CN104093828A - 细胞回收方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于，不使用新的洗涤用培养液、洗涤液，而能够提高细胞的回收效率。解决手段为一种细胞回收方法，其是使用细胞培养用试剂盒培养的细胞的回收方法，该试剂盒通过由导管至少连接用于培养细胞的培养容器、回收培养后的细胞的细胞回收容器、和回收培养后的培养基的废液容器而成，所述回收方法包括以下工序：上清液排出工序，将培养后的培养上清液从培养容器转移至废液容器；细胞回收工序，将浓缩的细胞悬浮液从培养容器转移至细胞回收容器；上清液返回工序，使排出到废液容器的培养上清液的一部分返回培养容器，使残留于培养容器的细胞分散于细胞悬浮液；以及再回收工序，将分散有残留细胞的细胞悬浮液从培养容器再次转移至细胞回收容器。
Description
技术领域
本发明涉及使用培养容器培养的细胞的回收方法，特别涉及用于提高细胞的回收效率的细胞回收方法。
背景技术
近年来，在医药品的生产、基因治疗、再生医疗、免疫疗法等领域中，要求在人工环境下高效地大量培养细胞和组织、微生物等。
对于这样的细胞的大量培养而言，一般使用培养容器培养细胞。在该使用培养容器的细胞培养中，需要在培养后从培养容器中回收细胞。
回收培养细胞(特别是浮游系细胞)时，以往实施的是从培养容器将细胞悬浮液全量回收，通过离心分离将细胞分离的方法。但是，在该方法中，在大量培养细胞而使细胞悬浮液大量存在的情况下，需要分成多次离心分离，存在浪费时间和工夫这样的问题点。
另一方面，作为与细胞回收方法相关联的技术，可以列举例如专利文献1中记载的细胞培养方法中采用的回收方法。该回收方法中，首先将使用后的培养基上清液从培养容器排出后，回收包含培养细胞的细胞悬浮液，由此可以获得浓缩的细胞悬浮液。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开2007/052716号小册子
发明内容
发明要解决的课题
但是，该方法中存在残留于培养容器内而不能回收的细胞产生较多、回收效率不能说充分这样的问题。
即，根据该回收方法，可以回收浓缩的细胞悬浮液，但即使回收细胞悬浮液，也存在以附着于培养容器内的壁面等的状态残留的细胞。另外，在培养容器由可挠性材料构成的情况下，若细胞悬浮液变为少量则培养容器内容易堵塞，较多量的细胞悬浮液残留于培养容器的结果是，还存在细胞在培养容器内残留这样的问题。
为了解决这样的问题，也考虑了在回收细胞悬浮液后，在培养容器中加入新的洗涤液(生理盐水、磷酸缓冲液)并搅拌，使培养容器内残留的细胞在洗涤液中悬浮，进行再次回收这样的方法。但是，像这样使用洗涤液回收培养容器内残留的细胞的方法中，需要新的洗涤液、用于保存该洗涤液的洗涤液保存容器，存在花费多余的成本这样的问题。
本发明鉴于上述问题而完成，目的在于提供在回收使用培养容器培养的细胞时，可以抑制培养容器的堵塞，不使用新的洗涤用的培养液、洗涤液，而提高细胞的回收效率的细胞回收方法。
用于解决课题的手段
为了达成上述目的，本发明的细胞回收方法是使用细胞培养用试剂盒培养的细胞的回收方法，该试剂盒通过由导管至少连接用于培养细胞的培养容器、回收培养后的细胞的细胞回收容器、和回收培养后的培养基的废液容器而成，所述回收方法的特征在于，包括以下工序：上清液排出工序，将培养后的培养上清液从培养容器转移至废液容器；细胞回收工序，将浓缩的细胞悬浮液从培养容器转移至细胞回收容器；上清液返回工序，使排出到废液容器的培养上清液的一部分返回培养容器，使残留于培养容器的细胞悬浮于细胞悬浮液；以及再回收工序，将悬浮有残留细胞的细胞悬浮液从培养容器再次转移至细胞回收容器。
