CN104974955A - 贪铜菌yns-85及其在土壤修复中的应用 - Google Patents

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Abstract

贪铜菌YNS-85及其在土壤修复中的应用，菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2015年04月24日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 10740。该菌能降解五氯硝基苯，在溶液体系中培养7 d时其降解率达79.4 %，土壤中培养30 d时其降解率为56.9 %。

Description

贪铜菌YNS-85及其在土壤修复中的应用
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，尤其涉及一种农药杀菌剂五氯硝基苯降解菌分离、鉴定及其土壤修复作用。
背景技术
中草药的研究与应用已有数千年的历史，其独特的治疗作用受到人们的青睐。由于我国复杂的地貌环境和气候条件，从而孕育了极为丰富的中草药资源。目前，我国中药资源总数已达12807种，其中植物11146种，动物类药物1581种，矿物类药物80种，是世界上最大的药材生产国。而大部分中草药都依赖人工栽培，全国药材种植面积超过580万亩，药材生产基地600多个，常年栽培的药材达200余种。随着中草药种植规模的扩大，中草药易受到病虫的危害，特别是在病虫害严重的季节，存在严重的农药滥用现象，导致土壤与植物体中农残超标。五氯硝基苯(pentachloronitrobenzene,PCNB)属有机氯保护性杀菌剂，对多种蔬菜的苗期病害及土传病害有较好的防治效果，但其化学性质稳定，不易被降解，随着施用量的不断增大，其造成的环境与健康问题也日益突出。为解决这一问题，国内外研究者也筛选出多株PCNB降解菌，如金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)、孢子丝菌(S.cyanescens)、总状毛霉菌(M.racemosus)、白腐真菌(Phanerochaete-chrysosporium)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等，但主要为真菌型降解菌，细菌资源较少，且有关能降解PCNB的贪铜菌种质资源未被发现。鉴于此，本发明从土壤中分离筛选出一株对PCNB具有良好降解性能的贪铜菌YNS-85，研究了该菌PCNB的降解特性，为缓解中草药种植过程中的农药污染问题提供了科学依据和新思路，具有广泛的应用潜力。
发明内容
解决的技术问题：本发明针对中药材生产实践中的实际问题和需求，提供了一株贪铜菌YNS-85及其在土壤修复中的应用。
技术方案：贪铜菌(Cupriavidus sp.)YNS-85，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2015年04月24日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.10740。
贪铜菌YNS-85的培养基，按比例每升培养基含有：KH2PO40.5g，Na2HPO4·12H2O 1.2g，NH4NO3 0.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4 0.05g，酵母粉2g，微量元素溶液10mL，有机氮农药为40mg，pH 6.8～7.2。
所述有机氮农药为五氯硝基苯。
所述微量元素每升含有50mg Ca(OH)2，30mg H3BO3，10mg ZnSO4·7H2O，5mgMnSO4·H2O，5mg CuSO4·5H2O，5mg Na2MoO4·2H2O。
所述贪铜菌YNS-85在五氯硝基污染土壤修复中的应用。
五氯硝基污染土壤修复剂，有效成分为贪铜菌(Cupriavidus sp.)YNS-85。
有益效果：贪铜菌YNS-85能降解五氯硝基苯，在溶液体系中培养7d时其降解率达79.4％，在土壤中30d时其降解率为56.9％。
附图说明
图1为菌株YNS-85的菌落形态特征；
图2为菌株YNS-85的透射电镜形态特征；
图3为菌株YNS-85的16S rDNA的系统发育树；
图4为菌株YNS-85对溶液体系中PCNB的降解曲线；
图5为菌株YNS-85对土壤中PCNB的降解曲线。
具体实施方式
实施例1：
1.材料与方法
1.1材料与试剂
筛菌供试土壤为云南文山五氯硝基苯污染土壤。标准品PCNB购自北京百灵威化学技术有限公司。色谱纯正己烷。无水硫酸钠(分析纯)400℃活化6h，冷却后置于玻璃干燥器中保存待用。
1.2培养基组成
LB液体培养基：蛋白胨10.00g，酵母粉5.00g，氯化钠10.00g，加去离子水至1L，调节pH至7.0，固体培养基再按1.5％-2.0％的质量比例加入琼脂。
基础盐培养基：KH2PO4 1.00g，Na2HPO4 1.2g，NH4NO3 0.50g，MgSO4·7H2O 0.20g，FeSO4·7H2O 0.005g，微量元素溶液10mL，加超纯水至1L。用2mol/L HNO3和2mol/L NaOH溶液调整培养基pH值至7.0。
微量元素溶液：Ca(OH)250mg，H3BO330mg，ZnSO4·7H2O 10mg，MnSO4·H2O 5mg，CuSO4·5H2O 5mg，Na2MoO4·2H2O 5mg加去离子水至1L。
PCNB液体筛选培养基：PCNB标准物质溶于丙酮，过0.22μm无菌滤膜，加入冷却的无菌基础盐培养基中，静置超净台中待丙酮挥发。
1.3降解菌的筛选、分离与驯化
取5g新鲜土壤加入以五氯硝基苯为唯一碳源的基础盐培养基中。30℃，120rpm避光培养7d后，以5wt.％接种量连续富集，转接4次。取一定稀释的富集培养液150μL涂布至LB培养基上，30℃培养2d。待出现单菌落后，挑取单菌落划线纯化。将纯化后菌株转接至PCNB为20mg/L的基础盐培养基中，在30℃，120rpm避光培养7d后分析降解菌降解效果。
