CN104087540B - 一株有效抑制烟草青枯病菌及玉米纹枯病菌的多粘类芽孢杆菌 - Google Patents
一株有效抑制烟草青枯病菌及玉米纹枯病菌的多粘类芽孢杆菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株能有效抑制烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和玉米纹枯病菌(Rrizoctonia solani)的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的分离及应用，属于微生物技术领域。多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)C2c分离自泰安小麦根际，能有效抑制烟草青枯病菌和玉米纹枯病菌的生长，尤其是对烟草青枯病菌的室内抑菌效果超过化学药剂80％福美双水分散粒剂。C2c对玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)和烟草炭疽病菌(Colletotrichum nicotianae)等也有很好的抑制作用。
Description
技术领域
本发明属微生物学领域，涉及一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的分离及应用，特别是涉及一株能有效抑制烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和玉米纹枯病菌(Rrizoctonia solani)生长的多粘类芽孢杆菌。
背景技术
由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病是烟草上最具毁灭性的细菌性病害，发生面积广，是对烟叶产量及品质造成重大损失的系统性侵染病害。该病广泛分布于世界热带、亚热带及温暖湿润的地区。1940年前后，该病在美国和印度尼西亚的危害最为严重，此后，在日本、澳大利亚、韩国等许多产烟国家逐渐演变为烟草上的重要病害(朱贤朝等，2002)。烟草青枯病在我国南方每年都有发生，近些年已经发展到北方烟区，成为我国烟叶生产上的重要制约因素。
玉米是我国重要的粮食、饲料作物及工业原料，在我国国民经济和农业生产上占有重要地位，玉米生产直接关系着我国粮食战略安全。近年来玉米纹枯病(Rhizoctonia solani)的发生呈上升趋势，危害日益加重，制约了玉米生产的发展。
因为化学农药的长期不合理大量使用会引发抗药性、残留和病虫再猖獗等3R问题，生物防治在植物病害防治中的作用越来越受重视。土壤中的一些微生物，对植物病原菌有良好的抑制作用，在植物病害防治中有重要的应用价值。类芽孢杆菌属(Paenibacillus)中的许多菌株，特别是多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)分布广、数量多，营养需求简单、繁殖快、竞争定殖力强，可产生多种抗生素和活性物质。多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)在多种作物上有促生及抑菌抗病作用，我国农业部已将多粘类芽孢杆菌属(Paenibacillus)列为免做安全鉴定的一级菌种(杨少波等，2008)。Egamberdiyeva(2007)证实多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)可以促进玉米对氮、磷、钾等营养物质的吸收从而起到促生作用。
本发明从小麦根际分离到1株多粘类芽孢杆菌C2c，能有效抑制烟草青枯病菌(R.solanacearum)和玉米纹枯病菌(R.solani)的生长，尤其是其对烟草青枯病菌的抑制效果超过80％福美双水分散粒剂，对玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)等多种病原真菌也有很好的抑制效果。
发明内容
本发明的目的是提供1株抑制烟草青枯病菌(R.solanacearum)和玉米纹枯病菌(R.solani)生长的多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)。
本发明是采用如下技术方案实现的：生防菌株分离自山东小麦根际。采用纸碟片法，筛选出对烟草青枯病菌具有良好抑制作用的拮抗菌株，命名为C2c。通过对C2c菌株16S rDNA序列测定及系统进化分析将其鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus.polymyxa)。测定了生防菌株C2c的抑菌谱，证明其对玉米纹枯病菌等多种病原真菌也有非常好的抑制效果。
保藏信息
保藏时间：2014年6月19日
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC
保藏编号：CGMCC NO.9361
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
分类命名:多粘类芽孢杆菌
附图说明
图1为多粘类芽孢杆菌C2c对烟草青枯病菌的抑制作用
图2为根据C2c 16S rDNA序列构建的系统发育树
图3为多粘类芽孢杆菌C2c与80％福美双水分散粒剂(稀释100倍、200倍)对烟草青枯病菌的抑制作用
图4为多粘类芽孢杆菌C2c对不同病原真菌的拮抗作用：
a图为玉米纹枯病菌；b图为玉米大斑病菌；c图为玉米青枯病菌；d图为小麦赤霉病菌。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。
实施例1：生防菌的分离和保存
根据方中达(1979)的方法筛选生防菌株。采集小麦根际土壤10g，加入到盛有90mL无菌水的三角瓶中，将三角瓶置摇床上，180r/min振荡20min，制成土壤悬液。将制备好的土壤悬液静置10min，采用10倍系列稀释法，依次稀释到10-2、10-3、10-4和10-5，每个浓度吸取100μL于NA平板上，涂布均匀，每个浓度重复三次。将平板于28℃恒温培养箱中培养24h。挑取细菌菌落进行划线，纯化三次后测定抑菌效果，筛选有抑菌活性的菌株。
