CN104083760B - pH敏感的纳米金星材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种pH敏感的纳米金星材料及其制备方法和在肿瘤光热治疗中的应用。该纳米金星材料包括纳米金星本体，纳米金星本体的形状为多枝状星形，表面同时修饰氨基功能化和羟基功能化的巯基聚乙二醇。该金纳米星材料在弱酸性环境中可被肿瘤细胞大量摄入，经近红外激光照射后，将吸收的光能转化为热能，使局部温度升高，杀死肿瘤细胞，达到治疗目的。而在弱碱性环境中不被细胞摄入，在近红外激光照射下不会损伤细胞。该纳米金星材料对环境pH敏感，可以通过肿瘤组织环境偏酸性的特点特异性靶向肿瘤细胞，在体外弱酸性环境下对宫颈癌细胞有显著的抑制生长作用，将来还可应用于其它肿瘤的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米金星材料，具体涉及一种pH敏感的纳米金星材料及其制备方法和应用。
背景技术
医用纳米材料的肿瘤靶向运输是纳米医学的重要问题。传统的肿瘤靶向运输利用肿瘤表面受体识别技术，即在医用纳米材料上修饰可靶向肿瘤表面特异性高表达受体的配体，以提高肿瘤细胞对医用纳米材料的吞噬量。例如：molotamedi实验组在纳米金棒表面偶联赫塞汀，可以显著增加高表达人表皮生长因子受体-2(HER-2)的乳腺癌细胞对纳米金棒的吞噬量，提高其光热治疗效果(Nano Lett2009,9,287)。但是这种方法在实际应用中受到肿瘤表面受体表面异质性制约(仅有不足25％的乳腺癌患者肿瘤细胞高表达HER-2)。因此，需要开发一种不依赖抗原-抗体识别的靶向肿瘤的方法。肿瘤所处微环境与正常组织微环境相比偏酸性，开发pH敏感的医用纳米材料可以提供新的肿瘤靶向方法。
迄今为止尚无pH敏感的纳米金星材料的制备方法和光热治疗应用的相关文献报道。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提出一种pH敏感的纳米金星材料，表面同时修饰氨基功能化和羧基功能化的巯基聚乙二醇，可以在生物环境中保持良好的分散性，仅在酸性环境下可被细胞大量吞噬，且具有近红外光吸收和光热转化功能。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明的一种pH敏感的纳米金星材料，包括纳米金星本体，纳米金星本体的形状为多枝状星形，纳米金星本体表面修饰有氨基功能化和羧基功能化的巯基聚乙二醇，纳米金星材料的水合粒径为70～120nm。
进一步的，所述纳米金星材料的水合粒径为80～110nm。
作为优选，所述羧基功能化和氨基功能化的巯基聚乙二醇的摩尔比为1:3～5，在该比例下所得pH敏感的纳米金星材料pH响应范围在6.4～7.4，具有肿瘤弱酸性微环境靶向性。
进一步的，所述羧基功能化和氨基功能化的巯基聚乙二醇的摩尔比为1:4。
一种pH敏感的纳米金星材料的制备方法，包括以下步骤：
将球形纳米金颗粒加入氯金酸溶液，在室温搅拌条件下，向该混合液中同时加入硝酸银和抗坏血酸；球形纳米金颗粒表面附有银离子的部位比其它部位发生金还原的速度更快，这些部位生长的速度更快，形成纳米金星本体；加入氨基功能化和羧基功能化的巯基聚乙二醇溶液，通过金-巯配位作用，在纳米金星本体表面形成一层巯基聚乙二醇保护。
由于该巯基聚乙二醇层末端同时含有氨基和羟基，在不同pH条件下质子化程度不同，可使纳米金星的zeta电位随pH改变而变化，从而获得pH敏感的纳米金星。
具体来说包括以下步骤：
