CN104041416B - 一种利用红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用红豆杉愈伤组织产生紫杉醇的方法，以‘曼地亚’红豆杉叶片为外植体，经消毒、灭菌、接种，培养一段时间后，在叶片伤口处产生愈伤组织，继续对愈伤组织进行增殖培养。取红豆杉叶片愈伤组织研磨并用乙酸乙酯超声萃取3次，收集有机相，过滤后用旋转蒸发器减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，得到含有紫杉醇的甲醇溶液。本发明应用组织培养技术克服红豆杉植株生长缓慢、紫杉醇化学合成复杂的问题。所用基本培养基以SH培养基为基础，辅以2，4-二氯苯氧乙酸、L-脯氨酸、蔗糖等成分；为进行工厂化细胞生产紫杉醇提供基础，环境友好，原料丰富，可很好缓解市场对紫杉醇供应缺口大的问题。
Description
技术领域
本发明涉及紫杉醇的产生，特别是一种通过红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法。
背景技术
紫杉醇（Taxol），化学式为 C47H51NO14，分子量是 853.92，白色结晶体粉末，无臭，无味，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂，熔点 213～216℃。化学名称： 5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]。是从红豆杉属 (Taxus spp.) 植物中分离得到的一种具有独特抗癌作用的二萜类化合物，具有很高的开发利用价值，是经美国国家食品与药品管理中心正式批准（1992.12）的，目前世界主流的抗癌药物之一。开始，紫杉醇为晚期卵巢癌的治疗药物。随后又批准用于治疗乳腺癌。目前紫杉醇是最好的治疗卵巢癌和乳腺癌的药物，价格非常昂贵，市场售价为4800美元/克。至今为止，紫杉醇已经被成功地广泛应用于对包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、卡波氏肉瘤在内的多种恶性肿瘤的治疗。而且紫杉醇对其它肿瘤的疗效正在被进一步研究，测试证明它对其它的多种肿瘤也有潜在的疗效。
目前，生产紫杉醇原料药有以下几种途径：①直接从红豆杉树皮或整株红豆杉植株中提取；但是含有紫杉醇的自然资源---红豆杉和东非罗汉松（1999年测知含紫杉醇）---都生长地十分缓慢，数量有限且其中有效成分的含量非常低。最初，用于治疗的紫杉醇都来源于太平洋红豆杉，治疗一个病人需要6棵百年树龄的红豆杉。②半合成法，即先从红豆杉中提取前体（体包括10-脱酰基巴卡丁 III、巴卡丁 III，10-脱酰基紫杉醇，10-脱酰基三尖杉宁碱，7-戊醛基-10-脱酰基紫杉醇等），前体再进行化学半合成制得紫杉醇成品；在一定的程度上，这缓和了药源紧张的问题，但由于野生红豆杉资源濒危，原料仍然受到制约。③全合成法，但由于步骤多，成本高尚未投入生产；④生物反应器法：培养寄生在红豆杉树木身上的某些真菌来获取紫杉醇。⑤培养能产生紫杉醇的红豆杉细胞来生产紫杉醇。其中培养红豆杉内生真菌和红豆杉细胞法生产紫杉醇属于“环境友好型”工艺，对环境无污染，利用来源丰富的淀粉类原料，属于绿色农产品原料。科学家普遍认为，真菌生物反应器法和红豆杉细胞法生产紫杉醇代表着紫杉醇生产的未来方向。
发明内容
针对紫杉醇原料药市场缺口较大的问题，本发明目的是提供一种通过红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法。
本发明的技术方案是：
一种利用红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法，以红豆杉叶片为外植体，经灭菌、接种、诱导红豆杉叶片愈伤组织，再培养红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法。
前面所述的方法，优选的方案在于：步骤如下：
A、外植体的选择和灭菌处理：以‘曼地亚’红豆杉（Taxus media）叶片为外植体，以2%洗洁精浸泡，摇床120-180转摇15-20分钟，再用清水冲洗，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1%的氯化汞中，浸泡灭菌8-15分钟，无菌水冲洗7-8次，备用；
B、外植体接种：将经过步骤A中准备的外植体叶片，接种在含有所用基本培养基以SH培养基为基础，添加了2，4-D、 L-脯氨酸的培养基中；
