CN103709219B - 一种泰乐菌素的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属抗生素药物领域，具体涉及一种泰乐菌素的提取方法，主要包括采用二级反萃取方式将泰乐菌素分阶段从有机相转入水相，一级反萃取液加碱沉淀，分离母液后用二级反萃取液溶解，然后经离子交换树脂中和、脱色和干燥得到产品。本发明在保证产品效价高质量稳定的同时，一方面解决了通常的反萃取工艺不能有效去除杂质的问题，一方面解决了反萃取液用Ca(OH)2中和出现的一系列问题。
Description
技术领域
本发明属抗生素药物领域，具体涉及一种泰乐菌素的提取方法。
背景技术
泰乐菌素(Tylosin)是由弗氏链霉菌分泌的一种大环内酯类动物专用抗生素，又名太乐霉素或泰乐霉素。产品为白色至浅黄色粉末，在甲醇中易溶，在乙醇、丙酮、氯仿中溶解，在水中微溶，在己烷中几乎不溶。其盐类易溶于水，水溶液在25℃、pH值为5.5～7.5中可保存3个月不减效。
作为治疗药物，泰乐菌素广泛应用于畜禽支原体疾病，细菌性疾病及螺旋体病和寄生虫病的防治，是治疗畜禽支原体病的首选药物，能有效防治畜禽呼吸道和消化道感染。作为饲料添加剂，广泛应用于鸡、猪、牛等动物的饲料中，促进动物生长发育，缩短饲养周期。在生产实践中，常使用酒石酸泰乐菌素和磷酸泰乐菌素，前者主要用作饮水剂，后者主要用作饲料添加剂。
泰乐菌素主要由四种具有生物活性的组分A、B、C、D组成，其中A组分的含量最高，在动物体内的活性也最强，根据英国药典(兽药)B.P(V)-2011版的规定，泰乐菌素成品中A组分含量≥80％、总组分(A+B+C+D)＞95％。泰乐菌素各组分除了具有共同的16元环太内酯外，在其侧链的碳霉氨糖上都有一个亚氨基，因而显弱碱性。碱性条件下，以泰乐菌素碱的形式存在，易溶于有机溶媒；而在酸性条件下与酸结合成盐的形式，易溶于水。根据这一特性，目前泰乐菌素的提取工艺一般采用溶媒萃取法。具体来讲，发酵液经固液分离得到滤液，碱化至pH值9～10后用溶媒萃取到有机相，然后用磷酸或酒石酸反萃取到水相，最后经Ca(OH)2中和除去过量的酸，活性炭脱色，过滤和喷雾干燥得到磷酸泰乐菌素或酒石酸泰乐菌素。
上述提取工艺中，通常采用一步反萃取，控制水相pH值为3.5～4.0来得到相应的泰乐菌素盐，杂质并不能被有效分离。如专利CN102584921A公开了一种采用复合溶媒来萃取泰乐菌素的方法，在其实施例中虽然采用了二级反萃取，但采用的是一级反萃取控制水相pH值为4.0，二级反萃取控制水相pH值为2.3，目的仅仅是为了提高收率，且后续工艺只是简单将两次反萃取液合并，因而在反萃取过程中杂质也没有得到有效去除，特别是抗菌活性较低的B、C、D组分几乎完全随A组分一起被反萃取到水相。若发酵液中B、C、D组分过高，则上述提取过程很难使最终产品组分合格。
另外，通常的提取工艺中利用形成难溶盐的原理，采用Ca(OH)2中和来除去反萃取液中多余的磷酸或酒石酸，Ca(OH)2加量由pH计来反馈。实际生产中发现这一方法存在的不足之处主要有：(1)花费时间长。由于Ca(OH)2本身溶解度低，因而形成沉淀的反应速度慢，达到反应平衡的时间长，比如专利CN102584921A采用的就是分多次缓慢加入Ca(OH)2混悬液，每次间隔40分钟。(2)操作难于控制。由于达到反应平衡的时间长，存在着加入Ca(OH)2混悬液过量的风险，而一旦过量会直接导致产品pH值不合格以及收率下降。(3)形成的沉淀容易覆盖pH电极而影响终点判断，这进一步加大了生产风险。(4)难溶盐仍有一定溶解度，溶解于水的部分不能被过滤除去就会随溶液进入到最终产品，会造成产品残渣偏高，效价偏低。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺点和不足，发明人旨在提供一种泰乐菌素的提取方法，在保证产品效价高质量稳定的同时，一方面解决通常的反萃取工艺不能有效去除杂质的问题，一方面解决反萃取液用Ca(OH)2中和出现的一系列问题。
本发明的目的是通过以下技术方案得以实施的：