另外，本发明的细胞回收方法是使用细胞培养用试剂盒培养的细胞的回收方法，该试剂盒通过由导管至少连接用于培养细胞的培养容器、回收培养后的细胞的细胞回收容器、和回收培养后的培养基的废液容器而成，所述回收方法包括以下工序：上清液排出工序，将培养后的培养上清液从培养容器转移至废液容器；缩小工序，使培养容器的底面积缩小，将浓缩的细胞悬浮液汇集到培养容器的细胞回收接口侧；以及缩小回收工序，将汇集的细胞悬浮液从培养容器转移至细胞回收容器。
发明效果
根据本发明，在回收使用培养容器培养的细胞时，可以抑制培养容器的堵塞，不使用新的洗涤用培养液、洗涤液，而提高细胞的回收效率。
附图说明
图1是表示在本发明的实施方式的细胞回收方法中使用的细胞培养用试剂盒的图。
图2是表示本发明的第一实施方式的细胞回收方法中的洗涤回收顺序的图。
图3是表示本发明的第二实施方式的细胞回收方法中的静置顺序的图。
图4是表示本发明的第三实施方式的细胞回收方法中的缩小回收顺序的图。
图5是表示利用本发明的实施方式的细胞回收方法的实验结果的图。
具体实施方式
以下，参照附图对本发明的细胞回收方法的优选实施方式进行说明。首先，参照图1对本实施方式的细胞回收方法中可以优选使用的细胞培养用试剂盒进行说明。该细胞培养用试剂盒中，具备培养容器10、培养基储藏容器20、细胞注入容器30、细胞回收容器40、取样容器50、及管60。另外，培养基储藏容器20也作为废液容器使用。
本实施方式的细胞回收方法是在使用这样的细胞培养用试剂盒进行细胞培养后从细胞培养用试剂盒中的培养容器10向细胞回收容器40中回收细胞时使用的方法。
另外，在本实施方式的细胞回收方法中使用的细胞培养用试剂盒不限于这样的构成，还可以使用例如除去取样容器50的构成、具备培养基储藏容器之外的废液容器的构成、具备多个培养基储藏容器20的构成等适宜变更的构成。
培养容器10是用于加入培养对象的细胞和培养液并大量培养细胞的容器。培养容器10以可挠性材料为材料，形成袋状(袋型)。
该培养容器10具备用于进行培养液、细胞的注入、回收等的接口。接口的数量没有特别限定，但优选使用1～3接口的培养容器。图1中示有1接口的细胞培养用试剂盒，可以通过该接口一面与其他容器保持封闭系统，一面进行培养液、细胞悬浮液等的转移。
另外，作为培养对象的细胞，可以优选使用浮游系细胞。作为培养液，可以使用一般的各种培养基。
培养基储藏容器20是为了将用于培养细胞的培养液(培养基)转移至培养容器10而用于容纳的容器。培养基储藏容器20在培养结束后可以作为废液容器使用。即，在从培养容器10向细胞回收容器40回收细胞之前，通过将培养液的上清液转移至作为废液容器的培养基储藏容器20，可以将其后浓缩的细胞悬浮液从培养容器10输送至细胞回收容器40。
另外，在本实施方式的细胞培养用试剂盒中，也可以具备2个以上培养基储藏容器20。由此，除了可以储藏2倍量以上同样的培养液之外，通过分别储藏不同的培养液，还可以对培养容器10以各种变换方式供给培养液。
细胞注入容器30是装有在培养开始时必要的细胞和培养液的容器。通过将该细胞注入容器30中的细胞和培养液转移至培养容器10，开始细胞的培养。细胞注入容器30上具备至少1个接口，通过该接口转移细胞和培养液。
细胞回收容器40是用于在培养结束后从培养容器10回收包含培养液的一部分和培养的细胞在内的细胞悬浮液的容器。细胞回收容器40上具备至少1个接口，通过该接口，从培养容器10向细胞回收容器40转移包含培养液的一部分和培养的细胞在内的细胞悬浮液。
取样容器50是用于在细胞的培养中、培养结束后，转移培养容器10中的细胞悬浮液的一部分进行取样的容器。在作为转移至该取样容器50的样品的细胞悬浮液中，含有培养的细胞和培养液。取样容器50上具备连接着与培养容器10连接的导管(管)的至少1个接口，细胞悬浮液从培养容器10向取样容器50输送。