C、愈伤组织的诱导：将经过步骤B中得到的外植体叶片，培养于2，4-D 3.0-5.0mg/L、 L-脯氨酸300-500 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.85-5.95，至出现红豆杉叶片愈伤组织；
D、愈伤组织培养： 将步骤C中得到的红豆杉叶片愈伤组织接种于SH+2，4-D1.0-3.0 mg/L +L-脯氨酸300-500 mg/L的培养基中，培养温度为21±2℃，光照强度为1000-1600Lux，光照时间为14小时，培养时间为10-15天。培养10-15天后检测愈伤组织中紫杉醇含量；
E、紫杉醇提取：将步骤D中的愈伤组织用液氮研磨并用乙酸乙酯超声萃取3次，超声处理时间为25-35min，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35℃下旋蒸至液体全部蒸发，残留物体用溶解于少量甲醇中，0.45μm滤膜过滤。，定容至10mL备用；
F、紫杉醇提取含量检测：经HPLC检测，真菌产生的愈伤组织中含有紫杉醇，平均含量为3.24mg/L。
前面所述的方法，优选的方案在于：所述的红豆杉为红豆杉科红豆杉属植物‘曼地亚’红豆杉（Taxus media）。
前面所述的方法，优选的方案在于：步骤A、外植体的选择和灭菌处理时：以2%洗洁精浸泡，摇床120-180转摇15-20分钟，用清水冲洗时间为15-30分钟，浸泡灭菌时间为8-15分钟，无菌去离子水冲洗次数为6-8次。
前面所述的方法，优选的方案在于：步骤B、C外植体接种时：培养基为SH+2，4-D 3.0-5.0mg/L+ L-脯氨酸300-500 mg/L。愈伤组织的诱导时：培养温度为21±2℃，光照强度为1000-1600Lux，光照时间为14小时，诱导时间为3-10天。
前面所述的方法，优选的方案在于：步骤D时，培养基为：SH+2，4-D1.0-3.0 mg/L +L-脯氨酸300-500 mg/L的培养基中，培养温度为21±2℃，光照强度为1600Lux，光照时间为10-14小时，培养时间为10-15天。
前面所述的方法，优选的方案在于：步骤E、紫杉醇提取：超声处理时间为25-35min，滤膜过滤时用0.45μm滤膜。
前面所述的方法，优选的方案在于：步骤F、紫杉醇提取含量检测：色谱条件为：C18柱 ：250mm×46mm ；流动相，甲醇：水(v/v)=60：40；压力：1506PSI=10.39MPa；保护压力：100LO-Pr；流速O．7mL/ min，检测波长228nm，灵敏度，0.1AUf's，柱温35℃。
本发明提供的是一种利用红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法，以‘曼地亚’红豆杉叶片为材料，经75%酒精杀毒，0.1%氯化汞灭菌处理，置于含有2，4-D3.0-5.0 mg/L +L-脯氨酸300-500 mg/L的培养基中，待愈伤组织诱导出来以后继代于2，4-D1.0-3.0 mg/L +L-脯氨酸300-500 mg/L的培养基的SH培养基中。培养15天后，进行紫杉醇提取。将愈伤组织用液氮研磨并用乙酸乙酯超声萃取3次，超声处理时间为25-35min，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35℃下旋蒸至液体全部蒸发，残留物体用溶解于少量甲醇中，0.45μm滤膜过滤。，定容至10mL备用。；经HPLC检测，真菌产生的愈伤组织中含有紫杉醇，平均含量为3.24mg/L。
具体包括下列步骤：
A）以‘曼地亚’红豆杉叶片为材料，2%～3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗，经75%酒精杀毒，0.1%氯化汞灭菌处理8-15分钟，置于含有2，4-D 3.0-5.0mg/L、 L-脯氨酸300-500 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8；
B）培养5-7天后，将红豆杉叶片愈伤组织接种于SH+2，4-D1.0-3.0 mg/L +L-脯氨酸300-500 mg/L的培养基中，培养温度为21±2℃，光照强度为1000-1600Lux，光照时间为14小时，培养时间为10-15天。
C）培养10-15天后检测紫杉醇含量，愈伤组织经液氮研磨，用等体积的乙酸乙酯萃取，超声30min收集有机相。取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取1次，收集有机相。重复处理1次。将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35℃下减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用。
