CN104072629B - 南板蓝根多糖及其硒化修饰物和制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种南板蓝根多糖及其硒化修饰物和制备方法与应用，所公开的南板蓝根多糖，是一种杂多糖，由甘露糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖组成，5种单糖的结构单元数比例为2:3:5:6:1，所公开的硒化修饰物是南板蓝根硒多糖，由南板蓝根多糖与有机酸硒醚、氯化亚砜反应制成。基于本发明南板蓝根多糖制备的南板蓝根硒多糖对多种肿瘤细胞株具有明显的抑制作用，可用于制备治疗癌症的药物。

Description

南板蓝根多糖及其硒化修饰物和制备方法与应用

技术领域

本发明涉及到具有抑制肿瘤活性的南板蓝根硒多糖，属于药物化学领域。

背景技术

常见的板蓝根，即北板蓝根，为十字根花科植物菘蓝的干燥根，由于北板蓝根对多种病菌，包括葡萄球菌、杆菌、链球菌、双球菌均表现出良好的抑制作用，在治疗甲型流感病毒、乙型脑炎病毒、腮腺炎病毒、流感病毒等领域取得了广泛应用，尤其是解热、抗炎效果显著好于南板蓝根。

南板蓝根，为爵床科植物马蓝的干燥根，其中的游离氨基酸成分含量低于板蓝根，其在解热、抗炎、杀菌病毒和病菌方面的活性低于板蓝根，因此多年来药物领域对南板蓝根的研究资料尚少，近年来虽然有多个报道开始尝试使用南板蓝根作为药物，但是均是将其做成复方制剂从而使其具有与板蓝根类似的药理活性。

发明内容

在长期对南板蓝根进行深入研究的基础上，申请人从南板蓝根中获得了一种南板蓝根多糖成分，是一种杂多糖，深入的研究显示将该杂多糖硒化修饰后的产物具有显著的抑制肿瘤细胞活性的效果。

基于上述发现，申请人完成了本发明。

首先，本发明公开了一种南板蓝根多糖，是一种杂多糖，由甘露糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖组成，5种单糖的结构单元数比例为2:3:5:6:1。

进一步的，本发明公开了上述南板蓝根多糖的制备方法，包括下述步骤：1)用有机溶剂或水对南板蓝根进行滤提后将提取液减压浓缩，将浓缩物用有机溶剂沉淀抽滤后洗涤干燥得粗多糖；2)将粗多糖脱蛋白、脱色后用水透析，减压浓缩后加入有机溶剂沉淀过滤，洗涤沉淀物干燥得半精多糖；3)将半精多糖用氯化钠水溶液溶解后过葡聚糖凝胶柱洗脱，得到南板蓝根多糖。

其中，上述过滤和洗涤用有机溶剂为有机化学领域萃取常用有机溶剂，包括但不限于乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，考虑到成本和毒性的需要，优选采用乙醇。

其中，为了提高收率，优选进行多次滤提，合并提取液；同样的，为了保证洗涤效果，可以采用不同的有机溶剂进行多次洗涤。

其中，脱蛋白操作在本领域由多种已有的试剂盒可以实现，具体的操作方法按照相关试剂盒的使用说明即可。

其中，脱色操作也是本领域技术人员广泛周知的，通常是通过碱性溶液和双氧水进行脱色。

在上述南板蓝根多糖的基础上，申请人对其各种活性进行了研究，在研究中惊喜的发现该多糖的硒化修饰物具有良好的抑制肿瘤活性的效果，因此本发明还公开了一种南板蓝根硒多糖，是通过硒化试剂对南板蓝根多糖进行结构修饰的产物，具体的说，是由南板蓝根多糖与有机酸硒醚、氯化亚砜反应制成。