一种泰乐菌素的提取方法，包括如下步骤：
在泰乐菌素发酵滤液中加入乙酸丁酯溶媒中进行萃取，得到的萃取液采用二级反萃取进行处理，得到的合并的反萃取液加离子交换树脂中和，再经脱色、干燥得到泰乐菌素产品，其中所述的二级反萃取为：萃取液加入酒石酸调节水相pH值在5.5～6.0之间，静置分层，下层水相为一级反萃取液，上层乙酸丁酯相加入酒石酸调节水相pH值在2.5～4.0之间，静置分层，下层水相为二级反萃取液，一级反萃取液加碱结晶，分离母液后得到的晶体用二级反萃取液溶解，得到合并的反萃取液。
本发明的提取方法主要包括采用二级反萃取方式将泰乐菌素分阶段从有机相转入水相，一级反萃取液加碱沉淀，分离母液后用二级反萃取液溶解，然后经离子交换树脂中和、脱色和干燥得到产品。针对通常的反萃取工艺不能有效去除杂质的问题，本发明提出采用二级反萃取工艺，并且一级反萃取液加碱沉淀，分离母液后用二级反萃取液溶解。研究发现，在一级反萃取中转入水相的主要是泰乐菌素B、C、D等抗菌活性较低的组分，加碱沉淀后，这些组分主要留在母液当中，因而可以得到有效去除。
针对反萃取液用Ca(OH)2中和出现的一系列问题，本发明提出用阴离子交换树脂中和，然后脱色、干燥得到产品。离子交换树脂是一种具有网状立体结构的、含有高分子活性基团而能与溶液中其他物质进行交换或吸着的聚合物。按照参与交换的离子电性分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。运用阴离子交换树脂中和酸的工作原理就是先用碱把树脂再生成OH型，当反萃取液流经树脂的时候，其中的磷酸根或酒石酸根被树脂吸附，而OH-则被交换下来与溶液中的H+中和。这样就除去了反萃取液中过量的酸。运用阴离子树脂中和，具有反应速度快，溶液澄清易于操作等优点。
上述描述主要来源于如下一些实验(实验所用乙酸丁酯萃取液、酒石酸泰乐菌素等原料来源于浙江康裕生物制药有限公司泰乐菌素生产车间)：
I.泰乐菌素二级反萃取试验
取乙酸丁酯萃取液1500ml，一级反萃取：加水80ml，然后加入浓度为2％酒石酸70ml调水相pH值至5.5，静置1小时后分层，下层水相150ml为一级反萃取液，取样。对上层乙酸丁酯相进行二级反萃取：加水40ml，然后加入浓度为2％酒石酸50ml调水相pH值至4.0，静置1小时后分层，下层水相90ml为二级反萃取液，取样。以上样品稀释相同倍数后用HPLC检测各组分浓度，对每种组分，用浓度乘以体积来计算两个阶段反萃取分别转入水相的量(g)，如下表：
可见，C、B、D组分“富集”于一级反萃取液中。而二级反萃取液中主要是A组分，其含量已经符合标准。如果想提高最终产品中的A组分含量，只需想办法进一步分离除去一级反萃取液中的C、B、D组分。
II.泰乐菌素加碱结晶试验
取C、B、D组分偏高的酒石酸泰乐菌素15g，溶解于120ml水，加入5ml浓度为10％NaOH调pH值至9.0，然后50℃保温1小时，搅拌均匀，抽滤，用50℃纯化水顶洗得到275ml母液，泰乐菌素碱湿晶体烘干后为10.0g。HPLC检测，各组分归一法含量(％)结果如下：
说明经加碱结晶，C、B、D组分主要留在母液，泰乐菌素碱中的A组分含量显著提高。
III.泰乐菌素反萃取液中和对比试验
取酒石酸泰乐菌素反萃取液200ml两份，一份逐步加入浓度为10％的Ca(OH)2悬液调pH值至6.3，然后用滤纸过滤得到中和液，实验用时约110分钟。另一份经填充杭州争光树脂有限公司的D311树脂的树脂柱中和，得到混合pH值为6.3的中和液，用时20分钟。两份中和液都取样烘干后测量炽灼残渣，分别为1.87％和0.84％，说明用树脂代替Ca(OH)2来中和反萃取液，能使产品的炽灼残渣降低约1％，从而提高产品效价。
作为优选方案，根据本发明所述的一种泰乐菌素的提取方法，其中所述的一级反萃取液加碱结晶在温度40～50℃下进行。加碱结晶的温度受溶解度和稳定性两个因素制约，温度越高，泰乐菌素碱的溶解度越低，结晶收率就越高，但是温度太高，泰乐菌素碱会部分分解，稳定性降低。40～50℃是按照尽量不产生分解破坏而获得90％以上的结晶收率来确定的。