管60是连接细胞培养用试剂盒中的各容器的导管。
接着，参照图2对进行本实施方式的细胞回收方法的细胞培养装置的构成进行说明。该图中示意性地示出细胞培养装置。该细胞培养装置中配置有上述细胞培养用试剂盒中的培养容器10，进行细胞的培养。细胞培养装置如图2所示，具备培养容器10、装载台11、固定构件12、搅拌构件13、隔开构件(仕切部材)14、及管60。
装载台11是在其顶面载置有培养容器10、进一步在该培养容器10的顶面配设有搅拌构件13、隔开构件14的平面的台子。
固定构件12是用于将培养容器10固定于装载台11的构件。图2中，固定构件12以夹板的形式示出，但也可以以在培养容器10的四角具有孔并通过该孔进行固定的栓等固定构件的形式构成。
搅拌构件13通过向培养容器10施加外力，来搅拌培养容器10内的细胞悬浮液。由此，可以使培养容器10中的细胞分散于细胞悬浮液内，使其容易转移至细胞回收容器40。另外，还可以使附着于培养容器10的内面的细胞分散于细胞悬浮液，使其容易转移至细胞回收容器40。利用该搅拌构件13的培养容器10内的细胞悬浮液的搅拌可以在细胞悬浮液的转移前等适当的时机进行。
作为该搅拌构件13，可以使用例如辊。而且，通过利用搅拌构件13将培养容器10的顶面按压到规定的深度，且使搅拌构件13与装载台11平行地移动，可以搅拌细胞悬浮液。
另外，虽未图示，但搅拌构件13可以通过支撑台等配置在培养容器10上。而且，可以使该支撑台通过驱动装置沿上下方向和水平方向移动，进行利用搅拌构件13的搅拌。
隔开构件14是通过从培养容器10的端部按压培养容器10直至培养容器10的顶面与底面密合，且相对于装载台11沿水平方向移动，由此可以增减培养容器10的底面积的构件。
由于培养容器10由可挠性材料构成，因此若通过隔开构件14缩小培养容器10的底面积，则在培养容器10内细胞悬浮液被向上方顶，从而变成培养容器10的厚度略微增加的状态。
在后述的缩小工序中，通过缩小培养容器10的底面积、增加培养容器10内的细胞悬浮液的液厚，可以防止培养容器10中发生堵塞。由此，从培养容器10回收到细胞回收容器40的细胞悬浮液增加，结果可以提高细胞的回收效率。
另外，在后述的静置工序中，在缩小培养容器10的底面积、增加培养容器10内的细胞悬浮液的液厚的状态下静置后，可以将培养容器10内的细胞悬浮液的培养上清液转移至废液容器。
若像这样进行培养上清液向废液容器的转移，则与不缩小培养容器10的底面积地将培养上清液转移至废液容器的情况相比，可以提高上清液排出后的残留于培养容器10中的细胞悬浮液的细胞浓度。
这是由于，可以增加培养容器10中的上清液相对于底面积的量，能够增加培养上清液的排出量。其结果，回收到细胞回收容器40的细胞悬浮液的细胞浓度升高，可以减少要回收的细胞悬浮液量。
该隔开构件14可以与搅拌构件13同样地通过辊等构成。图2中，示出通过2个辊由上下夹持培养容器10的隔开构件14，但并不限于此，只要是能够缩小培养容器10的底面积的隔开构件即可。另外，隔开构件14的驱动也可以与搅拌构件13同样地进行。
图2中，管60将培养容器10与细胞回收容器和废液容器等连接。该图的例子中，管60分为A、B、C，A与细胞回收容器连接，C与废液容器连接。另外，B可以作为与例如取样容器连接的管使用。
[第一实施方式]
接着，参照图2对本发明的细胞回收方法的第一实施方式进行说明。在本说明书中，有时将包括以下的上清液返回工序以及再回收工序的细胞回收方法称为洗涤回收。
(1)上清液排出工序
首先，静置培养容器10使细胞沉淀在下方后，将细胞悬浮液的上清液从培养容器10转移至废液容器。
