CN104083407B - 一种红色诺卡氏菌骨架乳化液的生产改进方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架乳化液的生产改进方法，包括如下步骤：(1)按处方进行原料配制；(2)利用高速剪切机对药液进行预处理，剪切速率为：10000‑20000rpm，剪切时间为10‑30min；(3)利用高压均质机进行均质；均质压力为：1000‑2000bar，均质次数：2‑4次；(4)对乳化液进行三级过滤，分别为：第1级为0.8‑1.0μm，第2级为0.45‑0.65μm；第3级为0.22μm。本发明所得产品不含钛粉杂质，乳化效果稳定，有利于实现除菌过滤。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域中红色诺卡氏菌细胞壁骨架乳化液的制备及过滤方法,特别指红色诺卡氏菌细胞壁骨架原粉经乳化后除菌过滤的方法。
背景技术
红色诺卡氏菌(Nocardia rubra)是具有较强免疫活性的微生物，经过细胞破碎、去除细胞内容物和细胞膜蛋白质及脂类等组份物质，得到其细胞壁骨架。红色诺卡氏菌细胞壁骨架是一种含诺卡氏霉菌酸、中性多糖以及粘肽的活性物质，可非特异性地刺激细胞免疫功能，并可促进多种细胞因子分泌，参与抗肿瘤免疫过程，用于多种肿瘤的治疗或辅助治疗。
现有技术中，红色诺卡氏菌细胞壁骨架乳化液的生产方法为在超声波仪中进行乳化，但采用该方法所得的产品存在含钛粉杂质(有黑色沉淀物)、乳化液较不稳定(通常两天就会分层)以及难以过滤的缺陷。目前国内对于红色诺卡氏菌细胞壁骨架的研究多为剂型及其治疗用途的拓展，本发明则从红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂的生产工艺着手，对其进行改进。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：目前生产工艺所得产品含钛粉杂质、乳化效果稳定性较差、难以实现除菌过滤的问题。
本发明的技术方案如下：
一种红色诺卡氏菌骨架乳化液的生产改进方法，包括如下步骤：
(1)按处方进行原料配制；
(2)利用高速剪切机对药液进行预处理，使不溶性的红色诺卡氏菌细胞壁骨架较好的分散于药液中；剪切速率为：10000-20000rpm，剪切时间为10-30min；
(3)利用高压均质机进行均质，实现红色诺卡氏菌细胞壁骨架均匀地混悬于药液中，并减小了其粒径，得到均一、稳定的乳化液；均质压力为：1000-2000bar，均质次数：2-4次；
(4)对乳化液进行三级过滤，利用不同孔径的滤芯使乳化液中大颗粒物质逐步得到去除，减轻除菌过滤滤芯的负荷，避免堵塞而影响收率；分别为：第1级为0.8-1.0μm，第2级为0.45-0.65μm；第3级为0.22μm。
在本发明的较佳实施例中，步骤(4)中，第一次过滤所用滤芯孔径为1.0μm，第二次过滤所用滤芯孔径为0.65μm，第三次过滤滤芯孔径为0.22μm。
在本发明的较佳实施例中，步骤(4)中，第一次过滤所用滤芯孔径为0.8μm，第二次过滤所用滤芯孔径为0.45μm，第三次过滤滤芯孔径为0.22μm。
在本发明的较佳实施例中，步骤(2)中，剪切速率优选为17000rpm，剪切20min。
在本发明的较佳实施例中，步骤(3)中均质压力为1500bar。
本发明提供了一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架乳化液的制备方法。本发明方法根据红色诺卡氏菌细胞壁骨架的理化特性，在按处方进行配制后，利用剪切机对配制后液体进行分散后，再利用高压均质机，对其进行均质，可以获得均一、稳定的乳化液，且外观佳：
1.利用高速剪切机剪切速率为：10000-20000rpm，剪切时间为10-30min(优选15000-17000rpm,20min)，对药液进行预处理，可以使不溶性的红色诺卡氏菌细胞壁骨架较好的分散于药液中；
2.利用高压均质机进行均质，均质压力为：1000-2000bar，均质次数：2-4次，可以实现红色诺卡氏菌细胞壁骨架均匀地混悬于药液中，不含钛粉杂质，并减小了其粒径，易于过滤，得到均一、稳定的乳化液；
3.对乳化液进行三级过滤，利用不同孔径的滤芯使乳化液中大颗粒物质逐步得到去除，减轻除菌过滤滤芯的负荷，避免堵塞而影响收率。