(1)在20mL去离子水中加入500μL0.01mol/L氯金酸，在10～30℃搅拌条件下加入200μL柠檬酸钠稳定的球形纳米金颗粒，并同时滴加80μL0.01～0.05mol/L硝酸银溶液和100μL0.1mol/L抗坏血酸溶液，反应10min后，加入40μL0.1～0.5mol/L氨基功能化和羧基功能化的巯基聚乙二醇，反应1～12h；
(2)将步骤(1)所得产物于室温下离心、水洗、转移至水中分散，形成pH敏感的纳米金星材料。
作为优选，所述步骤(1)中搅拌条件为800～1200转/分钟；氨基功能化和羧基功能化的巯基聚乙二醇的摩尔比为1:3～5；所述球形纳米金颗粒的粒径范围是14～16nm。
一种pH敏感的纳米金星材料在肿瘤光热治疗中的应用，在可吸收近红外光并转化热能的纳米金星材料表面，同时修饰氨基功能化和羧基功能化的巯基聚乙二醇，利用巯基聚乙二醇的亲水性保持纳米金星材料在不同pH生物环境中的分散性，并利用氨基和羟基在不同pH环境下质子化程度的变化，改变纳米金星材料的zeta电位，以控制细胞对纳米金星材料的吞噬量，实现靶向肿瘤微酸性环境的光热治疗。
在本发明中，pH敏感的纳米金星材料在紫外-可见光吸收光谱峰值在620～850nm之间，在近红外激光照射下温度迅速升高。
pH敏感的纳米金星材料，在pH小于或等于6.4的情况下，zeta电位大于-10mV，可被细胞大量吞噬，并在近红外激光照射下显著抑制细胞生长；在pH大于或等于7.4的情况下，zeta电位小于-10mV，不易被细胞吞噬，在近红外激光照射不会显著抑制细胞生长。
有益效果：本发明的pH敏感的纳米金星材料及其制备方法和应用，与现有技术相比，具有以下优点：
1、该纳米金星材料的zeta电位随pH改变而变化，在pH小于或等于6.4时可被细胞大量吞噬，在pH大于或等于7.4时不易被细胞吞噬，这种性质可用于识别肿瘤特征性微酸环境；
2、该纳米金星材料具有多枝状星形形貌和均一的尺寸；粒子之间无团聚，在pH6.4和ph7.4的含血清培养基均具有良好的分散性能和生物相容性；
3、该纳米金星材料的紫外-可见光吸收光谱峰值在620～850nm之间，在近红外激光照射下温度迅速升高，在肿瘤光热治疗方面具有巨大的应用潜力；
4、该纳米金星材料的制备方法可操作性强，制备效率高。
附图说明
图1本发明在实施例1的工艺条件下制得的pH敏感的纳米金星的电子显微镜照片；
图2本发明在实施例1的工艺条件下制得的pH敏感的纳米金星的紫外-可见光吸收光谱；
图3本发明在实施例1的工艺条件下制得的pH敏感的纳米金星在2W/cm2的808nm近红外激光照射下温度变化曲线；
图4在实施例1的工艺条件下制得的pH敏感的纳米金星在pH6.4条件下对细胞生长抑制作用；
图5在实施例1的工艺条件下制得的pH敏感的纳米金星在pH7.4条件下对细胞生长抑制作用。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
实施例1：水合粒径为90nm左右的pH敏感的纳米金星材料的制备和鉴定。
(1)在20mL去离子水中加入500μL0.01mol/L氯金酸，在25℃、1200转每分钟搅拌条件下加入200μL柠檬酸钠稳定的纳米金颗粒，并同时滴加80μL0.02mol/L硝酸银溶液和100μL0.1mol/L抗坏血酸溶液，反应10min后，加入40μL0.2mol/L氨基功能化和羧基功能化的巯基聚乙二醇混合液，反应3h。其中羧基功能化和氨基功能化的巯基聚乙二醇的摩尔比为1:4；
(2)将步骤(1)所得产物室温下离心、水洗、转移至水中分散，形成pH敏感的纳米金星材料，如图1所示；采用Brook haven zetaPALS粒度仪测量水合粒径；
(3)测定步骤(2)所得的pH敏感的纳米金星材料的紫外-可见光吸收光谱，如图2所示；
(4)将步骤(2)所得的pH敏感的纳米金星材料置于2W/cm2的波长为808nm的近红外激光照射下，记录温度变化如图3所示。
