CN105830924B - 一种黄樟油素型樟树嫩枝组培繁殖方法 - Google Patents

一种黄樟油素型樟树嫩枝组培繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄樟油素型樟树嫩枝组培繁殖方法，其特征在于：包括外植体选择、外植体处理、初始芽诱导培养、增殖培养、壮芽培养和生根培养工序，采集黄樟油素型樟树的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体，对外植体进行修剪、灭菌消毒处理后接种于初始芽诱导培养基中获取初始芽，再将初始芽接种于增殖培养基中经过4‑5个周期增殖培养，形成丛生芽，将丛生芽接入壮芽培养基中培养，最后将高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根。本发明操作过程简便，培养周期短，继代芽产量大,并且质量优，增殖系数达到5以上，达到组培苗产业化技术要求，具有很好的经济效益、生态效益和社会效益。

Description

一种黄樟油素型樟树嫩枝组培繁殖方法
技术领域
本发明属于植物繁殖技术领域，涉及樟树组织培养技术，尤其是涉及一种黄樟油素型樟树嫩枝组培繁殖方法。
背景技术
黄樟油素型樟树是樟科樟树属樟树类的一种化学型樟树（Cinnamomum camphora(L.)Presl）又名香樟，国家Ⅱ级保护植物，主要分布于江西、湖南、广东、福建、海南、广西、四川、台湾等地，越南、韩国及日本也有分布。生长于丘陵及低山地带。是一种集材用、油用、香精香料、药用、风景园林等于一体的多用途优良树种。黄樟油素具有树木特有的香气，是一种极为有用的天然香，是合成洋茉莉醛( Heliotropine) 、胡椒基丁醚( Piperonylbutoxide，PB) 、胡椒基丙酮( Ducinylrecryst) 、香兰素( Vanillin) 等产品的理想原料，也是重要制药中间体，广泛用于轻化、香料、医药等工业生产中。随着社会经济的水平提高，生活质量的提升，人们回归大自然意识的加强，以天然黄樟油素为原料合成的绿色原生态产品价格一路盘升，市场发展前景看好。传统的黄樟油素从树根、树干中提取, 大量伐树，挖根提油。这种“杀鸡取卵，挖根取料”的方法，一方面破坏了生态环境，另一方面使资源不断匮乏，不符合国家对自然资源永续利的要求。开发留主干，砍伐樟树枝叶提取黄樟树油素的方法，既可避免掠夺式利用黄樟树油素原料资源，又有利于林地水土保持，培育樟树珍贵大径材，资源最大化的利用。
发明内容
本发明的目的是针对黄樟油素型樟树组织培养过程中初代芽褐化或玻璃化严重至死，芽增殖系数低，生长缓慢等问题,提供一种生长效果好、扩繁快的黄樟油素型樟树嫩枝组培繁殖方法。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种黄樟油素型樟树嫩枝组培繁殖方法，其特征在于：包括外植体选择、外植体处理、初始芽诱导培养、增殖培养、壮芽培养和生根培养工序，采集黄樟油素型樟树的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体，对外植体进行修剪、灭菌消毒处理后接种于初始芽诱导培养基中获取初始芽，再将初始芽接种于增殖培养基中经过4-5个周期增殖培养，形成丛生芽，将丛生芽接入壮芽培养基中培养，最后将高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根，具体操作步骤如下：
（1）外植体选择：在至少连续3天晴朗的气候里，采集黄樟油素型樟树的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体；
（2）外植体处理：将外植体置于自来水下冲洗10-15 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.1%的甲氨基阿维菌素苯甲酸盐溶液中，控制浸泡时间15-20min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，对外植体消毒，备用；
（3）初始芽诱导培养：将步骤（2）得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，初始芽诱导培养方法为：首先将接种好的外植体置于4-8 ℃的低温环境,暗培养8-10 d，再转入温度22-25 ℃,光照强度1000-2000 lux,光照10-12 h/d的条件下培养，培养40-50 d，初始芽萌发、生长；