在上述反应中，氯化亚砜将有机酸硒醚酰氯化后与南板蓝根多糖反应形成稳定的酯基和C-Se键，从而将硒与多糖有效结合。

其中，各成分的用量与具体的有机酸硒醚类型相关，采用不同的有机酸硒醚可以得到不同的南板蓝根硒多糖。

优选的，所述有机酸硒醚为乙酸硒醚、丙酸硒醚，这两种原料可以通过氯乙酸或3-氯丙酸与硒粉等反应得到，制备工艺简单。

当所述有机酸硒醚为乙酸硒醚时，南板蓝根多糖与有乙酸硒醚、氯化亚砜的质量比为1:0.05～0.2:10～30，优选为1:0.1：15～20。

当所述有机酸硒醚为丙酸硒醚时，南板蓝根多糖与有丙酸硒醚、氯化亚砜的质量比为1:0.1～0.5:10～30，优选为1:0.25:15～20。

在此基础上，本发明公开了上述南板蓝根硒多糖的制备方法，包括下述步骤：1)将南板蓝根多糖加入到蒸馏水和DMF中，搅拌至充分溶解；2)将有机酸硒醚、氯化亚砜加入到DMF中溶解，在高温下搅拌反应，反应产物用DMF溶解，在冰浴中滴加到南板蓝根多糖溶液中搅拌反应，加入无水乙醇沉淀，静置，抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤并干燥后得到南板蓝根硒多糖。

在上述方法中，使用DMF溶液是一种优良的溶剂，能够使得各成分之间充分发生反应，同时对于化学反应具有一定的催化剂效果。

进一步的，步骤1)还包括在搅拌溶解后的溶液中滴加吡啶的步骤。

通过加入少量的吡啶，通常是几滴即可(0.05～0.2ml)，在化学反应中作为催化剂提高反应速度。

为了保证反应的充分进行，步骤2)还包括将反应液转移至高温下继续反应完全后冷却至室温的步骤。

在上述方法中，高温是指有机化学反应中通常所用的温度，一般是指50～80℃的范围，通过油浴或水浴提供上述温度环境。

本发明的南板蓝根硒多糖，申请人对其药学活性进行了充分研究，发现其在抑制多种肿瘤细胞活性上具有显著的效果，因此本发明还公开了所述南板蓝根硒多糖在制备治疗癌症药物中应用。

附图说明

图1为本发明南板蓝根多糖纯化过程的洗脱曲线；

图2a、2b为本发明南板蓝根多糖的NBLG1、NBLG2的洗脱曲线；

图3a、3b、3c为本发明南板蓝根多糖、南板蓝根硒多糖Ⅰ、南板蓝根硒多糖Ⅱ的红外谱图；

图4为本发明南板蓝根硒多糖的硒浓度-吸光度标准曲线。

具体实施方式

实施例1:南板蓝根多糖的提取、分离、纯化

1.1南板蓝根多糖的提取

将南板蓝根洗净、粉碎后，称取50.000g干粉于索氏提取器中，依次用石油醚回流3h后，乙醇回流4h，晾干，按提取温度为90℃、料液比1:50(g/mL)、提取时间为2h的提取条件用水提取三次，过滤，合并提取液，减压浓缩至50mL，加入四倍95％乙醇，于冰箱中静置过夜，抽滤，固体分别用无水乙醇、丙酮洗涤三次，在60℃的烘箱中烘干得粗多糖。

1.2粗多糖的脱蛋白与脱色

称取5.000g粗多糖于烧杯中，加200mL的水溶解，加入3％(w/v)的木瓜蛋白酶，调节pH为6.5，在39℃下搅拌48h，加入多糖溶液体积1/5的Savage试剂(正丁醇：氯仿＝1:4)，搅拌、离心，收集上层清液，重复操作至无变形蛋白，紫外扫描无蛋白质吸收峰为止。