E）经HPLC检测，叶片诱导产生的愈伤组织中含有紫杉醇，平均含量为3.24mg/L。
步骤A）所述的红豆杉基源植物为‘曼地亚’红豆杉（Taxus media），取幼嫩叶片为外植体，2%～3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗，外植体经75%酒精杀毒30秒，再经0.1%氯化汞灭菌处理10分钟，置于2，4-D 3.0-5.0mg/L、 L-脯氨酸300-500 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.85-5.95；
SH培养基为Schenk and Hildebrandt基本培养基，所述的SH培养基的成分按常规为：硝酸钾（KNO3）2500.00 mg/L，硫酸镁（MgSO4）195.05 mg/L，磷酸二氢铵 [(NH4) H2 PO4 ]300.00 mg/L，氯化钙（CaCl2）151.00 mg/L，氯化钴（CoCl2·6H2O）0.10 mg/L，硫酸铜（CuSO4·5H2O）0. 20mg/L，硼酸（H3BO3）5.0 mg/L，碘化钾（KI）1.00 mg/L，硫酸锰（MnSO4·H2O）10.00 mg/L，钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）0.10 mg/L，硫酸锌（ZnSO4·7H2O）1.00 mg/L，硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）27.8 mg/L，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L，甘氨酸2.00 mg/L，盐酸硫胺素(维生素B1) 0.10 mg/L，盐酸吡哆醇(维生素B6) 0.50mg/L，IVB烟酸0.5 mg/L，肌醇100 mg/L。
步骤B）培养5-7天后，将红豆杉叶片愈伤组织接种于SH+2，4-D1.0-3.0 mg/L +L-脯氨酸300-500 mg/L的培养基中，培养温度为21±2℃，光照强度为1000-1600Lux，光照时间为14小时，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8。培养时间为10-15天。
步骤C）培养10-15天后检测紫杉醇含量，愈伤组织经液氮研磨，用等体积的乙酸乙酯萃取，超声30min收集有机相。取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取1次，收集有机相。重复处理1次。将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35℃下减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用。
步骤D）经HPLC检测，叶片诱导产生的愈伤组织中含有紫杉醇，平均含量为3.24mg/L。其中色谱条件为：C18柱 ：250mm×46mm ；流动相，甲醇：水(v/v)=60：40；压力：1506PSI=10.39MPa；保护压力：100LO-Pr； 流速O．7mL/ min，检测波长228nm，灵敏度，0.1AUf's，柱温35℃。
本发明利用红豆杉愈伤组织产生紫杉醇在以下四个方面具有重要意义：本发明应用真菌培养技术紫杉醇化学合成复杂的问题：
（1）愈伤组织生长迅速，能够在生物反应器中工业化生产，本发明为进行工厂化植物细胞生产紫杉醇提供技术基础，占用空间小、培养简单、成本相对较低；不受地区、季节、气候限制，一年四季均可生产；（2）克服红豆杉植株生长缓慢，可缓解红豆杉植物资源濒危及严重不足的问题；（3）环境友好、原料丰富，可很好缓解市场对紫杉醇供应缺口大的问题；（4）愈伤组织育种和选育速度很高，可以通过基因工程等方法筛选高产细胞株系，提高愈伤组织的生产能力，提高紫杉醇的产量。
本发明所用培养基配制简单，诱发时间短、愈伤组织生长快、紫杉醇含量高，易于操作、大规模生产。
本发明以‘曼地亚’红豆杉叶片为材料，开展以红豆杉叶片培养愈伤组织的工作，这为保护红豆杉种质资源，促进利用生物反应器方法获取紫杉醇提供了一条新途径，为解决紫杉醇生产中红豆杉原料的短缺、提高紫杉醇产量，提供植物细胞生物反应器生产的方法。
具体实施方式
下面结合实施例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。
实施例1
一种利用红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法，包括下列步骤：