（4）增殖培养：将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养方法为：将接种好的初始芽置于温度25-30 ℃，光照强度2000-3000 lux，光照12-14 h/d的条件下培养，35-40 d转接一次，循环往复，经4-5个周期的培养，形成丛生芽；
（5）壮芽培养：将步骤（4）得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，置于温度25-30 ℃，光照强度4000-7000 lux，光照12-14 h/d的环境中培养，培养35-40d，形成壮芽；
（6）生根培养：将步骤（5）得到的高≥2cm的单芽插入常规的生根培养基中诱导生根；余下小芽丛再次接种于步骤（4）的增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（5），循环往复，获得大量壮芽。
以上步骤（1）所述的黄樟油素型樟树的选择方法是：在林分、绿化带或零星分布的樟树中，选择干型通直圆满，树冠枝叶茂盛，生长快，用鼻子闻树木的叶片，樟木味道浓厚的单株,采其单株叶片回室内进行黄樟油素定量定性分析，叶片叶油得率1.5%以上，叶油黄樟油素含量90 %以上的植株确定为黄樟油素型樟树。
以上步骤（2）所述的外植体消毒的具体操作步骤为：在无菌条件下，将外植体置于体积浓度3%的次氯酸钠溶液中浸泡13-15 min，用无菌水冲洗外植体4-5次，再用体积浓度0.2 % HgCl2+50 mg/L VC+20 mg/L偏二亚硫酸钠的混合溶液对外植体灭菌消毒8-15 min，无菌水冲洗后置于无菌滤纸上吸干水。
以上所述的初始芽诱导培养基的配方为：改良ER培养基十6-BA 6.0-8.0 mg/L十NAA 2.0-3.0 mg/L十KT 1.0-2.0 mg/L十ZT 1.5-2.0 mg/L十 VC 15 mg/L 十L-半胱氨酸20mg/L +叶酸10mg/L十VB2 15 mg/十琼脂粉3.6 g/L十蔗糖20 g/L。
以上所述的增殖培养基的配方为：改良ER培养基十6-BA 6.0-8.0 mg/L十NAA2.0-3.0 mg/L十ZT 0.5-1.0 mg/L十VC 15 mg/L十VB2 15 mg十L-半胱氨酸 20 mg/L十琼脂粉 3.6 g/L十蔗糖 30 g/L。
以上所述的壮芽培养基的配方为：改良ER培养基十6-BA 3.0-4.0 mg/L十NAA1.0-1.5 mg/L十VC 15 mg/L十VB2 15 mg十L-半胱氨酸 20 mg/L十琼脂粉 3.6 g/L十蔗糖30 g/L。
以上所述的改良ER培养基的配方为：NH4NO3 1200 mg/L十KNO3 1900 mg/L十CaCl2·2H2O 440 mg/L十MgSO4.·7H2O 370 mg/L十KH2PO4 340 mg/L十H3BO3 0.63 mg/L十MnSO4.·4H2O 22.3 mg/L十ZnSO4·4H2O 8.64 mg/L十Na2MoO4·H2O 0.025 mg/L十CuSO4.·5H2O 0.0025 mg/L十CoCl2·6H2O 0.0025 mg/L十FeSO4 27.8 mg/L十NaEDTA 37.3 mg/L十肌醇 50 mg/L十烟酸 0.5 mg/L十盐酸吡哆醇0 .5 mg/L十甘氨酸 2 mg/L。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
1、本发明是在樟树林中选出干型通直圆满，树冠枝叶茂盛，生长迅速，枝叶定量定性分析出油率≥1.5%，叶油中黄樟油素含量等指标符合QB/T1032-1991技术要求的樟树单株作为优良单株基础上，选取当年生嫩枝为组培繁殖材料，建立一种黄樟油素型樟树茎段组培方法；本方法对加快黄樟油素型樟树优质壮苗的生产，促进国家工艺用材和香原料林产业快速发展，调整林业品种结构，改善大面积桉树无性系林造成的脆弱森林生态系统均具有重要意义。
2、本发明以黄樟油素型樟树的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体，经过初始芽培养基培养，初始芽萌动率70-85%；经过4-5个周期增殖培养，形成丛生芽，芽增殖系数5/30d-8/30d，再将丛生芽接入壮芽培养基中培养，最后将高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根，从而缩短了黄樟油素型樟树的育苗周期，节省育苗材料，克服了传统育苗方法中存在的育苗所需材料多、周期长等问题，大大降低了生产成本，提高了生产效率。
