CN104107439A - 一种中药刺激性评价的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种中药刺激性评价的检测方法，该方法是将中药原液或提取液，皮下注射到实验动物的足趾，以动物的提足次数反应药物刺激所导致的疼痛，以肿胀度反应药物刺激所引导的炎症，结合疼痛和炎症，综合评价药物的刺激性。经过对蟾酥、斑蝥、华蟾素注射液、得力生注射液等2种生药和2种注射液的检验，表明该方法可有效地评价药物刺激性的强弱。方法具有灵敏、直观、简便、快捷的优势，可广泛用于各种中药刺激性的评价和检验。

Description

一种中药刺激性评价的检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体设计一种广泛适用于中药刺激性评价的检测方法。

背景技术

中药作为有效防治疾病的手段，其对疾病的治疗理念顺应了二十一世纪医药学发展的新趋势，展示出了强大的生命力和广阔的发展前景。中药在当前中西医院临床中的使用也在明显增加，特别是中药在西医院临床创新药物中的排名已大大提高。中药的销售额近年来不断加大，如文山市的三七，年销售额近50亿。

但是中药在临床使用时经常有不良反应发生，具有安全隐患。不良反应类型多样，最常发生的是药物刺激性。例如，华蟾素注射液具有抗肿瘤的作用，但是对血管有刺激性；六神丸成分较多，对机体产生一定的刺激性。溶血反应也是药物刺激性反应的一种表现形式，例如鱼腥草注射液中吐温-80超标容易引起溶血。此外，还涉及心血管系统、消化系统、神经系统、泌尿系统、感觉器官、皮肤及其附件等多个系统的不良反应。一定程度上限制了中药的用药安全和新药开发。

对于中药刺激性，有效的检验和检测方法至关重要。近年来关于刺激性评价的动物模型研究较多，一般为局部刺激实验，如兔眼刺激试验等。但是这些模型缺乏明显直观且可定量化的疼痛与炎症指标，需要发展新的药物刺激性评价方法。本发明利用药物刺激大鼠足趾模型，以提足次数(疼痛)和肿胀度(炎症)两个指标来评价药物的刺激性，建立一种直观、简单和实用的中药刺激性评价方法。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术不能有效检测中药刺激性的不足，提供一种具有普适性，且直观、方便、快捷的中药刺激性评价方法。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种中药刺激性评价的检测方法，将药物原液或将药物原液浓缩富集后，皮下注入实验动物足趾，计算提足次数，测量足趾肿胀度和记录注射药液前后的足趾体积来评价中药刺激性。

作为优选方案，以上所述的中药刺激性评价的检测方法，药物原液浓缩富集的方法包括超滤浓缩、干燥浓缩、离心浓缩。

作为优选方案，以上所述的中药刺激性评价的检测方法，药物原液浓缩富集的倍数为1-100倍。更加优选将药物原液浓缩富集10倍。

作为优选方案，以上所述的中药刺激性评价的检测方法，药物原液的浓度为0.1-1000mg/ml。特别优选的药物原液的浓度为20mg/ml。

作为优选方案，以上所述的中药刺激性评价的检测方法，实验动物优选大鼠，注入体积为0.01-2ml，更加优选的注入体积为0.1ml。

作为优选方案，以上所述的中药刺激性评价的检测方法，皮下注入药物后，记录提足反应的产生时间，并计数产生提足后5min-8h的提足次数，更加优并首次提足后10min-30min内的提足次数。

作为优选方案，以上所述的中药刺激性评价的检测方法，所述的药物原液为中药、中成药或中药注射液的原液。当然本发明也可以用于西药的刺激性评价。

作为优选方案，以上所述的中药刺激性评价的检测方法，所述的足趾肿胀胀度可用足趾肿胀仪来检测。

中药制剂在生产和存放过程中可能产生微量的刺激性物质，研究需要高浓度的刺激性物质。超滤、冷冻、离心等方法可以达到浓缩药物的作用，而超滤是一种有效排除小分子干扰的技术，而且3KD的超滤管可截留并富集到高浓度刺激物；冷冻干燥是一种把低浓度水提液干燥至粉末的技术，可由粉末配制成高浓度刺激物；离心浓缩是一种挥去提取液，直接浓缩药液的技术。这些浓缩方法具有损耗小、效率高、操作便捷的优点，使药物刺激性更加明显，可增加刺激性检测方法的灵敏性。

有益效果：本发明提供的中药刺激性评价的检测方法和现有技术相比具有以下优点：

传统的药物刺激性评价模型为家兔眼球刺激法，该方法主观定性观测药物的刺激性，无法客观的定量评价药物因此的疼痛和炎症反应。为了实现上述目的，本发明创新性采用了药物刺激大鼠足趾模型，皮下注射药物后，大鼠出现提足反应，并且足趾出现明显的红肿现象。以计数提足次数反应药物刺激的疼痛，以药物注射前后足部体积的变化反应药物诱导的炎症，并总体评估药物的刺激性，建立一种直观、准确和广泛的中药刺激性评价方法。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1 蟾酥生药的刺激性检测