作为优选方案，根据本发明所述的一种泰乐菌素的提取方法，其中所述的一级反萃取液用NaOH调pH值至9.0～10.0进行沉淀结晶，分离母液后得到泰乐菌素碱晶体。加碱结晶的温度受溶解度和稳定性两个因素制约，温度越高，泰乐菌素碱的溶解度越低，结晶收率就越高，但是温度太高，泰乐菌素碱会部分分解，稳定性降低。也是综合考虑稳定性和结晶收率的结果。
作为优选方案，根据本发明所述的一种泰乐菌素的提取方法，其中所述的合并的反萃取液的pH值为4.5～5.0。泰乐菌素在pH4以下稳定性差，因此二级反萃取液要及时用一级反萃取液沉淀的泰乐菌素碱来中和，控制此pH是考虑稳定性和易于溶解来确定的。
作为优选方案，根据本发明所述的一种泰乐菌素的提取方法，其中所述的合并的反萃取液用树脂中和至pH6.3～6.7。主要是考虑溶解度和稳定性。
作为优选方案，根据本发明所述的一种泰乐菌素的提取方法，其中所述的树脂采用阴离子交换树脂。运用阴离子树脂中和，具有反应速度快，溶液澄清易于操作等优点。所用阴离子交换树脂包括凝胶型和大孔型。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
本发明采用二级反萃取方式将泰乐菌素分阶段从有机相转入水相，一方面解决了通常的反萃取工艺不能有效去除杂质-抗菌活性较低的B、C、D组分的问题，一方面解决了反萃取液用Ca(OH)2中和出现的一系列问题，运用阴离子树脂中和，具有反应速度快，溶液澄清易于操作等优点。
本发明的提取方法具有工艺适应性强，产品效价高、质量稳定等优点。
附图说明
图1是本发明工艺流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例中的泰乐菌素发酵滤液，来源于浙江康裕生物制药有限公司大生产放罐的发酵滤液，其制备过程为：120吨发酵罐配制培养基，灭菌、接种(本行业通用生产过程)。在pH6.0-7.0、温度28℃-37℃、空气流量800-1600m3/min、搅拌转速200rpm-300rpm的条件下培养150-200小时，放罐。发酵液经聚合氯化铝絮凝后用板框压滤，获得发酵滤液。
实施例1
一种泰乐菌素的提取方法，包括如下步骤：
萃取：泰乐菌素发酵滤液3.0L，效价为9534u/ml，A组分含量为68.4％。每次加入乙酸丁酯0.75L，用浓度为10％的NaOH调pH值至10.0，萃取两次，萃取温度为30～35℃，搅拌，萃取时间为30～60分钟。萃取结束后，剩余水相3.05L，效价为527u/ml。将两次萃取液合并，得到萃取液1.42L，效价为18436u/ml，萃取收率91.5％。
二级反萃取：取萃取液1.4L，一级反萃取：加入浓度为2％的酒石酸48ml调水相pH值至5.5，静置1小时后分层，下层水相为一级反萃取液；上层乙酸丁酯相进行二级反萃取：加入浓度为1％的酒石酸86ml调水相pH值至4.0，静置1小时后分层，水相为二级反萃取液。反萃取结束后检测乙酸丁酯相效价461u/ml。
加碱结晶：一级反萃取液48ml加9.5ml浓度为10％的NaOH调pH值至10.0，50℃保温结晶1小时，分离母液后，湿晶体用二级反萃取液溶解，得到合并的反萃取液125ml，效价198586u/ml。母液效价12714u/ml。
树脂中和，脱色和干燥：合并的反萃取液经50ml的D311树脂中和至pH值6.6，加入活性炭1.5g，搅拌脱色30分钟，加入硅藻土1.5g，搅拌5分钟后滤纸过滤，并加水30ml淋洗，得到150ml脱色液，经冷冻干燥得到酒石酸泰乐菌素26.5g，效价908u/mg，HPLC检测：A组分90.3％，总组分98.2％。
实施例2
一种泰乐菌素的提取方法，包括如下步骤：
萃取：泰乐菌素发酵滤液3.0L，效价为10487u/ml，A组分含量为56.2％。每次加入乙酸丁酯0.75L，用浓度为10％的NaOH调pH值至9.0，萃取两次，萃取温度30～35℃，搅拌，萃取时间30～60分钟。萃取结束后，剩余水相3.05L，效价436u/ml。将两次萃取液合并，得到萃取液1.41L，效价为20684u/ml，萃取收率92.7％。
