CN104095144A - 快速建立金黄地鼠动脉粥样硬化模型的制作技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速、简单且成本低廉的动脉粥样硬化模型快速制作技术方法。以独特配方的高脂饲料喂养叙利亚金黄地鼠5个月内制作动脉粥样硬化模型，该造模时间比国际上关于此种属形成动脉粥样硬化斑块的时间缩短了5个月。利用本技术方案可相对快速建立动脉粥样硬化模型的血脂动态图、超声影像学特征和血管病理动脉硬化模型特征，有利于缩短动脉粥样硬化实验模型和创新药物临床前评价的研究进程和提供该模型制作技术的参考标准。
Description
技术领域
本发明公开了一种快速、简单且成本低廉的动脉粥样硬化模型快速制作技术方法，属于医药技术领域。
背景技术
目前用于建立动脉粥样硬化模型的动物有小型猪、兔、豚鼠、大鼠、小鼠等，但它们有各自的不足之处，寻找更多的动物模型有利于完善动脉粥样硬化的多方面研究。地鼠具有对脂质损害的高敏感性，早在十九世纪八十年代地鼠就已用于脂代谢领域的研究，地鼠动脉粥样硬化模型和其他动物模型相比较，具有如下方面优点：（1）低成本，体型小，易于繁殖饲养；（2）初步证实与人类动脉粥样硬化发病病理进程相似；（3）内源性胆固醇合成低并且具有胆固醇脂转移蛋白活性（4）受体介导的低密度脂蛋白摄取低；（5）与人类一样肝脏只分泌全长链载脂蛋白B而小肠能分泌ApoB-48；（6）对高脂高胆固醇摄入反应性上血浆脂参数会随着饮食脂含量升高而升高。
研究显示，地鼠在给予含3%胆固醇和15%油脂的饲料喂养第10个月时能形成动脉粥样硬化斑块，但是由于受到地鼠寿命等因素限制，该模型耗时过长，成本偏高，实用性较差。
发明内容
本发明要解决的技术问题是采用独特的高脂饲料喂饲方法，能在5个月内建立叙利亚金黄地鼠动脉粥样硬化模型。
为解决本发明的技术问题，本发明采用如下的技术方案：
本发明第一方面提供了的金黄地鼠动脉粥样硬化模型制作的饲料配方。每公斤饲料中含有如下的物质，重量以克计：
本发明第二方面提供了用本发明的饲料喂养金黄地鼠后短期内建立自发型动脉粥样硬化模型的方法。
本发明第三方面提供了以模型的血脂水平的动态变化特征、血管病理特征和超声影像学特征的评价分析地鼠动脉粥样硬化模型的方法体系。
有益技术效果
快速：现有技术中制作金黄地鼠动脉粥样硬化模型耗时10个月，本发明的方法只需要5个月，有利于缩短动脉粥样硬化实验模型和创新药物临床前评价的研究进程。
简单：只需要用本发明的饲料喂养地鼠，需要要额外的措施。
成本低廉：现有技术中金黄地鼠动脉粥样硬化模型耗时10个月，本发明只需要5个月，动物饲养成本比现有技术减少一半。
本发明提供的以模型的血脂水平的动态变化特征、血管病理特征和超声影像学特征的地鼠动脉粥样硬化模型的评价分析方法体系，提供该模型制作技术的参考标准。
附图说明
图1叙利亚金黄地鼠给与特制高脂饲料喂养5个月时主动脉弓及胸主动脉图。
图2：血清脂水平2-A：总胆固醇（TC），2-B：总甘油三酯（TG），2-C：高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），2-D：低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。
图3.正常组地鼠和高脂诱导5个月时动脉粥样硬化模型组的主动脉弓部HE染色图。
图4.正常组地鼠和高脂诱导5个月时动脉粥样硬化模型组的主动脉弓部超声影像图
具体实施方式
实施例1：高脂饲料喂养叙利亚金黄地鼠动脉粥样硬化模型的建立。
材料
[动物]叙利亚金黄地鼠（专业名称：Vr:LVG(SYR)）
[饲料]饲料配方见下表
表1：动物模型饲料配方表
1参考于Open research diets，D1245和D12450B.
2S10001,mineral mix for AIN-76rodent diet(17).
3V10001,vitamin mix for AIN-76A rodent diet(17).