由此，可以浓缩培养容器10中的细胞悬浮液，能够提高细胞的浓度。该培养上清液的排出可以通过操作管60上的管泵来进行。另外，对于以下说明的细胞悬浮液的转移、培养上清液的返回，也可以操作管60上的管泵来进行。
(2)细胞回收工序
接着，从培养容器10将细胞悬浮液转移至细胞回收容器。在结束该转移的状态下，在培养容器10内，含有培养细胞的细胞悬浮液部分残留。
(3)上清液返回工序
接着，使部分培养上清液从废液容器返回培养容器10，利用搅拌构件13搅拌培养容器10。由此，可以使附着于培养容器10内的壁面的细胞等残留于培养容器10内的细胞悬浮于细胞悬浮液内。另外，根据需要进行搅拌即可。
(4)再回收工序
接着，将悬浮有残留细胞的细胞悬浮液从培养容器10再次转移至细胞回收容器。由此，根据本实施方式的细胞回收方法，可以不使用新的培养液、洗涤液，而回收在细胞回收工序中残留于培养容器10的细胞，能够提高细胞的回收效率。
另外，在上述细胞回收方法中，还优选重复进行2次以上上清液返回工序和再回收工序。若像这样重复2次以上上清液返回工序和再回收工序，则可以进一步回收每次残留于培养容器10的细胞，因此能够更加提高回收效率。
而且，在上述细胞回收方法中，还优选同时进行上清液返回工序和再回收工序。若像这样同时进行上清液返回工序和再回收工序，则可以边流动培养上清液边再回收细胞，能够使残留于培养容器10内的细胞容易转移至细胞回收容器40。此时，作为培养容器10，可以适宜地使用2接口以上的培养容器，通过管60，1个接口与细胞回收容器40连接，另1个接口与废液容器连接。
[第二实施方式]
接着，参照图3对本发明的细胞回收方法的第二实施方式进行说明。
本实施方式的细胞回收方法如下所述，在进行上清液排出工序之前包括静置工序的方面与第一实施方式不同。就其他方面而言，与第一实施方式同样。
(1)静置工序
在进行第一实施方式的细胞回收方法中的上清液排出工序之前，使用隔开构件14缩小培养容器10的底面积。具体来说，通过边利用隔开构件14由培养容器10的端部使表面和背面密合，边使隔开构件14在培养容器10上移动，由此可以缩小培养容器10的底面积。然后，静置培养容器10使细胞沉淀在下方。
然后，进行第一实施方式中说明的上清液排出工序、细胞回收工序、上清液返回工序、以及再回收工序。另外，还优选重复进行上清液返回工序、以及再回收工序。
通过像这样缩小培养容器10的底面积后进行洗涤回收，可以增加上清液相对于底面积的量，可以增加培养上清液的排出量。因此可以提高细胞回收工序中回收的细胞悬浮液的细胞浓度，能够提高细胞的回收效率。
[第三实施方式]
接着，参照图4对本发明的细胞回收方法的第三实施方式进行说明。本说明书中，有时将包括以下的缩小工序、以及缩小回收工序的细胞回收方法称为缩小回收。
(1)上清液排出工序
首先，与第一实施方式同样地，静置培养容器10使细胞沉淀在下方后，将细胞悬浮液的上清液从培养容器10转移至废液容器。
(2)缩小工序
接着，使用隔开构件14缩小培养容器10的底面积。具体来说，通过边利用隔开构件14由培养容器10的端部使表面和背面密合，边使隔开构件14在培养容器10上移动，由此可以缩小培养容器10的底面积。由此，可以将细胞悬浮液汇集在培养容器10中的细胞回收接口附近或细胞回收接口侧。
(3)缩小回收工序
进一步，在缩小培养容器10的底面积后的状态下，从培养容器10将细胞悬浮液转移至细胞回收容器40。像这样，通过在缩小培养容器10的底面积后的状态下进行细胞悬浮液的转移，可以抑制由细胞悬浮液的液量(液厚)的减少造成的培养容器10的堵塞。因此，可以减少残留于培养容器10内的细胞悬浮液，能够提高细胞的回收效率。
另外，还优选同时进行缩小工序、以及缩小回收工序。即，还优选边使用隔开构件14缩小培养容器10的底面积，边从培养容器10将细胞悬浮液转移至细胞回收容器40。通过像这样同时进行缩小工序、以及缩小回收工序，也可以抑制培养容器10的堵塞。