在200mL的脱蛋白的多糖水溶液中加入5﹪的NaOH，调节多糖溶液pH为8，然后加入30﹪的H₂O₂溶液，使多糖溶液中过氧化氢的浓度为10﹪，室温下搅拌至无色。

将上述已脱蛋白的多糖溶液自来水透析48h后，蒸馏水透析12h，减压浓缩至50mL，加入4倍95﹪乙醇沉淀，静置过夜，过滤，沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤，干燥得半精多糖。

1.3半精多糖的纯化

将0.030g的半精多糖用8mL、0.1mol/L的氯化钠水溶液溶解，过Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱，用0.1mol/L的氯化钠水溶液洗脱，控制流速为0.5mL/min进行洗脱，并用苯酚硫酸法跟踪检测。

洗脱结果如图1所示洗脱曲线，分别收集4～7管、9～17管，记为NBLG1、NBLG2。

实施例2:南板蓝根多糖的组成分析

2.1首先采用凝胶柱层析法分析多糖的纯度

称取NBLG1、NBLG2各0.010g，溶于4mL的蒸馏水中，过Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱，用0.1mol/L的氯化钠水溶液进行洗脱，并用苯酚-浓硫酸法检测。参考图2a、2b所示的洗脱曲线，多糖NBLG1的洗脱曲线为单一对称峰，即知其为均一组分的纯多糖；多糖NBLG2的洗脱曲线有多个峰，可知其为多组分的混合多糖。

2.2然后采用比旋光度法重复验证多糖的纯度

各称取0.030g的NBLG1、NBLG2，用蒸馏水配制成15mg/mL的多糖溶液各两份，分别用4倍75％、95％乙醇进行沉淀，精确称取干燥后的固体各0.010g，溶于5mL蒸馏水后，用100mL的容量瓶定容，得到0.100g/L的多糖溶液，用旋光仪在25℃、钠光的D线下分别测其旋光度。

然后根据下述公式，计算其比旋光度。结果见表1及表2

[α]_λ ^t＝α/(c×L)

表1 NBLG1的比旋光度

表2 NBLG2的比旋光度

由表1、表2可知，在不同乙醇浓度下NBLG1的比旋光度值接近，可知其为均一组分的纯多糖；在不同乙醇浓度下NBLG2的比旋光度相差很大，可知其为多组分的混合多糖。

综合上述检测结果可以确定，本发明所得的南板蓝根多糖是一种多组分的杂多糖。

2.3在上述结果基础上，进行本发明南板蓝根多糖的单糖组成分析

采用PMP(1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮)柱前衍生化后，高效液相色谱法分析，具体步骤如下：

称取0.020g的NBLG1于试管中，加入2mL的2mol/L的硫酸，封管，90℃下水解8h，冷却，用碳酸钡中和，过滤。

分别取0.5mL的上述样品液及混合标准液(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖，每种单糖浓度为0.2mg/mL)于试管中，依次加入0.5mL0.5mol/LPMP甲醇溶液和0.5mL0.3mol/L NaOH溶液，充分振荡混匀，于70℃水浴中加热振摇反应90min，室温下冷却10min后，加0.6mL0.3mol/L的HCl中和，然后加水补充至2.5mL，用10.0mL的氯仿分两次萃取。取上层水相，过0.45μm膜，用高效液相色谱分析。

分析结果：南板蓝根多糖由甘露糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖等5种单糖组成，根据外标法得5种单糖的结构单元数比例为2:3:5:6:1。

实施例3.南板蓝根硒多糖的合成

3.1 硒醚可以根据需要从市场上购买，也可以采用下述方法快速制备

称取0.400g硒粉于两颈烧瓶中，加入10mL的蒸馏水，通入氮气保护，室温下温和搅拌，缓慢加入硼氢化钠水溶液(0.390g硼氢化钠溶于3.5mL的蒸馏水)，待硒粉完全溶解溶液变澄清后，加入氯乙酸或3-氯丙酸水溶液(将0.950g氯乙酸或1.100g3-氯丙酸溶于10mL蒸馏水中，用饱和碳酸钠调节溶液pH为9),继续搅拌反应24h。反应完毕后，过滤两次，滤液用10％的稀盐酸调节pH为3，再用乙酸乙酯萃取，取上层溶液，合并有机层，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩结晶，分别得淡黄色、黄色固体，用乙酸乙酯进行重结晶，浓缩结晶后分别得白色的乙酸硒醚、淡黄色的丙酸硒醚固体。