本发明的有益效果：
1.本发明所采用剪切机及高压均质机对红色诺卡氏菌细胞壁骨架药液进行分散及均质，有利于药液的乳化，保证药液乳化效果；
2.大大减小了红色诺卡氏菌细胞壁骨架原粉在药液中的粒径大小，明显提高除菌过滤效果；
3.高压均质乳化可连续处理，有利于提高效率与处理规模；
4.本发明采用高压均质乳化，不会带入黑色钛粉杂质，避免了现有技术污染产品的风险；
5.本发明采用的高压均质机可在恒温水浴下操作，避免了破壁过程发热升温而影响产品质量；
6.本发明采用三级过滤的方式，逐步去除药液中较大颗粒杂质，利于除菌过滤的有效进行。
本发明所得的产品为均一乳白色，且放置超过2天未出现分层现象；不含钛粉杂质(黑色沉淀)；过滤液无菌试验合格。
附图说明
图1为对比例1的结果，有黑色沉淀；
图2为实施例2的结果，无黑色沉淀。
具体实施方式
对比例1超声波乳化法(现有技术)
1.红色诺卡氏菌细胞壁骨架原粉及辅料按处方量进行准确称量、配制。
处方：
红色诺卡氏菌细胞壁骨架原粉 1g
角鲨烯 2-4ml
介质 适量
介质配方：
20％甘露醇注射液 250ml
聚山梨酯80 1-2ml
注射用水 1500-1600ml
2.超声波处理参数：
输出功率60％；每次超声时间6min；间歇6min；每次处理量500ml。
3.药液经过处理后，将乳化液转移至过滤系统中进行过滤，滤芯孔径为0.22μm。
对比例2
1.红色诺卡氏菌细胞壁骨架原粉及辅料按处方量(处方同对比例1)进行准确称量、配制。
2.将高速剪切机分散头深入药液，至底部约1-2cm，开启电源进行剪切分散。将转速调至9000rpm，剪切20min。
对比例3
1.红色诺卡氏菌细胞壁骨架原粉及辅料按处方量(处方同对比例1)进行准确称量、配制。
2.将高速剪切机分散头深入药液，至底部约1-2cm，开启电源进行剪切分散。将转速调至21000rpm，剪切20min。
实施例1
1.红色诺卡氏菌细胞壁骨架原粉及辅料按处方量(处方同对比例1)进行准确称量、配制。
2.将高速剪切机分散头深入药液，至底部约1-2cm，开启电源进行剪切分散。将转速调至17000rpm，剪切20min。
3.剪切后将药液转移至高压均质机进样杯中，开启高压均质机进行均质，工作压力为1500bar。
4.收集均质后药液，进行第二次均质。
5.药液经过两次均质后，得到均一的乳化液。将乳化液转移至过滤系统中进行过滤。过滤滤芯孔径为0.22μm。
实施例2
1.红色诺卡氏菌细胞壁骨架原粉及辅料按处方量(处方同对比例1)进行准确称量、配制。
2.将高速剪切机分散头深入药液，至底部约1-2cm，开启电源进行剪切分散。将转速调至17000rpm，剪切20min。
3.剪切后将药液转移至高压均质机进样杯中，开启高压均质机进行均质，工作压力为1500bar。
4.收集均质后药液，进行第二次均质。
5.药液经过两次均质后，得到均一的乳化液。将乳化液转移至过滤系统中进行过滤。第一次过滤所用滤芯孔径为1.0μm，第二次过滤所用滤芯孔径为0.65μm，第三次过滤滤芯孔径为0.22μm。
实施例3
1.红色诺卡氏菌细胞壁骨架原粉及辅料按处方量(处方同对比例1)进行准确称量、配制。
2.将高速剪切机分散头深入药液，至底部约1-2cm，开启电源进行剪切分散。将转速调至15000rpm，剪切20min。
3.剪切后将药液转移至高压均质机进样杯中，开启高压均质机进行均质，工作压力为1500bar。
4.收集均质后药液，进行第二次均质。
5.药液经过两次均质后，得到均一的乳化液。将乳化液转移至过滤系统中进行过滤。第一次过滤所用滤芯孔径为1.0μm，第二次过滤所用滤芯孔径为0.65μm，第三次过滤滤芯孔径为0.22μm。
实施例4
1.红色诺卡氏菌细胞壁骨架原粉及辅料按处方量(处方同对比例1)进行准确称量、配制。
2.将高速剪切机分散头深入药液，至底部约1-2cm，开启电源进行剪切分散。将转速调至20000rpm，剪切20min。
3.剪切后将药液转移至高压均质机进样杯中，开启高压均质机进行均质，工作压力为1500bar。
4.收集均质后药液，进行第二次均质。
5.药液经过两次均质后，得到均一的乳化液。将乳化液转移至过滤系统中进行过滤。第一次过滤所用滤芯孔径为1.0μm，第二次过滤所用滤芯孔径为0.65μm，第三次过滤滤芯孔径为0.22μm。