实施例2：生防菌对烟草青枯病的抑菌效果
将烟草青枯菌于TTC培养基上活化，生防菌于LB培养基上活化，挑取单菌落于LB液体培养基中，放置28℃震荡培养箱，180rpm，培养6-8h，8000rpm离心5min，收集菌体，用无菌水重悬，调节浓度为1.0х109cfu/mL。
采用纸碟片法，在预先准备的LB平板中央放置直径为7mm的纸碟片，在纸碟片上加生防菌菌悬液10μL，待培养基将生防菌充分吸收后，倒置于28℃培养箱培养24h。将平板转移到通风橱内喷施烟草青枯病菌菌悬液。喷雾要均匀一致，溶液雾化程度高，使雾化菌悬液自然散落于培养基上，避免形成明显液滴，冲散原有菌落。待平板表面液滴充分吸收后将平板转移到28℃恒温培养箱，24h后十字交叉法测量抑菌圈直径。
结果表明生防菌C2c对烟草青枯病菌有很好的抑菌效果，接种烟草青枯病菌24h后，C2c抑菌圈直径达77.05mm(图1)。
实施例3：菌株C2c的鉴定
利用引物16S-8-F(5′-CAC GGA TCC AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3′)和16S-1510-R(5′-CCGGGT TTC CCC ATT CGG-3′)扩增菌株C2c的16S rDNA。扩增体系为：10×PCR Buffer2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)1.0μL，16S-8-F(10moL/L)1.0μL，16S-1510-R(10moL/L)1.0μL，模板DNA 1.0μL，Taq DNA聚合酶(5U/L)0.125μL，加ddH2O至终体积25.0μL；以ddH2O替代模板的体系作为阴性对照扩增体系。扩增程序为94℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃1min50s，30个循环；72℃10min；4℃保存。反应结束后，将PCR产物置于1.0％琼脂糖凝胶进行电泳分析。参照美国AXYGEN公司PCR纯化回收试剂盒回收PCR产物，将回收的目的片段在4℃中与pMD18-T过夜连接。连接反应体系为：10×T4DNA Ligase buffer 1μL，pMD18-T(50ng/μL)0.3μL，目的DNA 7.7μL，T4DNA Ligase(350U/μL)1μL。
热激法将连接产物转化感受态细胞：将100μL大肠杆菌感受态细胞置于冰上融化，加入10μL连接产物，轻轻搅动以混匀，将混合物于冰上放置25min，然后42℃水浴热激90S，迅速冰上放置5min，加800μL LB液体培养基(不含抗生素)，混匀，37℃，180r/min振荡45min。8000rpm离心2min，取出800μL上清，重悬菌体，将菌体均匀涂在含有氨苄青霉素的抗生素平板上，然后将平板正向放置30min，37℃倒置培养14-16h。挑去单菌落于含有液体LB培养基(含氨苄抗生素0.1mg/mL)的试管中，37℃，180r/min,震荡培养4-6h，保存于2.0mLl离心管中。
碱裂解法提取质粒DNA(韩志勇等，2000)。将提取的质粒置于1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，以空pUC18质粒作为对照。将含有重组质粒的菌株，以菌液形式送测序公司测序。每个菌液样品送2个克隆。将测序结果在NCBI上BLAST，利用Mega软件构建系统发育树。
电泳检测表明，从C2c基因组中扩增到了大约1.5kb的片段。经测定，C2c 16S rDNA序列长为1517nt，具体序列如SEQ.NO.1所示。
在根据16S rDNA序列构建的系统树中，C2c与多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)聚类到一支(图2)。
实施例4：C2c与80％福美双水分散粒剂对烟草青枯病病菌抑制效果比较
采用纸碟片法，测定100倍和200倍稀释浓度的80％福美双水分散粒剂以及生防菌C2c对烟草青枯病病菌抑菌圈直径。
结果表明，C2c的抑菌圈直径为29.70mm，100倍稀释浓度和200倍稀释浓度的80％福美双水分散粒剂对烟草青枯病菌的抑菌圈直径分别为18.20mm和14.30mm，说明多粘类芽孢杆菌C2c对烟草青枯病的抑制效果明显超过参试药剂80％福美双水分散粒剂(图3)。
实施例5：生防菌抑菌谱的测定
采用对峙培养法(Sijam等，2005)。在预先准备的直径为90mm的PDA平板上均匀对称放置2片直径为7mm的纸碟片，在纸碟片上分别滴加生防菌C2c菌悬液10μL，待培养基将生防菌菌液充分吸收后，倒置于28℃恒温培养箱培养24h。将直径为6mm的病原真菌菌饼放置在两纸碟片中央，封口，最后放入28℃恒温培养箱中培养。7天后测量病原真菌自然生长半径及生防菌处生长半径，计算抑制率：
抑制率＝(1-生防菌处病菌半径/对照处病菌半径)/2×100％
结果表明，C2c对玉米纹枯病菌的抑制率为48.37％，对玉米大斑病菌的抑制率为36.36％，对小麦赤霉病菌的抑制率为36.67％，对玉米青枯病菌的抑制率分别为34.44％(图4)。
以上所述，仅是本发明的个别实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (2)
1.一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)C2c，其特征在于能有效抑制青枯病菌和立枯丝核菌的生长，现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC；保藏号：CGMCC NO.9361；其16S rDNA核苷酸序列如SEQ.NO.1所示。
2.如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)C2c在防治作物病害中的应用，病原菌为青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。
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