CN104109628B - 基于激光加热的液滴式pcr反应器 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于激光加热的液滴式PCR反应器，包括反应芯片主体，反应芯片主体内开设有PCR反应液通道和载流剪切通道，该载流剪切通道的一端与反应芯片主体外相通，另一端分为两支，分别从PCR反应液通道相对的两侧相汇，PCR反应液通道的一端与反应芯片主体内开设的反应空腔相通，在反应空腔的底部水平开设有流动微槽，在流动微槽中部开设有凹坑，反应芯片主体内还开设有外载流通道，该外载流通道与反应空腔内部相通，反应芯片主体顶部设置有激光发射器。本发明通过凹坑来固定液滴，并通过载流来带动液滴运动，同时采用激光作为控温的热源，其温控特性优越，可以提高PCR反应的效率和速率，同时还具有表面抑制效应小、反应速度快等特点。

Description

基于激光加热的液滴式PCR反应器

技术领域

本发明涉及一种生化反应器，特别是涉及一种基于激光加热的液滴式PCR反应器。

背景技术

近年来，微电子机械系统、生命科学和分析科学等学科相交叉所产生的新兴学科——生物微电子机械系统又称微流控芯片、芯片实验室或微全分析系统发展迅速，其市场空间巨大，可广泛应用于生命科学、医学、化学、新药开发、食品和环境卫生监督等领域。微流控芯片是把一个传统的分析实验室功能微缩到一个小芯片上构建成化学或生物实验室，与传统分析方法相比，微流控芯片具有响应速度快、样品和试剂消耗量少、系统外部连接少、污染少、实行一次性使用、可以实时、原位、连续检测、并可在微环境下工作，可实现批量制造、降低成本等优点。因此，微流控芯片技术已引起人们的广发关注，成为了生物医学、化学分析等领域的研究热点。

聚合酶链式反应芯片主体，又称PCR芯片是微流控芯片重要应用之一，其实质就是利用聚合酶链式反应，在体外用一对与待扩增DNA片断两侧序列互补的引物诱发酶促聚合反应合成特异性的DNA片断，将待扩增DNA片段先经过高温变性,然后在低温引物退火,再在中温进行延伸，如此反复循环进行,一般需20-40次，使特异性DNA数量获得指数规律的倍增,便于进一步对DNA分子进行分析、检测。传统的PCR扩增仪,每次能批量处理48或96个样品,单个样品体积典型值为0.2ml。由于温度参数的大惯性、大滞后特点,这类仪器存在着升降温速率低(一般为1℃/s)、所需时间长、温度测控精度低、均匀性差和各个循环周期之间的重复性差等不足,无法满足现代生物化学研究需求。PCR芯片则解决了上述问题，不仅可以实现快速加热、控制热传递以及温度测量等部件集成到一块芯片上，还可以进行精确的温度控制，充分体现了微流控芯片高效、快速、试剂用量少、节约药品等优点，相比传统的PCR扩增仪，PCR芯片还便于携带，更有利于实施现场检测。

PCR芯片主要可以分为两种，一种是静态微槽式PCR芯片，一种是连续流动式PCR芯片。静态微槽式PCR芯片就是将反应混合物固定在加工好的微反应室里，通过外部或内部控制加热器来实现快速的升温和降温，完成一轮PCR的三个温度循环。静态PCR芯片不需要很长的流体通路，因而便于实现平行反应及分析系统，此外，由于PCR在固定空间完成，反应组份接触的总体通道长度很短，因而表面抑制效应相对较小，静态PCR芯片的不足之处在于这个反应器要经历温度的变化，较大的热容不利于温度的迅速响应。流动式PCR芯片中反应组份在通道中连续流动，流经不同温区过程中完成变性、退火和延伸。流动式PCR芯片避免了这个反应器的反复温度变化，反应体系的温度变化非常快，因而有利于快速反应和分析，流动式PCR芯片的主要缺点是较长流动通道造成的严重表面抑制效应。此外，流动式PCR中循环次数一般不能灵活控制，装置尺寸较大，而且不利于实现平行分析。

因此本领域技术人员致力于开发一种热容较小、表面抑制效应小的高效快速PCR反应芯片主体。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种热容较小、表面抑制效应小且高效快速的PCR反应芯片主体。