3、本发明将高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根，余下小芽丛继续增殖培养，使得材料能够多次继代，实现大量增殖，规模化生产壮芽，实现黄樟油素型樟树的扩繁。
4、本发明对ER基本培养基进行了改良，同时重点调整了与黄樟油素型樟树出芽壮芽相关锌微量元素和有机成分肌醇，使得培养基更科学，更有针对性，更易促使黄樟油素型樟树芽诱导的发生、增殖和壮芽，效果显著。
5、本发明操作过程简便，培养周期短，继代芽产量大,并且质量优，增殖系数达到5以上的组培苗产业化技术要求，具有很好的经济效益、生态效益和社会效益。
附图说明
图1为本发明的黄樟油素型樟树茎段组培诱导芽。
图2为本发明的黄樟油素型樟树茎段组培增殖芽。
图3为本发明的黄樟油素型樟树茎段组培壮芽。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
在林分、绿化带或零星分布的樟树中，选择干型通直圆满，树冠枝叶茂盛，生长快，用鼻子闻树木的叶片，樟木味道浓厚的单株,采其单株叶片回室内进行黄樟油素定量定性分析，叶片叶油得率1.5%以上，叶油黄樟油素含量90 %以上的植株确定为黄樟油素型樟树。在2014年4月连续3天晴朗的气候里，采集黄樟油素型樟树的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体。将外植体置于自来水下冲洗10 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.1%的甲氨基阿维菌素苯甲酸盐溶液中，控制浸泡时间15 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-2.0 cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内。在无菌条件下，将外植体置于体积浓度3%的次氯酸钠溶液中浸泡13 min，用无菌水冲洗外植体4次，再用体积浓度0.2 % HgCl2+50 mg/L VC+20 mg/L偏二亚硫酸钠的混合溶液对外植体灭菌消毒8-10 min，无菌水冲洗后置于无菌滤纸上吸干水。
将消毒灭菌后得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，初始芽诱导培养基的配方为：改良ER培养基十6-BA 7.5 mg/L十NAA 2.5 mg/L十KT 2.0 mg/L十ZT 1.5 mg/L十 VC 15 mg/L 十L-半胱氨酸20mg/L +叶酸10mg/L十VB2 15 mg/十琼脂粉3.6 g/L十蔗糖20 g/L。初始芽诱导培养方法为：首先将接种好的外植体置于4-6 ℃的低温环境,暗培养8d，再转入温度22-25 ℃,光照强度1000-2000 lux,光照10 h/d的条件下培养，培养50 d，初始芽萌发、生长，茎段腋芽萌动率85%。
将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养基的配方为：改良ER培养基十6-BA 8.0 mg/L十NAA 2.0 mg/L十ZT 0.5 mg/L十VC 15 mg/L十VB2 15 mg十L-半胱氨酸 20 mg/L十琼脂粉 3.6 g/L十蔗糖 30 g/L。增殖培养方法为：将接种好的初始芽置于温度25-30 ℃，光照强度2000-3000 lux，光照14 h/d的条件下培养，40 d转接一次，循环往复，经4-5个周期的培养，形成丛生芽，芽增殖系数8/30d。
将得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，置于温度25-30 ℃，光照强度4000-5000 lux，光照12 h/d的环境中培养，培养35 d，形成壮芽。所述的壮芽培养基的配方为：改良ER培养基十6-BA 3.5 mg/L十NAA 1.3 mg/L十VC 15 mg/L十VB2 15 mg十L-半胱氨酸 20 mg/L十琼脂粉 3.6 g/L十蔗糖 30 g/L。
将经壮芽培养后得到的高≥2cm的单芽插入常规的生根培养基中诱导生根；余下小芽丛再次接种于增殖培养基中继续增殖，然后再重复壮芽培养，循环往复，获得大量壮芽。