方法
[动物的饲养]
叙利亚金黄地鼠(LVG hamster,源引进于Charles River Laboratories)适应性喂养一周后，按体重随机分为正常组、模型组，并在合适环境（饲养温度21±2℃，相对湿度30-70%，光照周期14/10小时)下饲养，4只/笼，正常组给予正常组饲料，动脉粥样硬化模型组给予高脂饲料（见上表），每三天记录体重，每三周内眦取血，血样静置30min至自然凝固后6000g/min转速离心，获得上层血清，置于-80℃。高脂饲料喂养5个月时，3%异戊巴比妥钠麻醉，0.2ml/100g体重，用5ml真空采血管腹主动脉内取血，分离主动脉弓、胸主动脉及腹主动脉。血样按上述方式处理后用于后续研究。
结果见图1.
结论
叙利亚金黄地鼠给以该配方的饲料喂养5个月时，在主动脉弓部及胸主动脉内已大量形成肉眼可见的动脉粥样硬化斑块。
实施例2：叙利亚金黄地鼠动脉粥样硬化模型形成的血脂动态图
材料
[动物]叙利亚金黄地鼠（专业名称：Vr:LVG(SYR)）
[饲料]饲料配方见表1
[主要试剂]总胆固醇测定试剂盒（干粉带缓冲液）（中生北控生物试剂公司）
总甘油三脂试剂盒（中生北控生物试剂公司）
直接高密度胆固醇测定试剂盒（中生北控生物试剂公司）
直接低密度胆固醇测定试剂盒（中生北控生物试剂公司）
[主要仪器]SectraMaxTM190酶标仪
方法
[动物的饲养]
叙利亚金黄地鼠(LVG hamster,源引进于Charles River Laboratories)适应性喂养一周后，按体重随机分为正常组、模型组，并在合适环境（饲养温度21±2℃，相对湿度30-70%，光照周期14/10小时)下饲养，4只/笼，正常组给予正常组饲料，动脉粥样硬化模型组给予高脂饲料（表1），每三天记录体重，每三周内眦取血，血样静置30min至自然凝固后6000g/min转速离心，获得上层血清，利用总胆固醇测定试剂盒（干粉带缓冲液）、总甘油三脂试剂盒、直接高密度胆固醇测定试剂盒、直接低密度胆固醇测定试剂盒分别测定血清总胆固醇、总甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平。
结果见图2。
叙利亚金黄地鼠给以特制高脂饲料喂养5个月内的血脂水平动态监测显示，血清总胆固醇（TC）、总甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平在三周内突增，第三周时均达到峰值，随后开始有所下降，至20周内TC稳定在20-25mmol/L水平；TG水平由三周时缓慢下降，但20周内均在10mmol/L以上；HDL-C水平在14周前相对平稳地波动，14周后有向正常水平回归趋势；LDL-C动态水平与HDL-C类似，但16周时才开始向正水平回归。
结论
叙利亚金黄地鼠给以特制高脂饲料喂养3周内TC、TG、HDL-C和LDL-C达到峰值，之后TC和TG水平趋于平稳，HDL-C和LDL-C有缓慢回归趋势。
实施例3：叙利亚金黄地鼠动脉粥样硬化模型的主动脉弓部HE染色分析
材料
[动物]叙利亚金黄地鼠（专业名称：Vr:LVG(SYR)）
[饲料]饲料配方见表1
[主要仪器]正置显微镜Eclipse80i（日本Nikon公司）
[试剂配制]
A：0.5-1%的伊红酒精溶液：称取伊红Y0.5-1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%无水乙醇100毫升溶解。
B：苏木素染液配方（配制1000ml，按需求量调整）：2g苏木精，33ml无水乙醇，50g硫酸铝钾，667ml蒸馏水，0.4g碘酸钠，40ml冰醋酸，300ml甘油
配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。
C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。
方法
[动物的饲养]
叙利亚金黄地鼠(LVG hamster,源引进于Charles River Laboratories)适应性喂养一周后，按体重随机分为正常组、模型组，并在合适环境（饲养温度21±2℃，相对湿度30-70%，光照周期14/10小时)下饲养，4只/笼，正常组给予正常组饲料，动脉粥样硬化模型组给予高脂饲料（表1），每三天记录体重，每三周内眦取血，血样静置30min至自然凝固后6000g/min转速离心，获得上层血清，置-80℃用于后续相关研究。高脂饲料喂养5个月时，3%异戊巴比妥钠麻醉，0.2ml/100g体重，用5ml真空采血管腹主动脉内取血，分离主动脉弓、胸主动脉及腹主动脉，4%多聚甲醛固定。
[主动脉弓部的HE染色]
甲醛固定的主动脉弓部分离外周结缔组织后石蜡包埋
石蜡切片，5μm厚度
染色流程
（1）二甲苯（Ⅰ）15min，(2)二甲苯（Ⅱ）15min，(3)100%乙醇（Ⅰ）5min，(4)100%乙醇（Ⅱ）5min，(5)80%乙醇5min，(6)蒸馏水5min，(7)苏木精液染色5min，（8)流水稍洗去苏木精液1-3s，(9)1%盐酸乙醇1-3s，(10)稍水洗10-30s，(13)蒸馏水过1-2s，(14)0.5%伊红液染色1-3min，(15)蒸馏水稍洗1-2s，(16)80%乙醇稍洗1-2s，(17)95%乙醇（Ⅰ）2-3s，(18)95%乙醇（Ⅱ）3-5s，(19)无水乙醇5-10min，(20)石炭酸二甲苯5-10min，(21)二甲苯（Ⅰ）2min，(22)二甲苯（Ⅱ）2min，(23)二甲苯（Ⅲ）2min，(24)中性树胶封固。
结果见图3.