为实现上述目的，本发明提供了一种基于激光加热的液滴式PCR反应器，其特征是：包括透明的反应芯片主体(1)，所述反应芯片主体(1)内开设有PCR反应液通道(2)和载流剪切通道(3)，该载流剪切通道(3)的一端与反应芯片主体(1)外相通，另一端分为两支，两个分支分别从PCR反应液通道(2)相对的两侧相汇，在此处形成剪切点(2a)，所述PCR反应液通道(2)的一端与反应芯片主体(1)外界相通，另一端与反应芯片主体(1)内开设的反应空腔(6)相通，在反应空腔(6)的底部水平开设有扁长型的流动微槽(7)，所述流动微槽(7)的一端与PCR反应液通道(2)相连，在流动微槽(7)上或流动微槽(7)正上方开设有宽度局部变大的凹坑(8)，该流动微槽(7)的另一端延伸至反应空腔(6)外并与反应芯片主体(1)外相通，所述反应芯片主体(1)内还开设有外载流通道(9)，该外载流通道(9)一端直接与反应空腔(6)内部相通，另一端与反应芯片主体(1)外相通，所述反应芯片主体(1)顶部设置有激光发射器(10)，该激光发射器(10)的发射孔朝下布置，且该激光发射器(10)位于凹坑(8)的正上方。

使用上述结构的液滴式PCR反应器，在对PCR反应液进行处理时，由PCR反应液通道的一端注入PCR反应液，该PCR反应液内包含有待扩增DNA片段，使PCR反应液进入PCR反应液通道，同时在载流剪切通道和外载流通道内均注入外载流液，载流剪切通道处流来的外载流液和PCR反应液在剪切点出相汇，此时PCR反应液在从载流剪切通道处流来的外载流液的挤压剪切作用下形成一滴一滴的PCR反应液滴，PCR反应液滴在外载流液的作用下进入反应空腔并沿着流动微槽运动。由于流动微槽的高度小于PCR反应液滴的直径，使得PCR反应液在流动微槽两侧呈现“薄饼”状，而在流动微槽的上方会在有突出，呈现“山丘”状，“山丘”状表面积比“薄饼”状小，所以需要足够大的额外力做功才能使得PCR反应液偏离微槽，所以PCR反应液会在外载流液作用下沿着流动微槽运动。从外载流通道注入的外载流液充满整个反应空腔，因此在PCR反应液与壁面之间会形成油膜，大大降低了PCR反应液在流动微槽内流动的表面抑制效应。当PCR反应液在外载流液的作用下流动到凹坑时，PCR反应液表面积会进一步减小，所以当外载流液的速度不是大时，PCR反应液便不能脱离该位置，因此PCR反应液便被固定在凹坑位置。当外载流液流速增加时，PCR反应液又可以被外载流液带走，或者有下一个PCR反应液到达该PCR反应液的前端，该液滴也可能被带走，但当前PCR反应液完成反应前，停止向载流剪切通道注入外载流液并停止向PCR反应液通道注入PCR反应液。凹坑处固定住PCR反应液滴，并且由于外载流液的剪切作用，会在PCR反应液滴内部形成对流涡，这样非常有利于液滴的内部传热传质，这样有利于PCR反应的高效快速进行。采用激光作为热源，可以实现对液滴直接加热，热容小，温度响应快。PCR反应液滴流到凹坑处被固定时，在激光发射器的加热下进行PCR反应，并且采用激光作为PCR反应热源，可以直接加热反应的PCR反应液滴，而不加热其他地方，这样热容比较小，温度响应快，并且激光可以对PCR反应液滴进行整体加热，使得PCR反应液滴温度比较均匀，并且通过调节激光功率可以很好的调控液滴的温升，这样可以精确的控制PCR反应液滴的温度，使得PCR反应液滴在高温变性--低温引物退火-中温延伸这样一个反应循环所需要的时间为不足80s，这样完成40个循环所需要的时间也不足1个小时，比现有的其他方法节省一半时间以上。当一滴PCR反应液滴在凹坑处完成了PCR反应时，可以通过增加外载流通道处进来的外载流液流量，使得PCR反应液滴脱离凹坑，从流动微槽的另一端流出PCR反应芯片主体，从而进行后续的检测。

为了更好的调整PCR反应液和外载流液的流量，所述PCR反应液通道(2)、载流剪切通道(3)和外载流通道(9)均与反应芯片主体(1)外壁上设置的微量注射器(11)相通，通过微量注射器来控制PCR反应液和外载流液的流量。

本发明的有益效果是：本发明通过凹坑来固定液滴，并通过载流来带动液滴运动，同时采用激光作为控温的热源，其温控特性优越，可以提高PCR反应的效率和速率，同时还具有表面抑制效应小、反应速度快等特点。