一、方法

1、蟾酥生药的提取和配制

称取蟾酥生药粉末0.3492g置于玻璃试管中，加8ml0.5％DMSO超纯水超声提取两次，20min/次，过滤，合并滤液。将滤液冷冻干燥至粉末状态，重0.1211g，即得率为34.68％。取冷冻干燥后的粉末0.0419g，溶于0.419ml0.5％DMSO的水中，即得浓度为100mg/ml的母液，过滤，分别配成浓度为10mg/ml、20mg/ml、50mg/ml的溶液即可。

2、大鼠足部刺激性试验

选取雄性SD大鼠40只，随机分成4组，即正常组(生理盐水)、给药组(10mg/ml、20mg/ml、50mg/ml)，每组10只。

在各组大鼠右后肢踝关节处作一标记，用排水法测量其右后爪体积。给大鼠右后足足垫处注射以上四组不同的药物，每只大鼠注射0.1ml，观察大鼠的提足反应，记录大鼠开始提足后10min内的提足次数，测定药物注射30min后大鼠右后足的体积，并计算大鼠右后足实验前后的体积差，即肿胀度。

肿胀度＝注射药物后足趾体积—注射药物前足趾体积

二、结果

配制不同浓度蟾酥生药水提液，采用上述建立的大鼠足部刺激性检测方法检测。

结果表明，与生理盐水组相比，不同浓度蟾酥水提液(10mg/ml、20mg/ml、50mg/ml)10min内提足次数显著增加，分别从不提足增加至(14±5、41±9、99±8)次/10min(P＜0.01)，表明大鼠足部疼痛。

并且蟾酥不同浓度给药组30min后肿胀度也显著增加，从生理盐水组(0.071±0.009)ml分别增加至(0.702±0.093、0.788±0.096、1.027±0.11)ml(P＜0.01)，表明大鼠足部出现炎症现象。

综合提足次数(疼痛)和肿胀度(炎症)两个指标，反应了蟾酥生药具有较明显的刺激性。

表1 不同浓度蟾酥水提液对大鼠刺激性的影响

组别	浓度(mg/ml)	提足次数(次/10min)	肿胀度(ml)
				正常组		0	0.071±0.009
蟾酥	10	14±5**	0.702±0.093**
					20	41±9**	0.788±0.096**
	50	99±8**	1.027±0.11**

x±s，n＝10。**P<0.01，与正常对照组比较。

实施例2 斑蝥的刺激性检测

一、方法

1、斑蝥生药提供

斑蝥生药浓度为0.03g/ml，北京正邦制药有限公司提供。

2、大鼠足部刺激性试验

雄性SD大鼠20只，随机分成2组，即正常组(生理盐水)、给药组(0.03g/ml)，每组10只。

在各组大鼠右后肢踝关节处作一标记，用排水法测量其右后爪体积。给大鼠右后足足垫处注射以上两组不同的药物，每只大鼠注射0.1ml，观察大鼠的提足反应，记录大鼠30min内的提足次数，测定药物注射30min后大鼠右后足的体积，并计算大鼠右后足实验前后的体积差，即肿胀度。

肿胀度＝注射药物后足趾体积—注射药物前足趾体积

二、结果

配制浓度为0.03g/ml的斑蝥生药，采用上述建立的大鼠足部刺激性检测方法检测。

结果表明，与生理盐水组相比，斑蝥生药(0.03g/ml)30min内提足次数显著增加，从不提足增加至(256±152)次/30min(P＜0.01)，表明大鼠足部疼痛。

斑蝥给药组30min后肿胀度也显著增加，从生理盐水组(0.071±0.009)ml增加至(0.176±0.051)ml(P＜0.01)，表明大鼠足部出现炎症现象。

综合提足次数(疼痛)和肿胀度(炎症)两个指标，反应了斑蝥生药具有较明显的刺激性。

表2 斑蝥生药(0.03g/ml)对大鼠刺激性的影响

组别	提足次数/30min	肿胀度(ml)
			生理盐水组	0	0.071±0.009
斑蝥0.03g/ml组	256±152**	0.176±0.051**

x±s，n＝10。**P<0.01，与正常对照组比较。

实施例3华蟾素注射液的刺激性检测

一、方法

1、中药注射液刺激性部位收集

取华蟾素注射液20ml，加入3KD超滤管，3500转离心40min，经反复超滤，获得10倍浓缩富集的大分子和超滤下层液，4度保存。

取华蟾素注射液5ml，稀释1倍，4度保存。

2、大鼠足部刺激性试验

雄性SD大鼠50只，随机分成5组，即正常组(生理盐水)、给药组(华蟾素注射液原液、华蟾素注射液0.5倍浓缩液、10倍浓缩液、10倍浓缩液下层)，每组10只。

在各组大鼠右后肢踝关节处作一标记，用排水法测量其右后爪体积。给大鼠右后足足垫处注射以上五组不同的药物，每只大鼠注射0.1ml，观察大鼠的提足反应，记录大鼠开始提足后10min内的提足次数，测定药物注射30min后大鼠右后足的体积，并计算大鼠右后足实验前后的体积差，即肿胀度。