本实施例中得到的pH敏感的纳米金星材料，如图1所示其形貌为多枝状星形，其水合粒径约90nm，如图2所示紫外-可见光吸收光谱峰值在720nm左右，如图3所示在近红外激光照射下温度迅速升高。
实施例2：水合粒径为70nm左右的pH敏感的纳米金星材料的制备和鉴定。
(1)在20mL去离子水中加入500μL0.01mol/L氯金酸，在10℃、800转每分钟搅拌条件下加入200μL柠檬酸钠稳定的纳米金颗粒，并同时滴加80μL0.01mol/L硝酸银溶液和100μL0.1mol/L抗坏血酸溶液，反应10min后，加入40μL0.5mol/L氨基功能化和羧基功能化的巯基聚乙二醇混合液，反应1h。其中羧基功能化和氨基功能化的巯基聚乙二醇的摩尔比为1:3；
(2)将步骤(1)所得产物室温下离心、水洗、转移至水中分散，形成pH敏感的纳米金星材料；采用Brook haven zetaPALS粒度仪测量水合粒径；
(3)测定步骤(2)所得的pH敏感的纳米金星材料的紫外-可见光吸收光谱；
(4)将步骤(2)所得的pH敏感的纳米金星材料置于2W/cm2的波长为808nm的近红外激光照射下，记录温度变化。
本实施例中得到的pH敏感的纳米金星材料，其形貌为多枝状星形，其水合粒径约70nm，紫外-可见光吸收光谱峰值在620nm左右，在近红外激光照射下温度迅速升高。
实施例3：水合粒径为120nm左右的pH敏感的纳米金星材料的制备和鉴定。
(1)在20mL去离子水中加入500μL0.01mol/L氯金酸，在30℃、1200转每分钟搅拌条件下加入200μL柠檬酸钠稳定的纳米金颗粒，并同时滴加80μL0.05mol/L硝酸银溶液和100μL0.1mol/L抗坏血酸溶液，反应10min后，加入40μL0.1mol/L氨基功能化和羧基功能化的巯基聚乙二醇混合液，反应12h。其中羧基功能化和氨基功能化的巯基聚乙二醇的摩尔比为1:5；
(2)将步骤(1)所得产物室温下离心、水洗、转移至水中分散，形成pH敏感的纳米金星材料；采用Brook haven zetaPALS粒度仪测量水合粒径；
(3)测定步骤(2)所得的pH敏感的纳米金星材料的紫外-可见光吸收光谱；
(4)将步骤(2)所得的pH敏感的纳米金星材料置于2W/cm2的波长为808nm的近红外激光照射下，记录温度变化。
本实施例中得到的pH敏感的纳米金星材料，其形貌为多枝状星形，其水合粒径约120nm，紫外-可见光吸收光谱峰值在850nm左右，在近红外激光照射下温度迅速升高。
除上述实施例之外，纳米金星材料的水合粒径还可以为80nm、85nm、100nm、110nm、115nm等规格。
实施例4：pH6.4条件下本发明zeta电位、细胞吞噬量及抑制肿瘤生长作用的鉴定。
(1)配置pH6.4的0.1X PBS缓冲液：取1mL PBS，逐滴加入1mol/L HCl，pH稳定在6.4后，定容到10ml；
(2)zeta电位测量：将pH敏感的纳米金星材料溶于pH6.4的0.1X PBS缓冲液中，取1mL样品于比色皿中，采用Brook haven zetaPALS粒度仪进行测量，结果显示zeta电位为-5.96±0.77mV；
(3)配置溶于pH6.4DMEM培养基中的纳米金星：无菌条件下，缓慢搅拌条件下将DMEM培养基干粉溶于950mL去离子水，加入4.93ml7.5％NaHCO3溶液和44.37ml5.2％NaCl溶液，定容至1L，加入100ml新鲜胎牛血清，即获得pH6.4的DMEM培养基。将pH敏感的纳米金星水溶液6000g离心10min后，弃上清，重新溶解于pH6.4的DMEM培养基中，调整培养基量，获得浓度为80pM的溶于pH6.4DMEM培养基中的纳米金星。