选取降解效果最好的降解菌作进一步研究，并命名为YNS-85。将YNS-85菌株置于20.0-100.0mg/L PCNB液体筛选培养基中进行逐级驯化每隔5d考察一次降解能力，待降解能力基本稳定后停止驯化。
1.4降解菌的鉴定
对YNS-85菌株进行PCR扩增的引物采用27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s；55℃30s；72℃1min30s；循环24次；72℃10min；循环24次。得到的PCR扩增产物经过纯化后用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。16SrDNA的克隆及序列测定委托美吉(上海)生物医药科技有限公司完成。将所得序列在GenBank对16SrRNA序列进行同源性比对分析，采用Mega 6.0构建系统发育树。生理生化鉴定采用购自嘉合(上海)生物科技有限公司的API 20NE试剂盒。
1.5降解菌YNS-85对溶液中五氯硝基苯的降解性能分析
在100mL灭菌三角瓶中加入400μL浓度为2.00g/L的PCNB丙酮溶液，静置于超净台使丙酮充分挥发，再加入19mL灭菌基础盐培养液。取生长至对数期的降解菌YNS-85菌液，调节菌体密度使得OD600吸光值为1.0左右。接种1mL菌悬液于基础盐培养基中，同时以加入1mL无菌水的处理为对照(CK)，于30℃120rpm条件下避光培养7d，每天取样测定溶液中PCNB浓度及降解菌生长情况。
1.6降解菌YNS-85对污染土壤中五氯硝基苯的降解性能分析
取过夜生长至对数期的YNS-85菌液，10000rpm/min离心5分钟后收集菌体，用基础盐培养液洗涤3次后重悬。称取1kg五氯硝基苯污染土壤装入瓷钵中，实验设计试验组(Y)：接种10wt.％OD600为1左右的降解菌菌悬液，对照组(CK)：接种等体积基础盐培养液。充分搅拌后用无菌水将土壤含水量调整至田间持水量的60％，在温室中避光培养。分别在第7、15、30d取样测定土壤中五氯硝基苯含量。
1.7PCNB提取分析
菌液中按两倍体积加入色谱纯正己烷，并加入0.40g硫酸铵作为破乳剂，涡旋3min后置摇床上振荡30min，静置10min待样品分层稳定后取上层有机相1.0mL，加入无水硫酸钠除去水分，用色谱纯正己烷稀释，过0.22μm滤膜后加入进样瓶，待GC-ECD检测。用已知浓度标准品测定回收率，结果表明在1-100mg/L范围内，溶液中PCNB的回收率为87.7％-108％，表明该方法可用于溶液中PCNB提取与检测。
土壤中PCNB提取方法：准确称取5g土壤于60mL玻璃离心管中，加入二氯甲烷/正己烷混合溶剂(体积比1:1)20mL，浸泡过夜，超声萃取30min，3000r/min离心3min，收集上清液，再按照上述方法提取2次，合并3次的提取液并旋转蒸发至约2mL后过复合硅胶柱。复合硅胶柱内依次装填硅胶、中性氧化铝和无水硫酸钠(质量比＝2:2:1)。用二氯甲烷/正己烷混合溶剂(体积比＝1:1)淋洗该柱，弃去淋洗液，然后加入处理后的样品提取液，用30mL二氯甲烷/正己烷混合溶剂洗脱，洗脱液旋转蒸发浓缩至1mL，加5mL色谱纯正己烷旋转蒸发至近干，用正己烷定容至1mL,待GC-ECD检测。PCNB标样(10μg/g)的基质加标平均回收率为92.0％，相对标准偏差1.7％。
气相色谱检测条件：Agilent 7890型气相色谱仪，色谱柱为DB-35MS。进样量1.0μL，不分流，载气流量1.0mL/min，进样口温度260℃，ECD检测器，检测器温度为310℃；程序升温：初始80℃，保留0.5min，以40℃/min升温到210℃，持续0.5min，以6℃/min升温到230℃，持续1min，再以40℃/min升温到280℃保持0.5min。PCNB降解率(％)＝(对照组浓度-降解组浓度)/对照组×100％。
2.实验结果
2.1YNS-85菌株形态
YNS-85菌株在LB固体培养基上于30℃恒温培养箱中培养48h，菌落形态如图1所示，菌落呈淡黄色、圆形、表面光滑、边缘整齐、略有凸起，菌落直径一般在1-2mm之间。菌体革兰氏染色为阴性。透射电镜照片图2显示，菌体呈短杆状，无鞭毛。
2.2YNS-85菌株的生理生化特征
YNS-85菌株的生理生化特征如表1所示，结果显示硝酸盐还原为亚硝酸盐、硝酸盐还原为氮试验为阳性，吲哚试验、葡萄糖酸化、脲酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶试验为阴性，不能利用阿拉伯糖、麦芽糖、甘露醇，可利用葡萄糖酸盐、癸酸、已二酸、苹果酸、柠檬酸和苯乙酸。
表1 YNS-85菌株的生理生化特征
+,表示阳性；-,表示阴性
2.3YNS-85菌株的分子生物学鉴定
以YNS-85菌株DNA为模板，使用细菌通用引物检测菌株16SrDNA序列，在GenBank中与已发现的菌株序列进行比对，根据GenBank提供的序列同源性比较，YNS-85菌株与Cupriavidus necator(登录号为CP002878)同源性为99％，判断该菌为贪铜菌属(Cupriavidus sp.)。采用Mega 6中neighbor-joining算法构建YNS-85菌株系统发育树，如图3所示。
2.4YNS-85菌株对溶液体系中PCNB的降解能力
YNS-85降解PCNB的时间动态变化如图4所示，在40mg/kg PCNB基础盐培养基中接种YNS-85后PCNB迅速降低，培养第1d的其降解率达50.3％。随着时间推移，实验组PCNB含量逐渐减低，OD600吸光值逐渐升高，表明YNS-85可以代谢PCNB并进行生长、繁殖。在溶液体系中培养7d时其降解率达79.4％。可见，降解菌YNS-85对PCNB有明显的降解作用。
2.5YNS-85对土壤中PCNB的降解能力
修复过程处理中土壤PCNB含量变化如图5所示。污染土壤中PCNB初始浓度为2.42mg/kg，与对照组相比，接种YNS-85处理组中PCNB浓度显著下降，培养30d后土壤中PCNB的降解率为56.9％。
                       序列表
 