以上所述的改良ER培养基的配方为：NH4NO3 1200 mg/L十KNO3 1900 mg/L十CaCl2·2H2O 440 mg/L十MgSO4.·7H2O 370 mg/L十KH2PO4 340 mg/L十H3BO3 0.63 mg/L十MnSO4.·4H2O 22.3 mg/L十ZnSO4·4H2O 8.64 mg/L十Na2MoO4·H2O 0.025 mg/L十CuSO4.·5H2O 0.0025 mg/L十CoCl2·6H2O 0.0025 mg/L十FeSO4 27.8 mg/L十NaEDTA 37.3 mg/L十肌醇 50 mg/L十烟酸 0.5 mg/L十盐酸吡哆醇0 .5 mg/L十甘氨酸 2 mg/L。
实施例2：
在林分、绿化带或零星分布的樟树中，选择干型通直圆满，树冠枝叶茂盛，生长快，用鼻子闻树木的叶片，樟木味道浓厚的单株,采其单株叶片回室内进行黄樟油素定量定性分析，叶片叶油得率1.5%以上，叶油黄樟油素含量90 %以上的植株确定为黄樟油素型樟树。在2014年5月连续4天晴朗的气候里，采集黄樟油素型樟树的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体。将外植体置于自来水下冲洗12 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.1%的甲氨基阿维菌素苯甲酸盐溶液中，控制浸泡时间150 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-2.5 cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内。在无菌条件下，将外植体置于体积浓度3%的次氯酸钠溶液中浸泡13 min，用无菌水冲洗外植体4次，再用体积浓度0.2 % HgCl2+50 mg/L VC+20 mg/L偏二亚硫酸钠的混合溶液对外植体灭菌消毒10-12 min，无菌水冲洗后置于无菌滤纸上吸干水。
将消毒灭菌后得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，初始芽诱导培养基的配方为：改良ER培养基十6-BA 8.0 mg/L十NAA 2.5 mg/L十KT 2.0 mg/L十ZT 1.5 mg/L十 VC 15 mg/L 十L-半胱氨酸20mg/L +叶酸10mg/L十VB2 15 mg/十琼脂粉3.6 g/L十蔗糖20 g/L。初始芽诱导培养方法为：首先将接种好的外植体置于4-6 ℃的低温环境,暗培养8d，再转入温度22-25 ℃,光照强度1000-2000 lux,光照12 h/d的条件下培养，培养40 d，初始芽萌发、生长，茎段腋芽萌动率82%。
将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养基的配方为：改良ER培养基十6-BA 7.5 mg/L十NAA 3.0 mg/L十ZT 1.0 mg/L十VC 15 mg/L十VB2 15 mg十L-半胱氨酸 20 mg/L十琼脂粉 3.6 g/L十蔗糖 30 g/L。增殖培养方法为：将接种好的初始芽置于温度25-30 ℃，光照强度2000-3000 lux，光照12 h/d的条件下培养，40 d转接一次，循环往复，经4-5个周期的培养，形成丛生芽，芽增殖系数7/30d。
将得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，置于温度25-30 ℃，光照强度5000-6000 lux，光照12 h/d的环境中培养，培养40 d，形成壮芽。所述的壮芽培养基的配方为：改良ER培养基十6-BA 4.0 mg/L十NAA 1.5 mg/L十VC 15 mg/L十VB2 15 mg十L-半胱氨酸 20 mg/L十琼脂粉 3.6 g/L十蔗糖 30 g/L。
将经壮芽培养后得到的高≥2cm的单芽插入常规的生根培养基中诱导生根；余下小芽丛再次接种于增殖培养基中继续增殖，然后再重复壮芽培养，循环往复，获得大量壮芽。
以上所述的改良ER培养基的配方为：NH4NO3 1200 mg/L十KNO3 1900 mg/L十CaCl2·2H2O 440 mg/L十MgSO4.·7H2O 370 mg/L十KH2PO4 340 mg/L十H3BO3 0.63 mg/L十MnSO4.·4H2O 22.3 mg/L十ZnSO4·4H2O 8.64 mg/L十Na2MoO4·H2O 0.025 mg/L十CuSO4.·5H2O 0.0025 mg/L十CoCl2·6H2O 0.0025 mg/L十FeSO4 27.8 mg/L十NaEDTA 37.3 mg/L十肌醇 50 mg/L十烟酸 0.5 mg/L十盐酸吡哆醇0 .5 mg/L十甘氨酸 2 mg/L。
实施例3：