A）‘曼地亚’红豆杉叶片用2%的洗洁精溶液进行浸泡，摇床100-150转摇15分钟，再用清水冲洗15分钟，再将冲洗后的外植体经75%酒精杀毒30s，置于浓度为0.1%的氯化汞中，浸泡灭菌9分钟，无菌去离子水冲洗8次，接种于含有2，4-D 3.0mg/L、 L-脯氨酸300 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8；
B）培养5天后，将红豆杉叶片愈伤组织接种于SH+2，4-D1.0 mg/L +L-脯氨酸300mg/L的培养基中，培养温度为21±2℃，光照强度为1200Lux，光照时间为14小时，培养时间为10天。
C）培养10-15天后检测紫杉醇含量，愈伤组织经液氮研磨，用等体积的乙酸乙酯萃取，超声30min收集有机相。取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取1次，收集有机相。重复处理1次。将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35℃下减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用。
E）经HPLC检测，叶片诱导产生的愈伤组织中含有紫杉醇，平均含量为2.98mg/L。
实施例2
一种利用红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法，包括下列步骤：
A）‘曼地亚’红豆杉叶片用2%的洗洁精溶液进行浸泡，摇床100-150转摇16分钟，再用清水冲洗18分钟，再将冲洗后的外植体经75%酒精杀毒30s，置于浓度为0.1%的氯化汞中，浸泡灭菌10分钟，无菌去离子水冲洗8次，接种于含有2，4-D 4.0mg/L、 L-脯氨酸400 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8；
B）培养5天后，将红豆杉叶片愈伤组织接种于SH+2，4-D3.0 mg/L +L-脯氨酸300mg/L的培养基中，培养温度为21±2℃，光照强度为1300Lux，光照时间为14小时，培养时间为10天。
C）培养13天后检测紫杉醇含量，愈伤组织经液氮研磨，用等体积的乙酸乙酯萃取，超声30min收集有机相。取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取1次，收集有机相。重复处理1次。将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35℃下减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用。
E）经HPLC检测，叶片诱导产生的愈伤组织中含有紫杉醇，平均含量为3.31mg/L。
实施例3
一种利用红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法，包括下列步骤：
A）‘曼地亚’红豆杉叶片用2%的洗洁精溶液进行浸泡，摇床130转摇15分钟，再用清水冲洗20分钟，再将冲洗后的外植体经75%酒精杀毒30s，置于浓度为0.1%的氯化汞中，浸泡灭菌11分钟，无菌去离子水冲洗6次，接种于含有2，4-D 5.0mg/L、 L-脯氨酸400 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8；
B）培养7天后，将红豆杉叶片愈伤组织接种于SH+2，4-D1.0 mg/L +L-脯氨酸300mg/L的培养基中，培养温度为21±2℃，光照强度为1300Lux，光照时间为12小时，培养时间为15天。
C）培养15天后检测紫杉醇含量，愈伤组织经液氮研磨，用等体积的乙酸乙酯萃取，超声30min收集有机相。取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取1次，收集有机相。重复处理1次。将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35℃下减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用。
E）经HPLC检测，叶片诱导产生的愈伤组织中含有紫杉醇，平均含量为3.68mg/L。
实施例4
一种利用红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法，包括下列步骤：