二级反萃取：取萃取液1.4L，一级反萃取：加入浓度为2％的酒石酸46ml调水相pH值至6.0，静置1小时后分层。下层水相为一级反萃取液，做加碱结晶处理；上层乙酸丁酯相进行二级反萃取：加入浓度为1％的酒石酸120ml调水相pH值至2.5，静置1小时后分层，水相为二级反萃取液。反萃取结束后检测乙酸丁酯相效价407u/ml。加碱结晶：一级反萃取液46ml加9.0ml浓度为10％的NaOH调pH值至9.5，50℃保温结晶1小时，分离母液后，湿晶体用二级反萃取液溶解，得到合并的反萃取液155ml，效价178805u/ml。母液效价14532u/ml。
树脂中和，脱色和干燥：合并的反萃取液经50ml的D311树脂中和至pH值为6.3，加入活性炭1.5g，搅拌脱色30分钟，加入硅藻土1.5g，搅拌5分钟后滤纸过滤，并加水30ml淋洗，得到150ml脱色液，经冷冻干燥得到酒石酸泰乐菌素29.6g，效价903u/mg，HPLC检测：A组分90.1％，总组分97.4％。
上述实施例中的酒石酸换成磷酸可以达到同样的技术效果，不再详述。
比较例1
一种泰乐菌素的提取方法，包括如下步骤：
萃取：泰乐菌素发酵滤液3.0L，效价为9534u/ml，A组分含量为68.4％(同实施例1)。每次加入乙酸丁酯0.75L，用浓度为10％的NaOH调pH值至9.5～10，萃取两次，萃取温度30～35℃，搅拌，萃取时间30～60分钟。萃取结束后，剩余水相3.05L，效价527u/ml。将两次萃取液合并，得到萃取液1.42L，效价为18436u/ml，萃取收率91.5％。
反萃取：取萃取液1.4L，加入浓度为1％的酒石酸190ml调水相pH值至4.0，静置1小时后分层，上层乙酸丁酯相检测效价535u/ml。下层反萃取液193ml，效价126836u/ml。
Ca(OH)2中和，脱色和干燥：反萃取液经Ca(OH)2中和至pH值为6.4，加入活性炭1.5g，搅拌脱色30分钟，加入硅藻土1.5g，搅拌5分钟后滤纸过滤，并加水30ml淋洗，得到150ml脱色液，经冷冻干燥得到酒石酸泰乐菌素26.8g，效价887u/mg，HPLC检测：A组分87.3％，总组分95.3％。
上述优选实施例只是用于说明和解释本发明的内容，并不构成对本发明内容的限制。尽管发明人已经对本发明做了较为详细地列举，但是，本领域的技术人员根据发明内容部分和实施例所揭示的内容，能对所描述的具体实施例做各种各样的修改或/和补充或采用类似的方式来替代是显然的，并能实现本发明的技术效果，因此，此处不再一一赘述。本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不构成对本发明的限制。
Claims (3)
1.一种泰乐菌素产品的提取方法，其特征在于包括如下步骤：
在泰乐菌素发酵滤液中加入乙酸丁酯溶媒进行萃取，得到的萃取液采用二级反萃取进行处理，得到的合并的反萃取液加离子交换树脂中和，再经脱色、干燥得到泰乐菌素产品，其中所述的二级反萃取为：萃取液加入磷酸或酒石酸，调节水相pH值在5.5~6.0之间，静置分层，下层水相为一级反萃取液，上层乙酸丁酯相加入酒石酸调节水相pH值在2.5~4.0之间，静置分层，下层水相为二级反萃取液，一级反萃取液加碱结晶，分离母液后得到的晶体用二级反萃取液溶解，得到合并的反萃取液,
所述的泰乐菌素产品是指磷酸泰乐菌素或酒石酸泰乐菌素，
所述的一级反萃取液加碱结晶在40~50℃下进行,
所述的一级反萃取液用NaOH调pH值至9.0~10.0进行沉淀结晶，分离母液后得到泰乐菌素碱晶体,
所述的离子交换树脂采用阴离子交换树脂，为凝胶型和大孔型。
2.根据权利要求1所述的一种泰乐菌素产品的提取方法，其特征在于所述的合并的反萃取液的pH值为4.5~5.0。
3.根据权利要求1所述的一种泰乐菌素产品的提取方法，其特征在于所述的合并的反萃取液用离子交换树脂中和至pH为6.3~6.7。
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