<110>  中国科学院南京土壤研究所
 
<120>  贪铜菌YNS-85及其在土壤修复中的应用
 
<130>  F1502487
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
agagtttgat cctggctcag                                                 20
 
 
<210>  2
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
taccttgtta cgactt                                                     16
 
 

Claims (6)

1.贪铜菌（Cupriavidus sp.）YNS-85，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2015年04月24日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10740。
2. 权利要求1所述的贪铜菌YNS-85的培养基，其特征在于按比例每升培养基含有：KH2PO4 0.5 g， Na2HPO4·12H2O 1.2 g，NH4NO3 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，FeSO4 0.05 g，酵母粉2 g，微量元素溶液10 mL，有机氮农药为40 mg，pH 6.8~7.2。
3. 根据权利要求2所述的贪铜菌YNS-85的培养基，其特征在于：所述有机氮农药为五氯硝基苯。
4.根据权利要求2所述的贪铜菌YNS-85的培养基，其特征在于：微量元素每升含有50 mg Ca(OH)2，30 mg H3BO3，10 mg ZnSO4·7H2O，5 mg MnSO4·H2O， 5 mg CuSO4·5H2O，5 mg Na2MoO4·2H2O。
5.权利要求1所述贪铜菌YNS-85在五氯硝基污染土壤修复中的应用。
6.五氯硝基污染土壤修复剂，其特征在于有效成分为权利要求1所述的贪铜菌（Cupriavidus sp.）YNS-85。
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