3.2 南板蓝根硒多糖的合成

称取0.200g的多糖于圆底烧瓶中，加入3mL蒸馏水和15mL DMF，在50℃的油浴锅中充分搅拌20h，使多糖均匀分散在溶液中，减压浓缩，加入2滴吡啶。

另取一干燥圆底烧瓶，加入干燥过的0.020g乙酸硒醚或0.050g丙酸硒醚，加入3mL的氯化亚砜、0.1mL干燥过的DMF，在70℃油浴锅中搅拌反应2h，反应完毕后减压蒸出未反应的氯化亚砜，用少量干燥的DMF溶解，在冰浴中迅速用滴管滴加到上述多糖溶液中并搅拌，滴加完毕后，继续搅拌反应10min，迅速将反应液转移至60℃的油浴锅中继续反应3h后，冷却至室温，加入5倍体积的无水乙醇沉淀，静置，抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤，50℃下干燥。

根据所用硒醚的不同，分别得黄色乙酸硒醚硒多糖(南板蓝根硒多糖Ⅰ)、棕色丙酸硒醚硒多糖(南板蓝根硒多糖Ⅱ)。

实施例4:南板蓝根硒多糖的验证

分别取南板蓝根多糖以及南板蓝根硒多糖Ⅰ、Ⅱ少许，加入KBr压片后进行红外扫描，图3a、3b、3c为所得的红外谱图。

将图3b、3c与图3a进行对比我们可以看到，图3b在1718.35、1155.96cm^-1处、图3c在1702.92、1151.87cm^-1处出现了酯基的吸收峰，且都分别在465.38、467cm^-1处附近有C-Se键的特征吸收，而图3a中没有出现。

由上述可见，在本发明的南板蓝根硒多糖中，硒与多糖有效结合在了一起。

实施例5:南板蓝根硒多糖中硒含量的测定

精确称取0.100g单质硒，溶于浓硝酸中(加入浓硝酸的量尽可能使硒刚好溶解)，加入2mL的高氯酸，于沸水浴中加热3～4h，冷却至室温后加入8.4mL的浓盐酸，继续于沸水浴中煮2min，冷去后将溶液转移至50mL的容量瓶中，用0.1mol/L的盐酸定容，得2mg/mL的硒标准液，于冰箱中保存。

取2mg/mL硒标准液1mL置于小烧杯中，加入0.1％邻苯二胺溶液8mL，再用甲酸调pH值至2，用水稀释成50mL，在阴暗处放置1h后，加8mL甲苯萃取，重复数次，萃取后的溶液用甲苯定容至100mL。

依次取0、0.5、1、2、4、6mL的上述硒标准溶液6份，在335nm处测定其吸光度，由测得的吸光度A值与Se浓度绘制标准曲线。准确称取0.010g的南板蓝根硒多糖于烧杯中，加入混酸(HClO₄：HNO₃：H₂SO₄＝1：4：1)消化24h后，按上述操作进行处理，335nm测定其吸光度，根据标准曲线计算硒多糖中硒的含量。根据图4的硒标准液浓度-吸光度的标准曲线，其回归方程为

