CN104087543B - 复合微生态制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种复合微生态制剂的制备方法，其解决了现有降低养殖水体污染的微生态制剂菌种单一、不能明显降低水体中氨氮和亚硝酸盐的含量的技术问题，其以粪链球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌为主要成分，将粪链球菌与酿酒酵母的混合培养液和枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培养液以5～7：3～5的体积比配制而成，本发明可广泛应用于微生态制剂制备领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合微生态制剂的制备方法，具体地说是一种降低养殖水体污染的复合微生态制剂的制备方法。
背景技术
随着水产养殖业迅猛发展，养殖密度、集约化养殖程度均不断提高，养殖水质污染成为阻碍这一领域发展的一大难题。微生态制剂对与水质污染的优势，逐渐受到人们的重视。
从目前来看，现有的微生态制剂虽然品种多，但产品质量参差不齐，而且菌种单一，应用范围不够广泛，水体中的氨氮和亚硝酸盐的含量不能够明显得到降低，对养殖动物有很大的毒害作用。
发明内容
本发明就是为了解决现有降低养殖水体污染的微生态制剂菌种单一、不能明显降低水体中氨氮和亚硝酸盐的含量的技术问题，提供一种菌种多样、能够明显降低水体中氨氮和亚硝酸盐的含量的降低养殖水体污染的复合微生态制剂的制备方法。
本发明提供一种复合微生态制剂，其含有粪链球菌活菌数为1×109个/ml～5×109个/ml；酿酒酵母活菌数为2×108个/ml～1×109个/ml；枯草芽孢杆菌活菌数为1×109个/ml～5×109个/ml；地衣芽孢杆菌活菌数为1×109个/ml～5×109个/ml。
本发明还提供一种复合微生态制剂的制备方法，其步骤如下：
(1)制备粪链球菌和酿酒酵母的混合培养液，所使用的培养基含有以下重量百分比的成分：葡萄糖1.2％～2.0％、玉米浆粉1.2％～2.0％、酵母蛋白0.5％～1.0％、大豆粉0.2％～0.6％、玉米面0.1％～0.3％、磷酸氢二钾0.1％～0.5％、氯化钠0.02％～0.1％、硫酸镁0.01％～0.02％、硫酸铵0.01％～0.05％，其余为水，pH＝6.5～7.5；
(2)制备枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培养液，所使用的培养基含有以下重量百分比的成分：葡萄糖0.8％～1.5％、玉米浆粉0.5～1.0％、酵母蛋白0.3％～0.6％、大豆粉0.1％～0.3％、玉米面0.1％～0.3％、磷酸氢二钾0.02％～0.1％、硫酸镁0.01％～0.02％、硫酸铵0.01％～0.05％，硫酸锰0.005％～0.008％，其余为水，pH＝7.0～7.5；
(3)将活菌数为2×109个/ml～1×1010个/ml的粪链球菌与活菌数为4×108个/ml～2×109个/ml的酿酒酵母的混合培养液按体积份数5～7份，和活菌数为1×109个/ml～2×1010个/ml的枯草芽孢杆菌与活菌数为1×109个/ml～2×1010个/ml的地衣芽孢杆菌的混合培养液按体积份数3～5份，进行配制,从而得到复合微生态制剂。
优选地，步骤(1)中粪链球菌和酿酒酵母的混合培养液的制备过程如下：
a.将粪链球菌和酿酒酵母的斜面分别在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度28～33℃、转数200～220rpm，培养10～18小时，得到活菌数为2×109个/ml～1×1010个/ml的粪链球菌，和活菌数为4×108个/ml～2×109个/ml的酿酒酵母，为一级发酵罐所用的种子液，所述粪链球菌和酿酒酵母的接种量均为培养基体积的1％；
b.将步骤a培养的种子液分别接种于100L一级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养基装量为70L，接菌量为培养基体积的5～10％，发酵条件为：温度28～33℃、培养基与所通空气的体积比为1：0.7～1.1、搅拌转数为180～240rpm，发酵培养8～16小时，得到二级发酵罐所用种子菌液；
c.将步骤b所得的粪链球菌的种子菌液接种到二级发酵罐中，培养8～10小时后，再将步骤b所得的酿酒酵母的种子菌液接到该二级发酵罐中与粪链球菌混合培养24～36小时，得到粪链球菌和酿酒酵母混合培养液。
优选地，步骤c中将酿酒酵母的种子菌液与粪链球菌混合培养的发酵条件为：温度28～33℃；培养基与所通空气的体积比为1:0.7～1.1；搅拌转数为180～240rpm。
优选地，步骤(2)中枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培养液的制备过程如下：
a.将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的斜面在无菌环境下分别接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度28～33℃；转数200～220rpm；培养10～18小时，得到活菌数为2×109个/ml～1×1010个/ml的枯草芽孢杆菌和活菌数为2×109个/ml～1×1010个/ml的地衣芽孢杆菌，为一级发酵罐所用的种子液，所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的接种量均为培养基体积的1％；
b.将步骤a培养的种子液分别接种于100L一级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养基装量为70L，接菌量为培养基体积的5～10％，发酵条件为：温度28～33℃；培养基与所通空气的体积比为1：0.7～1.1；搅拌转数为180～240rpm；发酵培养8～16小时，得到二级发酵罐所用种子菌液；