结论
叙利亚金黄地鼠用本配方饲料高脂诱导5个月时，其HE染色结果显示主动脉弓部内膜有大量脂质过载细胞、泡沫细胞浸润并向腔面形成突起，中膜血管平滑肌细胞散在地存在脂质沉积。
实施例4：叙利亚金黄地鼠动脉粥样硬化模型的主动脉弓部超声影像学特征
材料
[动物]叙利亚金黄地鼠（专业名称：Vr:LVG(SYR)）
[饲料]饲料配方见表1
[主要仪器]小动物高清晰超声影像仪Vevo770○R High-Resolution Imaging System
（加拿大VisualSonics公司）
方法
[动物的饲养]
叙利亚金黄地鼠(LVG hamster,源引进于Charles River Laboratories)适应性喂养一周后，按体重随机分为正常组、模型组，并在合适环境（饲养温度21±2℃，相对湿度30-70%，光照周期14/10小时)下饲养，4只/笼，正常组给予正常组饲料，动脉粥样硬化模型组给予高脂饲料（表1）。高脂诱导5个月时，异氟烷麻醉状态下进行超声影像学探测，分析该动脉粥样硬化模型主动脉弓部超声影像学特征。
[超声影像探测]
动物颈部和胸部去毛，异氟烷麻醉并仰卧，探头频率为30MHZ，将探头位置对准胸主动脉弓部位置并基本与升主动脉方向平行，约十二至一点钟方向，B模式观测，动态存取录像，再从中截取清晰的图片以供分析。
结果见图4和表2
表2高脂诱导5个月时模型组与正常组主动脉弓部内膜厚度
###，与正常组相比p<0.001
结论
正常组地鼠胸主动脉弓部内膜完整、平滑、较薄，动脉粥样硬化组内膜显著增厚且不连续，内膜侧有片层状向腔面的凸起。
Claims (2)
1.一种制作动脉粥样硬化模型的饲料，其特征在于，每公斤饲料中含有如下的物质，重量以克计：
。
2.一种制作动脉粥样硬化模型的方法，其特征在于，用权利要求1的饲料喂养金黄地鼠5个月以上。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310118057.7A CN104095144A (zh) | 2013-04-07 | 2013-04-07 | 快速建立金黄地鼠动脉粥样硬化模型的制作技术 |
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| CN201310118057.7A CN104095144A (zh) | 2013-04-07 | 2013-04-07 | 快速建立金黄地鼠动脉粥样硬化模型的制作技术 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104095144A true CN104095144A (zh) | 2014-10-15 |
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| CN201310118057.7A Pending CN104095144A (zh) | 2013-04-07 | 2013-04-07 | 快速建立金黄地鼠动脉粥样硬化模型的制作技术 |
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| CN (1) | CN104095144A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105028994A (zh) * | 2015-06-16 | 2015-11-11 | 北京华阜康生物科技股份有限公司 | 一种ApoE鼠配合饲料 |
-
2013
- 2013-04-07 CN CN201310118057.7A patent/CN104095144A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105028994A (zh) * | 2015-06-16 | 2015-11-11 | 北京华阜康生物科技股份有限公司 | 一种ApoE鼠配合饲料 |
| CN105028994B (zh) * | 2015-06-16 | 2018-11-09 | 北京华阜康生物科技股份有限公司 | 一种ApoE鼠配合饲料 |
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