在林分、绿化带或零星分布的樟树中，选择干型通直圆满，树冠枝叶茂盛，生长快，用鼻子闻树木的叶片，樟木味道浓厚的单株,采其单株叶片回室内进行黄樟油素定量定性分析，叶片叶油得率1.5%以上，叶油黄樟油素含量90 %以上的植株确定为黄樟油素型樟树。在2014年6月连续3天晴朗的气候里，采集黄樟油素型樟树的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体。将外植体置于自来水下冲洗13 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.1%的甲氨基阿维菌素苯甲酸盐溶液中，控制浸泡时间20 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，2.5-3.0 cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内。在无菌条件下，将外植体置于体积浓度3%的次氯酸钠溶液中浸泡15 min，用无菌水冲洗外植体5次，再用体积浓度0.2 % HgCl2+50 mg/L VC+20 mg/L偏二亚硫酸钠的混合溶液对外植体灭菌消毒10-12 min，无菌水冲洗后置于无菌滤纸上吸干水。
将消毒灭菌后得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，初始芽诱导培养基的配方为：改良ER培养基十6-BA 7.0 mg/L十NAA 2.5 mg/L十KT 1.0 mg/L十ZT 1.5 mg/L十 VC 15 mg/L 十L-半胱氨酸20mg/L +叶酸10mg/L十VB2 15 mg/十琼脂粉3.6 g/L十蔗糖20 g/L。初始芽诱导培养方法为：首先将接种好的外植体置于6-8 ℃的低温环境,暗培养10d，再转入温度22-25 ℃,光照强度1000-2000 lux,光照12 h/d的条件下培养，培养45 d，初始芽萌发、生长，茎段腋芽萌动率80%。
将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养基的配方为：改良ER培养基十6-BA 7.5 mg/L十NAA 2.5 mg/L十ZT 0.5 mg/L十VC 15 mg/L十VB2 15 mg十L-半胱氨酸 20 mg/L十琼脂粉 3.6 g/L十蔗糖 30 g/L。增殖培养方法为：将接种好的初始芽置于温度25-30 ℃，光照强度2000-3000 lux，光照14 h/d的条件下培养，35 d转接一次，循环往复，经4-5个周期的培养，形成丛生芽，芽增殖系数6/30d。
将得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，置于温度25-30 ℃，光照强度6000-7000 lux，光照14 h/d的环境中培养，培养35 d，形成壮芽。所述的壮芽培养基的配方为：改良ER培养基十6-BA 3.5 mg/L十NAA 1.2 mg/L十VC 15 mg/L十VB2 15 mg十L-半胱氨酸 20 mg/L十琼脂粉 3.6 g/L十蔗糖 30 g/L。
将经壮芽培养后得到的高≥2cm的单芽插入常规的生根培养基中诱导生根；余下小芽丛再次接种于增殖培养基中继续增殖，然后再重复壮芽培养，循环往复，获得大量壮芽。
以上所述的改良ER培养基的配方为：NH4NO3 1200 mg/L十KNO3 1900 mg/L十CaCl2·2H2O 440 mg/L十MgSO4.·7H2O 370 mg/L十KH2PO4 340 mg/L十H3BO3 0.63 mg/L十MnSO4.·4H2O 22.3 mg/L十ZnSO4·4H2O 8.64 mg/L十Na2MoO4·H2O 0.025 mg/L十CuSO4.·5H2O 0.0025 mg/L十CoCl2·6H2O 0.0025 mg/L十FeSO4 27.8 mg/L十NaEDTA 37.3 mg/L十肌醇 50 mg/L十烟酸 0.5 mg/L十盐酸吡哆醇0 .5 mg/L十甘氨酸 2 mg/L。
实施例4：