c.将步骤b所得的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的种子菌液同时接种到二级发酵罐中，培养48～60小时，即得枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养液。
本发明可降低养殖水体的氨氮和亚硝酸盐含量，而且能够拮抗病原菌，提高养殖动物的存活率。另外混合发酵技术充分利用菌种间的互利关系，减少发酵罐的占用，并且培养出的菌抗逆性强，效果明显。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
本发明中所用粪链球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌由中科院沈阳应用生态研究所提供。
实施例1
首先制备粪链球菌和酿酒酵母的混合培养液，具体过程如下：
a.将粪链球菌和酿酒酵母的斜面在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度28℃、转数220rpm，培养10小时，得到活菌数均为1×109个/ml一级发酵罐所用的种子液，粪链球菌和酿酒酵母的接种量均为培养基体积的1％；
b.将步骤a培养的种子液分别接种于100L一级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养基装量为70L，接菌量为培养基体积的5％，发酵条件为：温度30℃、培养基与所通空气的体积比为1:0.7、搅拌转数为180rpm，发酵培养16小时，得到二级发酵罐所用种子菌液；
c.将步骤b所得的粪链球菌的种子菌液接种到二级发酵罐中，培养8小时后，再将步骤b所得的酿酒酵母的种子菌液接到该二级发酵罐中与粪链球菌混合培养36小时。发酵条件为：温度28℃、培养基与所通空气的体积比为1:0.7、搅拌转数为180rpm，得到粪链球菌和酿酒酵母混合培养液。
粪链球菌和酿酒酵母的混合培养基的培养基配方按重量比为葡萄糖1.2％、玉米浆粉2.0％、酵母蛋白0.5％、大豆粉0.3％、玉米面0.2％、磷酸氢二钾0.2％、氯化钠0.05％、硫酸镁0.01％、硫酸铵0.03％，其余为水，pH＝6.5。
然后制备枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养液，具体过程如下：
a.将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的斜面在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度28℃、转数220rpm，培养10小时，得到活菌数均为2×109个/ml的一级发酵罐所用的种子液，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的接种量分别培养基体积的1％；
b.将步骤a培养的种子液分别接种于100L一级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养基装量为70L，接菌量为培养基体积的5％，发酵条件为：温度30℃、培养基与所通空气的体积比为1:0.7、搅拌转数为180rpm，发酵培养16小时，得到二级发酵罐所用种子菌液；
c.将步骤b所得的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的种子菌液同时接种到二级发酵罐中，培养48小时。即得枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养液。
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养基的培养基配方按重量比为葡萄糖0.8％、玉米浆粉0.5％、酵母蛋白0.3％、大豆粉0.2％、玉米面0.3％、磷酸氢二钾0.02％、硫酸镁0.01％、硫酸铵0.01％，硫酸锰0.005％，其余为水，pH＝7.5。
将粪链球菌与酿酒酵母的混合培养液和枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培养液以7：3的体积比进行配制,从而得到降低养殖水体污染的微生态制剂，其中粪链球菌活菌数为5×109个/ml；酿酒酵母活菌数为1×109个/ml；枯草芽孢杆菌活菌数为1×109个/ml；地衣芽孢杆菌活菌数为1×109个/ml。
实施例2
首先制备粪链球菌和酿酒酵母的混合培养液，具体过程如下：
a.将粪链球菌和酿酒酵母的斜面在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度30℃、转数200rpm，培养16小时，得到活菌数均为2×109个/ml的一级发酵罐所用的种子液，粪链球菌和酿酒酵母的接种量均为培养基体积的1％；
b.将步骤a培养的种子液分别接种于100L一级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养基装量为70L，接菌量为培养基体积的7％，发酵条件为：温度28℃、培养基与所通空气的体积比为1:1、搅拌转数为220rpm，发酵培养12小时，得到二级发酵罐所用种子菌液；
c.将步骤b所得的粪链球菌的种子菌液接种到二级发酵罐中，培养9小时后再将步骤b所得的酿酒酵母的种子菌液接到该二级发酵罐中与粪链球菌混合培养30小时。发酵条件为：温度30℃、培养基与所通空气的体积比为1:1、搅拌转数为200rpm，得到粪链球菌和酿酒酵母混合培养液(活菌数为2.8×109个/ml)。