实施例5
1.红色诺卡氏菌细胞壁骨架原粉及辅料按处方量(处方同对比例1)进行准确称量、配制。
2.将高速剪切机分散头深入药液，至底部约1-2cm，开启电源进行剪切分散。将转速调至10000rpm，剪切20min。
3.剪切后将药液转移至高压均质机进样杯中，开启高压均质机进行均质，工作压力为1500bar。
4.收集均质后药液，进行第二次均质。
5.药液经过两次均质后，得到均一的乳化液。将乳化液转移至过滤系统中进行过滤。第一次过滤所用滤芯孔径为1.0μm，第二次过滤所用滤芯孔径为0.65μm，第三次过滤滤芯孔径为0.22μm。
备注：对比例及实施例进行过滤的过程中所用滤芯均为同规格的科百特囊式滤芯，滤膜材质为PES。
不同乳化方法对比
1.乳化情况
对比例1：超声波乳化过程中，药液升温很快，需在冰浴下进行。
对比例2：药液经9000rpm剪切20min后，仍可见较大的颗粒物质。
对比例3：药液在21000rpm剪切速度下出现大量起沫现象。
实施例1、2、3：乳化过程无起沫现象，均质过程压力无波动。
实施例4：药液经10000rpm剪切20min后，未见明显大颗粒物质。但药液转移至均质机进行均质后，引起均质机压力出现小幅上升现象，说明药液里颗粒粒径仍未达到均质机的要求。
实施例5：药液在20000rpm剪切速度下开始出现明显起沫现象，泡沫挂壁后破碎，药液成份滞留容器内壁上，导致药液成份的损失。
2.乳化结果对比
不同过滤方法结果对比
注：对比例2、3及实施例4、5未达到理想的乳化效果，故未进行下一步的过滤试验
通过以上对比，可见实施例2、3效果具有明显优势：A.操作时间得到缩短，提高了工作效率；B.乳化液无钛粉污染现象；C.乳化液稳定性良好，存放两天外观未见明显变化，仍呈均一乳白色；D.高压均质乳化后药液，经分级过滤可较顺利通过0.22μm滤芯，实现除菌过滤，满足GMP要求；E.采用分级过滤法在使用同规格滤芯的情况下，节省了滤芯消耗量；F.过滤时间显著缩短，提高了工作效率。
Claims (6)
1.一种红色诺卡氏菌骨架乳化液的生产改进方法，包括如下步骤：
(1)进行红色诺卡氏菌细胞壁骨架药液配制；
(2)利用高速剪切机对药液进行预处理，剪切速率为：10000-20000rpm，剪切时间为10-30min；
(3)利用高压均质机进行均质；均质压力为：1000-2000bar，均质次数：2-4次；
(4)对乳化液进行三级过滤，分别为：第1级为0.8-1.0μm，第2级为0.45-0.65μm；第3级为0.22μm。
2.如权利要求1所述的一种红色诺卡氏菌骨架乳化液的生产改进方法，其特征在于：步骤(4)中，第一次过滤所用滤芯孔径为1.0μm，第二次过滤所用滤芯孔径为0.65μm，第三次过滤滤芯孔径为0.22μm。
3.如权利要求1所述的一种红色诺卡氏菌骨架乳化液的生产改进方法，其特征在于：步骤(4)中，第一次过滤所用滤芯孔径为0.8μm，第二次过滤所用滤芯孔径为0.45μm，第三次过滤滤芯孔径为0.22μm。
4.如权利要求1所述的一种红色诺卡氏菌骨架乳化液的生产改进方法，其特征在于：步骤(2)中，剪切速率为15000-17000rpm，剪切20min。
5.如权利要求1所述的一种红色诺卡氏菌骨架乳化液的生产改进方法，其特征在于：步骤(3)中均质压力为1500bar。
6.如权利要求1所述的一种制备红色诺卡氏菌细胞壁骨架乳化液的改进方法，其特征在于：步骤(4)所用的过滤滤芯材质为亲水性滤膜，包括聚砜类或聚酰胺类或纤维素酯类或改性PTFE。
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| Novel Glycosidic Linkage between Arabinogalactan and Peptidoglycan in the Cell Wall Skeleton of Nocardia rubra AN-115;Mamoru Fujioka et al.;《Journal of General Microbiology》;19851231;第1324页"方法"第2段 * |
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