在林分、绿化带或零星分布的樟树中，选择干型通直圆满，树冠枝叶茂盛，生长快，用鼻子闻树木的叶片，樟木味道浓厚的单株,采其单株叶片回室内进行黄樟油素定量定性分析，叶片叶油得率1.5%以上，叶油黄樟油素含量90 %以上的植株确定为黄樟油素型樟树。在2014年7月连续3天晴朗的气候里，采集黄樟油素型樟树的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体。将外植体置于自来水下冲洗15 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.1%的甲氨基阿维菌素苯甲酸盐溶液中，控制浸泡时间20 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，2.0-3 .0cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内。在无菌条件下，将外植体置于体积浓度3%的次氯酸钠溶液中浸泡15 min，用无菌水冲洗外植体5次，再用体积浓度0.2 % HgCl2+50 mg/L VC+20 mg/L偏二亚硫酸钠的混合溶液对外植体灭菌消毒12-15 min，无菌水冲洗后置于无菌滤纸上吸干水。
将消毒灭菌后得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，初始芽诱导培养基的配方为：改良ER培养基十6-BA 6.0 mg/L十NAA 2.0 mg/L十KT 2.0 mg/L十ZT 2.0 mg/L十 VC 15 mg/L 十L-半胱氨酸20mg/L +叶酸10mg/L十VB2 15 mg/十琼脂粉3.6 g/L十蔗糖20 g/L。初始芽诱导培养方法为：首先将接种好的外植体置于6-8 ℃的低温环境,暗培养10d，再转入温度22-25 ℃,光照强度1000-2000 lux,光照12 h/d的条件下培养，培养40 d，初始芽萌发、生长，茎段腋芽萌动率78%。
将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养基的配方为：改良ER培养基十6-BA 6.0 mg/L十NAA 2.0 mg/L十ZT 1.0 mg/L十VC 15 mg/L十VB2 15 mg十L-半胱氨酸 20 mg/L十琼脂粉 3.6 g/L十蔗糖 30 g/L。增殖培养方法为：将接种好的初始芽置于温度25-30 ℃，光照强度2000-3000 lux，光照12 h/d的条件下培养，35 d转接一次，循环往复，经4-5个周期的培养，形成丛生芽，芽增殖系数5/30d。
将得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，置于温度25-30 ℃，光照强度5000-7000 lux，光照14 h/d的环境中培养，培养40 d，形成壮芽。所述的壮芽培养基的配方为：改良ER培养基十6-BA 3.0 mg/L十NAA 1.0 mg/L十VC 15 mg/L十VB2 15 mg十L-半胱氨酸 20 mg/L十琼脂粉 3.6 g/L十蔗糖 30 g/L。
将经壮芽培养后得到的高≥2cm的单芽插入常规的生根培养基中诱导生根；余下小芽丛再次接种于增殖培养基中继续增殖，然后再重复壮芽培养，循环往复，获得大量壮芽。
以上所述的改良ER培养基的配方为：NH4NO3 1200 mg/L十KNO3 1900 mg/L十CaCl2·2H2O 440 mg/L十MgSO4.·7H2O 370 mg/L十KH2PO4 340 mg/L十H3BO3 0.63 mg/L十MnSO4.·4H2O 22.3 mg/L十ZnSO4·4H2O 8.64 mg/L十Na2MoO4·H2O 0.025 mg/L十CuSO4.·5H2O 0.0025 mg/L十CoCl2·6H2O 0.0025 mg/L十FeSO4 27.8 mg/L十NaEDTA 37.3 mg/L十肌醇 50 mg/L十烟酸 0.5 mg/L十盐酸吡哆醇0 .5 mg/L十甘氨酸 2 mg/L。

Claims (3)

1.一种黄樟油素型樟树嫩枝组培繁殖方法，其特征在于：包括外植体选择、外植体处理、初始芽诱导培养、增殖培养、壮芽培养和生根培养工序，采集黄樟油素型樟树的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体，对外植体进行修剪、灭菌消毒处理后接种于初始芽诱导培养基中获取初始芽，再将初始芽接种于增殖培养基中经过4-5个周期增殖培养，形成丛生芽，将丛生芽接入壮芽培养基中培养，最后将高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根，具体操作步骤如下：
（1）外植体选择：在至少连续3天晴朗的气候里，采集黄樟油素型樟树的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体；
（2）外植体处理：将外植体置于自来水下冲洗10-15 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.1%的甲氨基阿维菌素苯甲酸盐溶液中，控制浸泡时间15-20 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，对外植体消毒，备用；