附图说明

图1是本发明一的结构示意图。

图2是图1的A-A视图。

图3是PCR反应液温升与激光功率的关系图。

图4是PCR反应液温升与反应时间的关系图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

如图1和图2所示，包括反应芯片主体1、PCR反应液通道2、载流剪切通道3、反应空腔6、流动微槽7、凹坑8、外载流通道9、激光发射器10和微量注射器等部件，所述反应芯片主体1为透明材质制成，在反应芯片主体1内水平开设有PCR反应液通道2和载流剪切通道3，所述PCR反应液通道2和载流剪切通道3在同一水平面上，该PCR反应液通道2的一端通过第一载流通道12与反应芯片主体1外的微量注射器11相通，该第一载流通道12竖向开设在PCR反应液通道2这一端的上方，PCR反应液通道2的另一端与反应芯片主体1内开设的反应空腔6相通，所述载流剪切通道3的一端通过第二载流通道13与反应芯片主体1外的微量注射器11相通，该第二载流通道13竖向开设在载流剪切通道3一端的上方，载流剪切通道3的另一端分为两支，两个分支分别从PCR反应液通道2相对的两侧相汇，在此处形成剪切点2a。所述反应空腔6的底部水平开设有扁长型的流动微槽7，所述流动微槽7的一端与PCR反应液通道2相连，该流动微槽7的底面与PCR反应液通道2的底面在同一曲面上，该流动微槽7的高度比其直径小，在流动微槽7中开设有一个或若干个凹坑8，凹坑也可以开设在微槽7对面的腔体壁面上，在本实施例中优选为开设在流动微槽7中，该流动微槽7的另一端延伸至反应空腔6外并通过泄流通道15与反应芯片主体1外相通，该泄流通道15设置在流动微槽7这一端的下方，所述反应芯片主体1内还开设有外载流通道9，该外载流通道9一端直接与反应空腔6内部相通，另一端通过第三载流通道15与反应芯片主体1外设置的微量注射器11相通，该第三载流通道15设置在外载流通道9这一端的上方。所述反应芯片主体1顶部设置有激光发射器10，该激光发射器10朝下布置，且该激光发射器10位于凹坑8的正上方。

如图3所示，反应了PCR反应液温升与激光功率的关系，表明采用激光作为PCR热源，PCR反应液的温度响应极快。根据时间常数和温度与激光功率与温升的关系，绘制了PCR反应液温度循环图，如图4所示，在激光功率为8.1mW时为高温变性阶段，然后降低激光功率至3.8mW，此时为低温引物退火阶段，再提升激光功率至5.6mW，此时为中温延伸阶段，中温延伸阶段完毕后这一个反应循环所需要的时间为不足90s，这样完成40个循环所需要的时间也仅需1个小时，比现有的其他方法节省一半时间以上。当PCR液滴完成完整的PCR过程，本发明可以通过增大载流流速，使得液滴被载流带走。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，比如改变PCR反应液通道2、载流剪切通道3、流动微槽7和外载流通道9的连接方式，或是改变凹坑与激光发射器的数量及布置方式等皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (2)

1.一种基于激光加热的液滴式PCR反应器，其特征是：包括透明的反应芯片主体(1)，所述反应芯片主体(1)内开设有PCR反应液通道(2)和载流剪切通道(3)，该载流剪切通道(3)的一端与反应芯片主体(1)外相通，另一端分为两支，两个分支分别从PCR反应液通道(2)相对的两侧相汇，在此处形成剪切点(2a)，所述PCR反应液通道(2)的一端与反应芯片主体(1)外界相通，另一端与反应芯片主体(1)内开设的反应空腔(6)相通，在反应空腔(6)的底部水平开设有扁长型的流动微槽(7)，所述流动微槽(7)的一端与PCR反应液通道(2)相连，在流动微槽(7)上或流动微槽(7)正上方开设有宽度局部变大的凹坑(8)，该流动微槽(7)的另一端延伸至反应空腔(6)外并与反应芯片主体(1)外相通，所述反应芯片主体(1)内还开设有外载流通道(9)，该外载流通道(9)一端直接与反应空腔(6)内部相通，另一端与反应芯片主体(1)外相通，所述反应芯片主体(1)顶部设置有激光发射器(10)，该激光发射器(10)的发射孔朝下布置，且该激光发射器(10)位于凹坑(8)的正上方。

2.如权利要求1所述的基于激光加热的液滴式PCR反应器，其特征是：所述PCR反应液通道(2)、载流剪切通道(3)和外载流通道(9)均与反应芯片主体(1)外壁上设置的微量注射器(11)相通。