肿胀度＝注射药物后足趾体积—注射药物前足趾体积

二、结果

配制不同浓度华蟾素注射液，采用上述建立的大鼠足部刺激性检测方法检测。

结果表明，与生理盐水组相比，不同浓度华蟾素注射液(原液、0.5倍浓缩液、10倍浓缩液、10倍浓缩液下层)10min内提足次数显著增加，从不提足分别增加至(79±13、43±13、83±22、30±15)次/10min(P＜0.01)，表明大鼠足部疼痛。

不同浓度华蟾素注射液给药组30min后肿胀度也显著增加，从生理盐水组(0.071±0.009)ml分别增加至(0.564±0.051、0.267±0.054、0.524±0.058、0.400±0.031)ml(P＜0.01)，表明大鼠足部出现炎症现象。

综合提足次数(疼痛)和肿胀度(炎症)两个指标，反应了华蟾素注射液具有较明显的刺激性。

表3 不同浓度华蟾素注射液对大鼠刺激性的影响

组别	提足次数(次/10min)	肿胀度(ml)
			生理盐水组	0	0.071±0.009
华蟾素注射液原液	79±13**	0.564±0.051**
			0.5倍浓缩	43±13**	0.267±0.054**
10倍浓缩液	83±22**	0.524±0.058**
			10倍浓缩液下层液	30±15**	0.400±0.031**

x±s，n＝10。**P<0.01，与正常对照组比较。

实施例4得力生注射液的刺激性检测

一、方法

1、得力生注射液配制

将得力生注射液旋转蒸发浓缩成原液的15倍。

2、大鼠足部刺激性试验

雄性SD大鼠20只，随机分成2组，即正常组(生理盐水)、给药组(15倍浓缩液)，每组5只。

在各组大鼠右后肢踝关节处作一标记，用排水法测量其右后爪体积。给大鼠右后足足垫处注射以上两组不同的药物，每只大鼠注射0.1ml，观察大鼠的提足反应，记录大鼠30min内的提足次数，测定药物注射30min后大鼠右后足的体积，并计算大鼠右后足实验前后的体积差，即肿胀度。

肿胀度＝注射药物后足趾体积—注射药物前足趾体积

二、结果

配制得力生注射液15倍浓缩液，采用上述建立的大鼠足部刺激性检测方法检测。

结果表明，与生理盐水组相比，得力生注射液15倍浓缩液组30min内提足次数显著增加，从不提足增加至(435±123)次/30min(P＜0.01)，表明大鼠足部疼痛。

给药组30min后肿胀度也显著增加，从生理盐水组(0.071±0.009)ml增加至(0.458±0.023)ml(P＜0.01)，表明大鼠足部出现炎症现象。

综合提足次数(疼痛)和肿胀度(炎症)两个指标，反应了得力生注射液具有明显的刺激性。

表4 得力生注射液对大鼠刺激性的影响

组别	提足次数/30min	肿胀度(ml)
			生理盐水组	0	0.071±0.009
15倍浓缩液组	435±123**	0.458±0.023**

x±s，n＝10。**P<0.01，与正常对照组比较。

通过以上实验结果表明，本发明提供的中药刺激性评价方法，以提足次数(疼痛)和肿胀度(炎症)两个指标来客观评价药物的刺激性，是一种直观、简单和实用的中药刺激性评价方法，和现有技术的刺激性评价方法，更加科学，客观，准确。

Claims (9)

1.一种中药刺激性评价的检测方法，其特征在于，将药物原液或将药物原液浓缩富集后，

皮下注入实验动物足趾，计算提足次数和测量足趾肿胀度来评价中药刺激性。

2.根据权利要求1所述的中药刺激性评价的检测方法，其特征在于，药物原液浓缩富集的方法包括超滤浓缩、干燥浓缩或离心浓缩。

3.根据权利要求1所述的中药刺激性评价的检测方法，其特征在于，药物原液浓缩富集的倍数为0.01-100倍。

4.根据权利要求3所述的中药刺激性评价的检测方法，其特征在于，药物原液浓缩富集的倍数为10倍。

5.根据权利要求1所述的中药刺激性评价的检测方法，其特征在于，药物原液的浓度为0.01-1000mg/ml。

6.根据权利要求5所述的中药刺激性评价的检测方法，其特征在于，药物原液的浓度为20mg/ml。

7.根据权利要求1至6任一项所述的中药刺激性评价的检测方法，其特征在于，实验动物为大鼠，药物注入体积为0.01-2ml。

8.根据权利要求7所述的中药刺激性评价的检测方法，其特征在于，皮下注入药物后，记录提足反应的产生时间，并计数首次提足后10min-30min内的提足次数。

9.根据权利要求8所述的中药刺激性评价的检测方法，其特征在于，所述的药物原液为中药、中成药或中药注射液的原液。