而且，还优选在上清液排出工序之后，进行将浓缩的细胞悬浮液从培养容器10转移至细胞回收容器40的细胞回收工序，接着进行缩小工序、以及缩小回收工序。由此，还可以抑制培养容器10的堵塞地回收细胞。
像这样，根据本实施方式的细胞回收方法，可以抑制培养容器的堵塞并减少残留于培养容器10的细胞悬浮液，可以不使用新的洗涤用培养液、洗涤液，而提高细胞的回收效率。
[第四实施方式]
接着，对本发明的细胞回收方法的第四实施方式进行说明。本实施方式的细胞回收方法如下所述，在对第三实施方式组合第一实施方式、进行缩小回收后进行洗涤回收的方面与第三实施方式不同。就其他方面而言，与第三实施方式同样。
即，本实施方式的细胞回收方法是在首先进行第三实施方式的上清液排出工序、缩小工序、以及缩小回收工序后，接着进行第一实施方式的上清液返回工序、以及再回收工序。
由此，不仅培养容器的堵塞得到抑制、能够减少残留于培养容器10的细胞悬浮液而提高细胞回收效率，还可以通过洗涤培养容器10内使附着于壁面的细胞悬浮于细胞悬浮液，提高细胞回收效率。
因此，根据本实施方式的细胞回收方法，可以不使用新的洗涤用培养液、洗涤液，而更加提高细胞回收效率。
另外，若对本实施方式的细胞回收方法进一步组合第二实施方式，形成在进行静置工序后进行缩小回收，接着进行洗涤回收的构成，则可以进一步更加提高细胞回收效率。
实施例
比较进行利用上述实施方式的细胞回收方法的洗涤回收和/或缩小回收从培养容器回收细胞的情况、与不进行洗涤回收和/或缩小回收从培养容器回收细胞的情况，验证了它们的效果。其结果如图5所示。该实验使用22×66cm的培养容器，向其中封入2000mL的培养液和8.00E+09个细胞来进行。
(比较例1)
只进行第一实施方式的细胞回收方法中的上清液排出工序和细胞回收工序，而不进行缩小回收及洗涤回收，从培养容器回收细胞。
其结果，排出到废液容器的培养上清液为1600mL，其中含有2.00E+08的细胞，其细胞数的百分率为2.5％。回收到细胞回收容器的细胞悬浮液为350mL，其中含有6.83E+09的细胞，其细胞数的百分率为85.31％。另外，残留于培养容器的细胞悬浮液为50mL，其中含有9.75E+08的细胞，其细胞数的百分率为12.19％。
(实施例1)
通过分别进行1次第一实施方式的细胞回收方法中的上清液排出工序、细胞回收工序、上清液返回工序、以及再回收工序，从而进行1次洗涤回收，从培养容器回收细胞。
排出到废液容器的培养上清液为1550mL，其中含有1.94E+08的细胞，其细胞数的百分率为2.42％。回收到细胞回收容器的细胞悬浮液为400mL，其中含有7.32E+09的细胞，其细胞数的百分率为91.45％。另外，残留于培养容器的细胞悬浮液为50mL，其中含有4.91E+08的细胞，其细胞数的百分率为6.13％。
(实施例2)
通过在分别进行1次第一实施方式的细胞回收方法中的上清液排出工序、细胞回收工序、上清液返回工序、以及再回收工序后，再重复1次上清液返回工序和再回收工序，从而进行2次洗涤回收，从培养容器回收细胞。
排出到废液容器的培养上清液为1500mL，其中含有1.88E+08的细胞，其细胞数的百分率为2.34％。回收到细胞回收容器的细胞悬浮液为450mL，其中含有7.56E+09的细胞，其细胞数的百分率为94.55％。另外，残留于培养容器的细胞悬浮液为50mL，其中含有2.48E+08的细胞，其细胞数的百分率为3.11％。
(实施例3)
通过分别进行1次第三实施方式的细胞回收方法中的上清液排出工序、缩小工序、以及缩小回收工序，从而进行缩小回收，从培养容器回收细胞。