(3)细胞培养：宫颈癌细胞株HeLa细胞置于10％胎牛血清的DMEM培养基、37℃、5％CO2饱和温度细胞培养箱中培养。细胞长至约90％融合时，弃旧培养液，加入浓度为80pM的溶于pH6.4DMEM培养基中的纳米金星，培养4h。
(4)测定纳米金星细胞吞噬量：用胰酶消化与纳米金星培养4h的细胞，重分散在1ml PBS液中。取0.5ml细胞PBS悬液，1000转每分钟离心3min后，弃上清，加入200μL细胞裂解液，4℃下超声1min后，12000转每分钟离心10min，取上清用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。剩余细胞PBS悬液加入鲜制王水消化后，用ICP测定金浓度。纳米金星细胞吞噬量＝金浓度/蛋白浓度。测量得pH6.4条件下，HeLa细胞纳米金星细胞吞噬量为0.103±0.041毫克金每克蛋白。
(5)细胞存活实验：将对数生长期的HeLa细胞接种于96孔培养板，培养16h，待细胞完全贴壁后，每孔加入浓度为80pM的溶于pH6.4DMEM培养基中的纳米金星，终体积为200μL，设三个复孔，培养4h后，弃上清，PBS漂洗3遍后，加入新鲜培养基，用2W/cm2的808nm近红外激光照射3min(暗对照组不照射激光)，之后每孔加入四甲基偶氮唑蓝(5mg/mL)20μL，继续培养4h，小心吸弃上清液，加二甲基亚砜(200μL/孔)，震荡10min后，检测A570光密度值。阴性对照组细胞不与纳米金星共培养，不照射激光。肿瘤细胞生存率＝(实验组或暗对照组平均光密度值/阴性对照组平均光密度值)*100％。结果如图4所示。
本实施例中pH敏感的纳米金星材料在pH6.4条件下，zeta电位为-5.96±0.77mV，可被HeLa细胞大量吞噬，激光照射后可以抑制肿瘤细胞生长(如图4)。
实施例5：pH7.4条件下本发明zeta电位、细胞吞噬量及抑制肿瘤生长作用的鉴定。
(1)配置pH7.4的0.1X PBS缓冲液：取1mL PBS，逐滴加入1mol/L HCl或1mol/LNaOH，pH稳定在7.4后，定容到10ml。
(2)zeta电位测量：将pH敏感的纳米金星材料溶于pH7.4的0.1X PBS缓冲液中，取1mL样品于比色皿中，采用Brook haven zetaPALS粒度仪进行测量，结果显示zeta电位为-13.51±0.87mV。
(3)配置溶于pH7.4DMEM培养基中的纳米金星：无菌条件下，缓慢搅拌条件下将DMEM培养基干粉溶于950mL去离子水，加入49.3ml7.5％NaHCO3溶液，定容至1L，加入100ml新鲜胎牛血清，即获得pH7.4的DMEM培养基。将pH敏感的纳米金星水溶液6000g离心10min后，弃上清，重新溶解于pH7.4的DMEM培养基中，调整培养基量，获得浓度为80pM的溶于pH7.4DMEM培养基中的纳米金星。
(3)细胞培养：宫颈癌细胞株HeLa细胞置于10％胎牛血清的DMEM培养基、37℃、5％CO2饱和温度细胞培养箱中培养。细胞长至约90％融合时，弃旧培养液，加入浓度为80pM的溶于pH7.4DMEM培养基中的纳米金星，培养4h。
(4)测定纳米金星细胞吞噬量：用胰酶消化与纳米金星培养4h的细胞，重分散在1ml PBS液中。取0.5ml细胞PBS悬液，1000转每分钟离心3min后，弃上清，加入200μL细胞裂解液，4℃下超声1min后，12000转每分钟离心10min，取上清用BF液测定蛋白浓度。剩余细胞PBS悬液加入鲜制王水消化后，用ICP测定金浓度。纳米金星细胞吞噬量＝金浓度/蛋白浓度。测量得pH7.4条件下，HeLa细胞纳米金星细胞吞噬量为0.343±0.024毫克金每克蛋白。