A）‘曼地亚’红豆杉叶片用3%的洗洁精溶液进行浸泡，摇床150转摇12分钟，再用清水冲洗15分钟，再将冲洗后的外植体经75%酒精杀毒30s，置于浓度为0.1%的氯化汞中，浸泡灭菌10分钟，无菌去离子水冲洗8次，接种于含有2，4-D4.0mg/L、 L-脯氨酸500 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.9；
B）培养7天后，将红豆杉叶片愈伤组织接种于SH+2，4-D2.0 mg/L +L-脯氨酸100mg/L的培养基中，培养温度为21±2℃，光照强度为1300Lux，光照时间为14小时，培养时间为10天。
C）培养10天后检测紫杉醇含量，愈伤组织经液氮研磨，用等体积的乙酸乙酯萃取，超声30min收集有机相。取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取1次，收集有机相。重复处理1次。将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35℃下减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用。
E）经HPLC检测，叶片诱导产生的愈伤组织中含有紫杉醇，平均含量为2.98mg/L。
本发明的完成是基于聊城大学博士科研启动经费和国家自然科学基金（ 项目批号31301802）的资助。
Claims (3)
1.一种利用红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法，其特征在于：步骤如下：
A、外植体的选择和灭菌处理：以红豆杉叶片为外植体，以洗洁精浸泡，摇床100-150转摇15-20分钟，再用清水冲洗，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1%的氯化汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗，备用；
B、外植体接种：将经过步骤A中准备的外植体叶片，接种在培养基中；所述培养基为2，4-D 3.0-5.0mg/L、 L-脯氨酸300-500 mg/L的SH培养基；
C、愈伤组织的诱导：将经过步骤B中得到的外植体叶片，培养于2，4-D 3.0-5.0mg/L、 L-脯氨酸300-500 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.85-5.95，至出现红豆杉叶片愈伤组织；
D、愈伤组织培养：将步骤C中得到的红豆杉叶片愈伤组织接种于SH+2，4-D1.0-3.0 mg/L +L -脯氨酸300-500 mg/L的培养基中，培养温度为21±2℃，光照强度为1000-1600Lux，光照时间为10-14小时，培养时间为10-15天；培养10-15天后检测愈伤组织中紫杉醇含量；
E、紫杉醇提取：将步骤D中的愈伤组织用液氮研磨并用乙酸乙酯超声萃取3次，超声处理时间为25-35min，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35℃下旋蒸至液体全部蒸发，残留物体溶解于少量甲醇中，0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用；
F、紫杉醇提取含量检测：经HPLC检测，叶片产生的愈伤组织中含有紫杉醇，平均含量为3.24mg/L；
所述的SH培养基：硝酸钾KNO3 2500.00 mg/L，硫酸镁MgSO4 195.05 mg/L，磷酸二氢铵(NH4) H2PO4 300.00 mg/L，氯化钙CaCl2 151.00 mg/L，氯化钴CoCl2·6H2O 0.10 mg/L，硫酸铜CuSO4·5H2O 0. 20mg/L，硼酸H3BO3 5.0 mg/L，碘化钾KI 1.00 mg/L，硫酸锰 MnSO4H2O 10.00 mg/L，钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.10 mg/L，硫酸锌 ZnSO47H2O 1.00 mg/L，硫酸亚铁FeSO47H2O 27.8 mg/L，Na2-EDTA2H2O 37.3mg/L，甘氨酸2.00 mg/L，盐酸硫胺素，即维生素B1 0.10 mg/L，盐酸吡哆醇，即维生素B6 0.50mg/L，IVB烟酸0.5 mg/L，肌醇100 mg/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的红豆杉为红豆杉科红豆杉属植物‘曼地亚’红豆杉。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤B外植体接种时：培养时间为3-10天。
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