排出到废液容器的培养上清液为1600mL，其中含有2.00E+08的细胞，其细胞数的百分率为2.5％。回收到细胞回收容器的细胞悬浮液为390mL，其中含有7.61E+09的细胞，其细胞数的百分率为95.06％。另外，残留于培养容器的细胞悬浮液为10mL，其中含有1.95E+08的细胞，其细胞数的百分率为2.44％。
(实施例4)
组合第一实施方式和第三实施方式的细胞回收方法，分别进行1次上清液排出工序、缩小工序、以及缩小回收工序后，各进行1次上清液返回工序和再回收工序，由此进行1次洗涤回收，从培养容器中回收细胞。
排出到废液容器的培养上清液为1590mL，其中含有1.99E+08的细胞，其细胞数的百分率为2.48％。回收到细胞回收容器的细胞悬浮液为400mL，其中含有7.70E+09的细胞，其细胞数的百分率为96.29％。另外，残留于培养容器的细胞悬浮液为10mL，其中含有9.81E+07的细胞，其细胞数的百分率为1.23％。
比较例1中，培养容器中细胞悬浮液残留50ml。这是由于，液量变少培养容器堵塞，不能将细胞悬浮液更多地转移至细胞回收容器。
实施例1中，培养容器中细胞悬浮液残留50ml后，从废液容器中将培养上清液50ml返回培养容器，搅拌并洗涤培养容器，在细胞回收容器中进一步回收细胞悬浮液50ml。其结果，培养容器中细胞悬浮液残留50ml。实施例2中，再重复1次实施例1的上清液返回和再回收，进行2次洗涤回收。
实施例3中，通过缩小培养容器10的底面积回收细胞悬浮液，从而培养容器的堵塞得到抑制，培养容器中的细胞悬浮液的残留量减少到10ml。
实施例4中，缩小培养容器10的底面积回收细胞悬浮液后，从废液容器中将培养上清液10ml返回培养容器，搅拌并洗涤培养容器，细胞回收容器中进一步回收到细胞悬浮液10ml。其结果，培养容器中细胞悬浮液残留10ml。
回收到细胞回收容器的细胞的数量的百分率按照比较例1、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4的顺序为85.31％、91.45％、94.55％、95.06％、96.29％。
另外，排出到废液容器的细胞的数量的百分率按照比较例1、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4的顺序为2.5％、2.42％、2.34％、2.5％、2.48％。
另外，残留于培养容器的细胞的数量的百分率按照比较例1、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4的顺序为12.19％、6.13％、3.11％、2.44％、1.23％。
如上所述，只进行1次洗涤回收的实施例1的细胞回收效率与比较例1相比，增加6％以上。另外，进行2次洗涤回收的实施例2的细胞回收效率与比较例1相比，增加9％以上。
另外，进行缩小回收的实施例3的细胞回收效率与比较例1相比，增加接近10％。另外，进行1次缩小回收和洗涤回收的实施例4的细胞回收效率与比较例1相比，增加接近11％。
由以上结果可知，通过进行本实施方式的细胞回收方法中的洗涤回收，从而不使用新的洗涤用培养液、洗涤液，细胞的回收效率得到提高。另外，通过进行本实施方式的细胞回收方法中的缩小回收，细胞回收效率显著增加。因此，可知通过本实施方式的细胞回收方法中的缩小回收，可以抑制培养容器的堵塞并减少残留于培养容器内的细胞悬浮液，可以大幅提高细胞回收效率。
本发明不限于以上的实施方式，在本发明的范围内，各种变更实施当然是可能的。
例如，图2中使用辊型的搅拌构件进行上清液返回工序，但也可以采用振动装载台等其他方法来搅拌培养容器，还可以进行3次以上洗涤回收等进行适宜变更。
产业上的可利用性
本发明可以在需要培养大量的细胞的生物医药、再生医疗、免疫疗法等领域中适宜地利用。