（3）初始芽诱导培养：将步骤（2）得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，初始芽诱导培养方法为：首先将接种好的外植体置于4-8 ℃的低温环境,暗培养8-10 d，再转入温度22-25 ℃,光照强度1000-2000 lux,光照10-12 h/d的条件下培养，培养40-50 d，初始芽萌发、生长；所述的初始芽诱导培养基的配方为：改良ER培养基+6-BA 6.0-8.0 mg/L+NAA2.0-3.0 mg/L+KT 1.0-2.0 mg/L+ZT 1.5-2.0 mg/L+ VC 15 mg/L +L-半胱氨酸20mg/L +叶酸10mg/L+VB2 15 mg/+琼脂粉3.6 g/L+蔗糖20 g/L；
（4）增殖培养：将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养方法为：将接种好的初始芽置于温度25-30 ℃，光照强度2000-3000 lux，光照12-14 h/d的条件下培养，35-40 d转接一次，循环往复，经4-5个周期的培养，形成丛生芽；所述的增殖培养基的配方为：改良ER培养基+6-BA 6.0-8.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+ZT 0.5-1.0 mg/L+VC 15mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂粉 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L；
（5）壮芽培养：将步骤（4）得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，置于温度25-30 ℃，光照强度4000-7000 lux，光照12-14 h/d的环境中培养，培养35-40 d，形成壮芽；所述的壮芽培养基的配方为：改良ER培养基+6-BA 3.0-4.0 mg/L+NAA 1.0-1.5mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂粉 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L；
（6）生根培养：将步骤（5）得到的高≥2cm的单芽插入常规的生根培养基中诱导生根；余下小芽丛再次接种于步骤（4）的增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（5），循环往复，获得大量壮芽；
以上所述的改良ER培养基的配方为：NH4NO3 1200 mg/L+KNO3 1900 mg/L+CaCl2·2H2O440 mg/L+MgSO4·7H2O 370 mg/L+KH2PO4 340 mg/L+H3BO3 0.63 mg/L+MnSO4·4H2O 22.3mg/L+ZnSO4·4H2O 8.64 mg/L+Na2MoO4·H2O 0.025 mg/L+CuSO4·5H2O 0.0025 mg/L+CoCl2·6H2O 0.0025 mg/L+FeSO4 27.8 mg/L+NaEDTA 37.3 mg/L+肌醇 50 mg/L+烟酸 0.5mg/L+盐酸吡哆醇0 .5 mg/L+甘氨酸 2 mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种黄樟油素型樟树嫩枝组培繁殖方法，其特征在于：步骤（1）所述的黄樟油素型樟树的选择方法是：在林分、绿化带或零星分布的樟树中，选择干型通直圆满，树冠枝叶茂盛，生长快，用鼻子闻树木的叶片，樟木味道浓厚的单株,采其单株叶片回室内进行黄樟油素定量定性分析，叶片叶油得率1.5%以上，叶油黄樟油素含量90 %以上的植株确定为黄樟油素型樟树。
3.根据权利要求1所述的一种黄樟油素型樟树嫩枝组培繁殖方法，其特征在于：步骤（2）所述的外植体消毒的具体操作步骤为：在无菌条件下，将外植体置于体积浓度3%的次氯酸钠溶液中浸泡13-15 min，用无菌水冲洗外植体4-5次，再用体积浓度0.2 % HgCl2+50mg/L VC+20 mg/L偏二亚硫酸钠的混合溶液对外植体灭菌消毒8-15 min，无菌水冲洗后置于无菌滤纸上吸干水。
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