CN104059875A - 中华鳖胚胎细胞组织块的原代培养方法 - Google Patents

中华鳖胚胎细胞组织块的原代培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中华鳖胚胎细胞组织块的原代培养方法。本发明步骤为：（1）采集中华鳖的受精蛋，消毒；（2）破开受精蛋的蛋壳，将胚胎从蛋黄中剥离出来，将剥离出来的胚胎组织放在1×PBS缓冲液中清洗，然后浸泡灭菌；（3）将胚胎组织放入M199培养基中清洗4-5次，然后转移至完全培养基中并将胚胎组织剪碎得组织块，再将组织块用完全培养基清洗一次；（4）用无菌的一次性接种针均匀分散组织块于细胞瓶的内壁上，使组织块贴壁生长3-4小时，然后加入完全培养基浸没组织块，30-31℃恒温培养3天以上。本发明操作简单，培养方便，无需特定的细胞分离液，培养成功率高。

Description

中华鳖胚胎细胞组织块的原代培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，特别涉及一种中华鳖胚胎细胞组织块的原代培养方法。
背景技术
中华鳖，又名水鱼、甲鱼、团鱼，是常见的养殖龟种。中华鳖生活于江河、湖沼、池塘、水库等水流平缓、鱼虾繁生的淡水水域，也常出没于大山溪中。在安静、清洁、阳光充足的水岸边活动较频繁，有时上岸但不能离水源太远。能在陆地上爬行、攀登，也能在水中自由游泳。喜晒太阳或乘凉风。民间谚语形容鳖的活动是“春天发水走上滩，夏日炎炎柳荫栖，秋天凉了入水底，冬季严寒钻泥潭”。夏季有晒甲习惯，寒冷的冬季会冬眠，翌年开始苏醒寻食。喜食鱼虾、昆虫等，也食水草、谷类等植物性食物，并特别嗜食臭鱼、烂虾等腐食，耐饥饿，但贪食且残忍，如食饵缺乏还会互相残食。性怯懦怕声响，白天潜伏水中或淤泥中，夜间出水觅食。
中华鳖是国内主要的淡水养殖品种，国内第一个淡水鱼类细胞系ZC-7901由张念慈杨广智（1981）发表在水产学报上。以后有不少淡水鱼类细胞系的建立。而中华鳖细胞体外培养也有报道。其中吴康，薛明强等（2000）发表在中国水产科学，中华鳖胚胎细胞体外培养的研究；李晓莉，曾令兵等（2010）发表在水生态学杂志上的中华鳖5种组织细胞的离体培养实验。上述方法存在操作复杂，条件较苛刻，培养成功率较低的不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一种中华鳖胚胎细胞组织块的原代培养方法，操作简单，培养方便，无需特定的细胞分离液，培养成功率高。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种中华鳖胚胎细胞组织块的原代培养方法，所述原代培养方法包括以下步骤：
（1）采集中华鳖的受精蛋，受精蛋表面用质量浓度70-75%酒精喷洒消毒。
（2）破开受精蛋的蛋壳，将胚胎从蛋黄中剥离出来，将剥离出来的胚胎组织放在1×PBS缓冲液中清洗，然后在质量浓度70-75%酒精中第一次浸泡灭菌，接着在另一质量浓度70-75%酒精中第二次浸泡灭菌。
第一次浸泡灭菌时，胚胎组织还含少量PBS液，第二次浸泡灭菌时PBS已经几乎没有了，这样胚胎组织灭菌更彻底。
（3）将胚胎组织放入M199培养基中清洗4-5次，然后转移至完全培养基中并将胚胎组织剪碎得组织块，再将组织块用完全培养基清洗一次。将胚胎组织放入M199培养基中清洗4-5次目的是把结缔组织、血块、血丝等杂物去掉，同时还具有杀菌作用。
（4）用无菌的一次性接种针均匀分散组织块于细胞瓶的内壁上，使组织块贴壁生长3-4小时，然后加入完全培养基浸没组织块，30-31℃恒温培养3天以上。本发明采用一次性接种针（灭菌）分散组织块可以有效、方便地均匀分散组织块，能高效促进细胞贴壁生长，实用性非常高。