(5)细胞存活实验：将对数生长期的HeLa细胞接种于96孔培养板，培养16h，待细胞完全贴壁后，每孔加入浓度为80pM的溶于pH7.4DMEM培养基中的纳米金星，终体积为200μL，设三个复孔，培养4h后，弃上清，PBS漂洗3遍后，加入新鲜培养基，用2W/cm2的808nm近红外激光照射3min(暗对照组不照射激光)，之后每孔加入四甲基偶氮唑蓝(5mg/mL)20μL，继续培养4h，小心吸弃上清液，加二甲基亚砜(200μL/孔)，震荡10min后，检测A570光密度值。阴性对照组细胞不与纳米金星共培养，不照射激光。肿瘤细胞生存率＝(实验组或暗对照组平均光密度值/阴性对照组平均光密度值)100％。结果如图5所示。
本实施例中pH敏感的纳米金星材料在pH7.4条件下，zeta电位为-13.51±0.87mV，不易被HeLa细胞吞噬，激光照射后不会抑制细胞生长，如图5所示。
本发明的金纳米星材料在弱酸性环境中可被肿瘤细胞大量摄入，经近红外激光照射后，将吸收的光能转化为热能，使局部温度升高，杀死肿瘤细胞，达到治疗目的。而在弱碱性环境中不被细胞摄入，在近红外激光照射下不会损伤细胞。该纳米金星材料对环境pH敏感，可以通过肿瘤组织环境偏酸性的特点特异性靶向肿瘤细胞，在体外弱酸性环境下对宫颈癌细胞有显著的抑制生长作用，将来还可应用于其它肿瘤的治疗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种pH敏感的纳米金星材料，其特征在于：包括纳米金星本体，所述纳米金星本体的形状为多枝状星形，纳米金星本体表面修饰有氨基功能化和羧基功能化的巯基聚乙二醇，纳米金星材料的水合粒径为70～120nm，所述羧基功能化和氨基功能化的巯基聚乙二醇的摩尔比为1:3～5。
2.根据权利要求1所述的敏感的纳米金星材料，其特征在于：所述纳米金星材料的水合粒径为80～110nm。
3.根据权利要求1所述的敏感的纳米金星材料，其特征在于：所述羧基功能化和氨基功能化的巯基聚乙二醇的摩尔比为1:4。
4.一种pH敏感的纳米金星材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
将球形纳米金颗粒加入氯金酸溶液，在室温搅拌条件下，向该混合液中同时加入硝酸银和抗坏血酸；
球形纳米金颗粒表面附有银离子的部位比其它部位发生金还原的速度更快，这些部位生长的速度更快，形成纳米金星本体；
加入氨基功能化和羧基功能化的巯基聚乙二醇溶液，通过金-巯配位作用，在纳米金星本体表面形成一层聚乙二醇保护层，具体包括以下步骤：
(1)在20mL去离子水中加入500μL 0.01mol/L氯金酸，在10～30℃搅拌条件下加入200μL稳定的柠檬酸钠球形纳米金颗粒，并同时滴加80μL 0.01～0.05mol/L硝酸银溶液和100μL 0.1mol/L抗坏血酸溶液，反应10min后，加入40μL 0.1～0.5mol/L氨基功能化和羧基功能化的巯基聚乙二醇溶液，氨基功能化和羧基功能化的巯基聚乙二醇的摩尔比为1:3～5，反应1～12h；
(2)将步骤(1)所得产物离心、水洗、转移至水中分散，形成pH敏感的纳米金星材料。
5.根据权利要求4所述pH敏感的纳米金星材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中搅拌条件为800～1200转/分钟。
6.根据权利要求4所述pH敏感的纳米金星材料的制备方法，其特征在于：所述球形纳米金颗粒的粒径范围是14～16nm。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20160817 Termination date: 20190701 |