粪链球菌和酿酒酵母的混合培养基的培养基配方按重量比为葡萄糖1.5％、玉米浆粉1.2％、酵母蛋白1.0％、大豆粉0.2％、玉米面0.1％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钠0.02％、硫酸镁0.015％、硫酸铵0.01％，其余为水，pH＝7.0。
然后制备枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养液，具体过程如下：
a.将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的斜面在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度30℃、转数200rpm，培养16小时，得到活菌数均为3×109个/ml的一级发酵罐所用的种子液，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的接种量分别培养基体积的1％；
b.将步骤a培养的种子液分别接种于100L一级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养基装量为70L，接菌量为培养基体积的7％，发酵条件为：温度28℃、培养基与所通空气的体积比为1:1、搅拌转数为220rpm，发酵培养12小时，得到二级发酵罐所用种子菌液；
c.将步骤b所得的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的种子菌液同时接种到二级发酵罐中，培养54小时。即得枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养液。
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养基的培养基配方按重量比为葡萄糖1.0％、玉米浆粉0.6％、酵母蛋白0.5％、大豆粉0.1％、玉米面0.2％、磷酸氢二钾0.03％、硫酸镁0.02％、硫酸铵0.02％，硫酸锰0.007％，其余为水，pH＝7.3。
将粪链球菌与酿酒酵母的混合培养液和枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培养液以5：5的体积比进行配制,从而得到降低养殖水体污染的微生态制剂，其中粪链球菌活菌数为1×109个/ml；酿酒酵母活菌数为2×108个/ml；枯草芽孢杆菌活菌数为5×109个/ml；地衣芽孢杆菌活菌数为5×109个/ml。
实施例3
首先制备粪链球菌和酿酒酵母的混合培养液，具体过程如下：
a.将粪链球菌和酿酒酵母的斜面在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度33℃、转数210rpm，培养18小时，得到活菌数均为5×109个/ml一级发酵罐所用的种子液，粪链球菌和酿酒酵母的接种量均为培养基体积的1％；
b.将步骤a培养的种子液接种于100L一级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养基装量为70L，接菌量为培养基体积的10％，发酵条件为：温度33℃、培养基与所通空气的体积比为1:1.1、搅拌转数为240rpm，发酵培养8小时，得到二级发酵罐所用种子菌液；
c.将步骤b所得的粪链球菌的种子菌液接种到二级发酵罐中，培养10小时后再将步骤b所得的酿酒酵母的种子菌液接到该二级发酵罐中与粪链球菌混合培养24小时。发酵条件为：温度33℃、培养基与所通空气的体积比为为1:1.1、搅拌转数为240rpm，得到粪链球菌和酿酒酵母混合培养液(活菌数为5×109个/ml)。
粪链球菌和酿酒酵母的混合培养基的培养基配方按重量比为葡萄糖2.0％、玉米浆粉1.5％、酵母蛋白0.6％、大豆粉0.6％、玉米面0.3％、磷酸氢二钾0.5％、氯化钠0.1％、硫酸镁0.02％、硫酸铵0.05％，其余为水，pH＝7.0。
然后制备枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养液，具体过程如下：
a.将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的斜面在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度33℃、转数210rpm，培养18小时，得到活菌数均为1×1010个/ml的一级发酵罐所用的种子液，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的接种量分别培养基体积的1％；
b.将步骤a培养的种子液分别接种于100L一级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养基装量为70L，接菌量为培养及体积的10％，发酵条件为：温度33℃、培养基与所通空气的体积比为1:1.1、搅拌转数为240rpm，发酵培养8小时，得到二级发酵罐所用种子菌液；
c.将步骤b所得的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的种子菌液同时接种到二级发酵罐中，培养60小时。即得枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养液。
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养基的培养基配方按重量比为葡萄糖1.5％、玉米浆粉1.0％、酵母蛋白0.6％、大豆粉0.3％、玉米面0.1％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.015％、硫酸铵0.05％，硫酸锰0.008％，其余为水，pH＝7.0。