A＝0.1382C+0.0067，(R²＝0.9991，R＝0.9995)。

根据回归方程计算得南板蓝根硒多糖Ⅰ、Ⅱ中硒含量分别为8.9、10.35mg/g。

实施例6:采用MTT法进行抗癌活性分析

将细胞株置于含10﹪的胎牛血清、1﹪的双抗的DMEM培养基中，在37℃、含5﹪的CO₂的培养箱中进行培养，每隔24h换液一次，观察细胞的生长状态。取对数期的细胞，分别用浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液消化细胞，再用培养液调整细胞浓度，使之为2×10⁴个/mL，均匀接种于96孔细胞培养板中，每孔200μL。待细胞完全贴壁后，将待测样品(南板蓝根多糖、南板蓝根硒多糖Ⅰ、南板蓝根硒多糖Ⅱ)按照5、10、20、40、60μg/mL的浓度梯度加入各孔中，每组平行3孔，且设未加药品的细胞组为阴性对照孔、不加细胞的空白对照组，在CO₂的培养箱中培养72h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，于培养箱中继续培养4h，停止培养，取走细胞液，在每孔中加入200μL的DMSO，振荡10min，用酶联免疫检测仪在492nm处测其吸光度值OD，计算其抑制率:

根据所得抑制率得各样品的IC₅₀值，如下表3所示。

表3:样品对细胞的IC₅₀值(μg/mL)

由上述可见，本发明的南板蓝根硒多糖Ⅰ、南板蓝根硒多糖Ⅱ对多种癌细胞具有显著的抑制效果(SGC－7901为人胃癌细胞，来源于人胃癌，用于胃腺癌方面研究、SMMC7721为人肝癌细胞，来源于人肝癌，用于肝癌方面的研究、Hela为人宫颈癌细胞，在医学界广泛应用于肿瘤的标准研究)，其中，南板蓝根硒多糖Ⅱ的抑制效果优于南板蓝根硒多糖Ⅰ。

Claims (9)

1.南板蓝根多糖，是一种杂多糖，由甘露糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖组成，5种单糖的结构单元数比例为2∶3∶5∶6∶1。

2.根据权利要求1的南板蓝根多糖，其特征在于由下述方法制成：1)用有机溶剂或水对南板蓝根进行滤提后将提取液减压浓缩，将浓缩物用有机溶剂沉淀抽滤后洗涤干燥得粗多糖；2)将粗多糖脱蛋白、脱色后用水透析，减压浓缩后加入有机溶剂沉淀过滤，洗涤沉淀物干燥得半精多糖；3)将半精多糖用氯化钠水溶液溶解后过葡聚糖凝胶柱洗脱，得到南板蓝根多糖。

3.根据权利要求1的南板蓝根多糖的硒化修饰物，即为南板蓝根硒多糖，其特征在于由南板蓝根多糖与有机酸硒醚、氯化亚砜反应制成。

4.根据权利要求3的南板蓝根硒多糖，其特征在于所述有机酸硒醚为乙酸硒醚，南板蓝根多糖与乙酸硒醚、氯化亚砜的质量比为1∶0.05～0.2∶10～30。

5.根据权利要求3的南板蓝根硒多糖，其特征在于所述有机酸硒醚为丙酸硒醚，南板蓝根多糖与丙酸硒醚、氯化亚砜的质量比为1∶0.1～0.5∶10～30。

6.权利要求3的南板蓝根多糖的硒化修饰物的制备方法，其特征在于包括下述步骤：1)将南板蓝根多糖加入到蒸馏水和DMF中，搅拌至充分溶解；2)将有机酸硒醚、氯化亚砜加入到DMF中溶解，在高温下搅拌反应，反应产物用DMF溶解，在冰浴中滴加到南板蓝根多糖溶液中，得到南板蓝根多糖的硒化修饰物反应液，搅拌反应，加入无水乙醇沉淀，静置，抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤并干燥后得到南板蓝根硒多糖。

7.根据权利要求6的制备方法，其特征在于步骤1)还包括在搅拌溶解后的溶液中滴加吡啶的步骤。

8.根据权利要求6的制备方法，其特征在于步骤2)还包括将南板蓝根多糖的硒化修饰物反应液转移至高温下继续反应完全后冷却至室温的步骤。

9.权利要求3的南板蓝根硒多糖在制备治疗癌症药物中应用。