本发明先不让完全培养基浸没组织块，而是让组织块能贴壁生长几小时后再进行，如果一开始就让完全培养基浸没组织块的话，组织块就不能贴壁生长，也就不能获得贴壁细胞。
作为优选，步骤（1）中所述受精蛋为孵化15-25天的受精蛋。此时受精蛋重量为3.5-5克，外部器官刚开始形成，细胞还未完全分化，细胞容易生长，培养的成功率高。
作为优选，步骤（2）中1×PBS缓冲液的PH为7.4，其中加入有500U/ml青霉素和500U/ml链霉素。
作为优选，步骤（2）中第一次浸泡灭菌和第二次浸泡灭菌的时间均为10-15秒。
作为优选，步骤（3）中M199培养基中加入有500U/ml青霉素和500U/ml链霉素。
作为优选，步骤（3）中完全培养基为在M199培养基中加入100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、20％胎牛血清以及2mmol/L谷氨酰氨。
本发明的有益效果是：本发明建立了中华鳖胚胎组织的原代细胞的培养方法，操作简单，培养方便，无需特定的细胞分离液，培养成功率高。用一次性接种针分散组织块可以有效、方便地均匀分散组织块，能高效促进细胞贴壁生长，实用性非常高。可推广应用于几乎所有的水产类组织原代培养。
附图说明
图1是中华鳖孵化19天的受精蛋。
图2是破开受精蛋蛋壳露出的胚胎。
图3是组织块均匀分散组织块于细胞瓶内壁的示意图。
图4是生长3天的胚胎原代组织细胞的显微视图。
图中：1、胚胎，2、组织块。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
1×PBS缓冲液、M199培养基均为市售产品。
实施例1：
一种中华鳖胚胎细胞组织块的原代培养方法，包括以下步骤：
（1）采集中华鳖孵化15天的受精蛋，受精蛋表面用质量浓度70%酒精喷洒消毒。
（2）然后用眼科剪剪破蛋壳，用眼科弯头镊子将胚胎从蛋黄中剥离出来，将剥离出来的胚胎组织放在1×PBS缓冲液（PH为7.4，其中加入有500U/ml青霉素和500U/ml链霉素）中清洗两次，然后在质量浓度70%酒精中第一次浸泡灭菌15秒，接着在另一质量浓度70%酒精中第二次浸泡灭菌15秒。
（3）将胚胎组织放入M199培养基中（M199培养基中加入有500U/ml青霉素和500U/ml链霉素）清洗5次，然后转移至完全培养基（完全培养基为在M199培养基中加入100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、20％胎牛血清以及2mmol/L谷氨酰氨）中并用眼科弯头剪刀将组织块剪成约1mm3大小的块状，再将组织块用完全培养基清洗一次。
（4）用无菌的一次性接种针（市售）均匀分散组织块于细胞瓶的内壁上，使组织块贴壁生长3小时，然后加入完全培养基浸没组织块，30℃恒温培养3天以上。
实施例2：
一种中华鳖胚胎细胞组织块的原代培养方法，包括以下步骤：
（1）采集中华鳖孵化25天的受精蛋，受精蛋表面用质量浓度75%酒精喷洒消毒。
（2）然后用眼科剪剪破蛋壳，用眼科弯头镊子将胚胎从蛋黄中剥离出来，将剥离出来的胚胎组织放在1×PBS缓冲液（PH为7.4，其中加入有500U/ml青霉素和500U/ml链霉素）中清洗两次，然后在质量浓度75%酒精中第一次浸泡灭菌10秒，接着在另一质量浓度75%酒精中第二次浸泡灭菌10秒。
（3）将胚胎组织放入M199培养基中（M199培养基中加入有500U/ml青霉素和500U/ml链霉素）清洗4次，然后转移至完全培养基（完全培养基为在M199培养基中加入100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、20％胎牛血清以及2mmol/L谷氨酰氨）中并用眼科弯头剪刀将组织块剪成约1mm3大小的块状，再将组织块用完全培养基清洗一次。