将粪链球菌与酿酒酵母的混合培养液和枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培养液以6：4的体积比进行配制,从而得到降低养殖水体污染的微生态制剂，其中粪链球菌活菌数为2×109个/ml；酿酒酵母活菌数为3×108个/ml；枯草芽孢杆菌活菌数为3×109个/ml；地衣芽孢杆菌活菌数为2×109个/ml。
以上三个实施例中，菌种都由中科院沈阳应用生态研究所提供。混合发酵技术充分利用菌种间的互利关系，减少发酵罐的占用，并且培养出的菌抗逆性强，效果明显。降低了养殖水体的氨氮和亚硝酸盐含量，而且能够拮抗病原菌，提高养殖动物的存活率。
惟以上所述者，仅为本发明的具体实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，故其等同组件的置换，或依本发明专利保护范围所作的等同变化与修改，皆应仍属本发明权利要求书涵盖之范畴。
Claims (4)
1.一种复合微生态制剂的制备方法，其特征是步骤如下：
(1)制备粪链球菌和酿酒酵母的混合培养液，所使用的培养基含有以下重量百分比的成分：葡萄糖1.2％～2.0％、玉米浆粉1.2％～2.0％、酵母蛋白0.5％～1.0％、大豆粉0.2％～0.6％、玉米面0.1％～0.3％、磷酸氢二钾0.1％～0.5％、氯化钠0.02％～0.1％、硫酸镁0.01％～0.02％、硫酸铵0.01％～0.05％，其余为水，pH＝6.5～7.5；
(2)制备枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培养液，所使用的培养基含有以下重量百分比的成分：葡萄糖0.8％～1.5％、玉米浆粉0.5～1.0％、酵母蛋白0.3％～0.6％、大豆粉0.1％～0.3％、玉米面0.1％～0.3％、磷酸氢二钾0.02％～0.1％、硫酸镁0.01％～0.02％、硫酸铵0.01％～0.05％，硫酸锰0.005％～0.008％，其余为水，pH＝7.0～7.5；
(3)将活菌数为2×109个/ml～1×1010个/ml的粪链球菌与活菌数为4×108个/ml～2×109个/ml的酿酒酵母的混合培养液按体积份数5～7份，和活菌数为1×109个/ml～2×1010个/ml的枯草芽孢杆菌与活菌数为1×109个/ml～2×1010个/ml的地衣芽孢杆菌的混合培养液按体积份数3～5份，进行配制,从而得到复合微生态制剂。
2.根据权利要求1所述的复合微生态制剂的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中粪链球菌和酿酒酵母的混合培养液的制备过程如下：
a.将粪链球菌和酿酒酵母的斜面分别在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度28～33℃、转数200～220rpm，培养10～18小时，得到活菌数为2×109个/ml～1×1010个/ml的粪链球菌，和活菌数为4×108个/ml～2×109个/ml的酿酒酵母，为一级发酵罐所用的种子液，所述粪链球菌和酿酒酵母的接种量均为培养基体积的1％；
b.将步骤a培养的种子液分别接种于100L一级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养基装量为70L，接菌量为培养基体积的5～10％，发酵条件为：温度28～33℃、培养基与所通空气的体积比为1：0.7～1.1、搅拌转数为180～240rpm，发酵培养8～16小时，得到二级发酵罐所用种子菌液；
c.将步骤b所得的粪链球菌的种子菌液接种到二级发酵罐中，培养8～10小时后，再将步骤b所得的酿酒酵母的种子菌液接到该二级发酵罐中与粪链球菌混合培养24～36小时，得到粪链球菌和酿酒酵母混合培养液。
3.根据权利要求2所述的复合微生态制剂的制备方法，其特征在于所述步骤c中将酿酒酵母的种子菌液与粪链球菌混合培养的发酵条件为：温度28～33℃；培养基与所通空气的体积比为1:0.7～1.1；搅拌转数为180～240rpm。
4.根据权利要求3所述的复合微生态制剂的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培养液的制备过程如下：
a.将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的斜面在无菌环境下分别接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度28～33℃；转数200～220rpm；培养10～18小时，得到活菌数为2×109个/ml～1×1010个/ml的枯草芽孢杆菌和活菌数为2×109个/ml～1×1010个/ml的地衣芽孢杆菌，为一级发酵罐所用的种子液，所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的接种量均为培养基体积的1％；
b.将步骤a培养的种子液分别接种于100L一级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养基装量为70L，接菌量为培养基体积的5～10％，发酵条件为：温度28～33℃；培养基与所通空气的体积比为1：0.7～1.1；搅拌转数为180～240rpm；发酵培养8～16小时，得到二级发酵罐所用种子菌液；
c.将步骤b所得的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的种子菌液同时接种到二级发酵罐中，培养48～60小时，即得枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养液。
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