Claims (13)
1.一种细胞回收方法，其是使用细胞培养用试剂盒培养的细胞的回收方法，该试剂盒通过由导管至少连接用于培养细胞的培养容器、回收培养后的细胞的细胞回收容器、和回收培养后的培养基的废液容器而成，所述回收方法的特征在于，包括以下工序：
上清液排出工序，将培养后的培养上清液从所述培养容器转移至所述废液容器；
细胞回收工序，将浓缩的细胞悬浮液从所述培养容器转移至所述细胞回收容器；
上清液返回工序，使排出到所述废液容器的培养上清液的一部分返回所述培养容器，使残留于所述培养容器的细胞悬浮于细胞悬浮液；以及
再回收工序，将悬浮有残留细胞的细胞悬浮液从所述培养容器再次转移至所述细胞回收容器。
2.如权利要求1所述的细胞回收方法，其特征在于，
在所述上清液返回工序中，使用规定的悬浮构件，边按压所述培养容器的表面直至所述培养容器的表面下降到规定的深度的位置，边使所述悬浮构件在所述培养容器上沿水平方向往返移动，使残留于所述培养容器的细胞分散于细胞悬浮液。
3.如权利要求1或2所述的细胞回收方法，其特征在于，
同时进行所述上清液返回工序中的残留于所述培养容器的细胞在细胞悬浮液中的分散、和所述再回收工序中的细胞悬浮液从培养容器向所述细胞回收容器的转移。
4.一种细胞回收方法，其是使用细胞培养用试剂盒培养的细胞的回收方法，该试剂盒通过由导管至少连接用于培养细胞的培养容器、回收培养后的细胞的细胞回收容器、和回收培养后的培养基的废液容器而成，所述回收方法的特征在于，包括以下工序：
上清液排出工序，将培养后的培养上清液从所述培养容器转移至所述废液容器；
缩小工序，缩小所述培养容器的底面积，将浓缩的细胞悬浮液汇集到所述培养容器的细胞回收接口侧；以及
缩小回收工序，将汇集的细胞悬浮液从所述培养容器转移至所述细胞回收容器。
5.如权利要求4所述的细胞回收方法，其特征在于，
同时进行所述缩小工序中的浓缩的细胞悬浮液的汇集、和所述缩小回收工序中的汇集的细胞悬浮液向所述细胞回收容器的转移。
6.如权利要求4或5所述的细胞回收方法，其特征在于，
在所述上清液排出工序之后，进行将浓缩的细胞悬浮液从所述培养容器转移至所述细胞回收容器的细胞回收工序，接着进行所述缩小工序。
7.如权利要求4～6中任一项所述的细胞回收方法，其特征在于，
在所述缩小回收工序之后，包括以下工序：
上清液返回工序，使排出到所述废液容器的培养上清液的一部分返回所述培养容器，使残留于所述培养容器的细胞悬浮于细胞悬浮液；以及
再回收工序，将悬浮有残留细胞的细胞悬浮液从所述培养容器再次转移至所述细胞回收容器。
8.如权利要求4～7中任一项所述的细胞回收方法，其特征在于，
在所述缩小工序中，使用规定的隔开构件，边从培养空间的外部挤压所述培养容器以使其表面和背面密合，边使所述隔开构件在所述培养容器上移动，缩小所述培养容器的底面积。
9.如权利要求1～3或7中任一项所述的细胞回收方法，其特征在于，
重复2次以上所述上清液返回工序以及所述再回收工序。
10.如权利要求1～9中任一项所述的细胞回收方法，其特征在于，
使用用于预先储藏培养基等的培养基储藏容器作为所述废液容器。
11.如权利要求1～10中任一项所述的细胞回收方法，其特征在于，
在所述上清液排出工序之前，进行缩小所述培养容器的底面积、静置所述培养容器直至细胞沉淀的静置工序。
12.如权利要求11所述的细胞回收方法，其特征在于，
在所述静置工序中，使用规定的隔开构件，边从端部挤压所述培养容器以使其表面和背面密合，边使所述隔开构件在所述培养容器上移动，缩小所述培养容器的底面积。
13.如权利要求8或12所述的细胞回收方法，其特征在于，所述规定的隔开构件为辊。
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