（4）用无菌的一次性接种针（市售）均匀分散组织块于细胞瓶的内壁上，使组织块贴壁生长4小时，然后加入完全培养基浸没组织块，31℃恒温培养3天以上。
实施例3：
一种中华鳖胚胎细胞组织块的原代培养方法，包括以下步骤：
（1）采集中华鳖孵化19天的受精蛋（如图1所示），受精蛋表面用质量浓度75%酒精喷洒消毒。
（2）然后用眼科剪剪破蛋壳（如图2所示），用眼科弯头镊子将胚胎从蛋黄中剥离出来，将剥离出来的胚胎组织放在1×PBS缓冲液（PH为7.4，其中加入有500U/ml青霉素和500U/ml链霉素）中清洗两次，然后在质量浓度75%酒精中第一次浸泡灭菌12秒，接着在另一质量浓度75%酒精中第二次浸泡灭菌12秒。
（3）将胚胎组织放入M199培养基中（M199培养基中加入有500U/ml青霉素和500U/ml链霉素）清洗4次，然后转移至完全培养基（完全培养基为在M199培养基中加入100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、20％胎牛血清以及2mmol/L谷氨酰氨）中并用眼科弯头剪刀将组织块剪成约1mm3大小的块状，再将组织块用完全培养基清洗一次。
（4）用无菌的一次性接种针（市售）均匀分散组织块于细胞瓶的内壁上（见图3），使组织块贴壁生长3.5小时，然后加入完全培养基浸没组织块，30℃恒温培养3天以上。
胚胎细胞一般2天以后就可以在组织块周围长出原代细胞，4天左右能长到细胞瓶表面的50％-60％。
原代细胞形态观察：在100×和400×的相差显微镜下观察细胞的外形其中胚胎细胞形状比较多（见图4），有圆形，多角形，纤维状，甚至还有心肌细胞的产生（细胞可以有节奏地收缩）。
目前中华鳖胚胎细胞已培养60多天，传代10代。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (6)

1.一种中华鳖胚胎细胞组织块的原代培养方法，其特征在于：所述原代培养方法包括以下步骤：
（1）采集中华鳖的受精蛋，受精蛋表面用质量浓度70-75%酒精喷洒消毒；
（2）破开受精蛋的蛋壳，将胚胎从蛋黄中剥离出来，将剥离出来的胚胎组织放在1×PBS缓冲液中清洗，然后在质量浓度70-75%酒精中第一次浸泡灭菌，接着在另一质量浓度70-75%酒精中第二次浸泡灭菌；
（3）将胚胎组织放入M199培养基中清洗4-5次，然后转移至完全培养基中并将胚胎组织剪碎得组织块，再将组织块用完全培养基清洗一次；
（4）用无菌的一次性接种针均匀分散组织块于细胞瓶的内壁上，使组织块贴壁生长3-4小时，然后加入完全培养基浸没组织块，30-31℃恒温培养3天以上。
2.根据权利要求1所述的原代培养方法，其特征在于：步骤（1）中所述受精蛋为孵化15-25天的受精蛋。
3.根据权利要求1或2所述的原代培养方法，其特征在于：步骤（2）中1×PBS缓冲液的PH为7.4，其中加入有500U/ml青霉素和500U/ml链霉素。
4.根据权利要求1或2所述的原代培养方法，其特征在于：步骤（2）中第一次浸泡灭菌和第二次浸泡灭菌的时间均为10-15秒。
5.根据权利要求1或2所述的原代培养方法，其特征在于：步骤（3）中M199培养基中加入有500U/ml青霉素和500U/ml链霉素。
6.根据权利要求1或2所述的原代培养方法，其特征在于：步骤（3）中完全培养基为在M199培养基中加入100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、20％胎牛血清以及2mmol/L谷氨酰氨。
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