGCACGA700

AAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAA750

CGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTTCTCAGTAACGTAGCTAACG800

CGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGG850

AATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGC900

AACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCACTAACGAAGCAGAGAT950

GCATTAGGTGCCCGAAAGGGAAAGTGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCG1000

TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC1050

TTGTCTCTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAA1100

ACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAG1150

GGCTTCACACGTCATACAATGGTGCGTACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAG1200

GGGGAGCTAATCCCAGAAAACGCATCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAAC1250

TCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCG1300

GTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGT1350

GGGTTTTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAGGG1389

Claims (3)

1.一株贪铜菌 (Cupriavidus sp. SHE)，其特征是：所述菌株的登记入册编号为CGMCC No. 9266，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2014年6月4日。

2.根据权利要求1所述的一株贪铜菌，其特征在于：所述菌株的培养条件： LB培养基的组成为NaCl 10 g/L、蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5 g/L、pH 7.0；将100 mL培养基于121℃高温高压灭菌20 min，在30℃，150 rpm条件下培养菌株至对数中后期。

3.权利要求1所述的一株贪铜菌应用于金颗粒的合成。