CN104039349A - 用于治疗过敏反应的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物组合物，其由一种或多种制备物组成并包含生理学有效剂量的至少一种IL-4和/或IL-13抑制剂和至少一种过敏原，以及基质，其中至少所述抑制剂是溶解或包埋于所述基质上，或者至少所述抑制剂是包被的或吸附于所述基质上，其中选择所述基质以使得所述抑制剂能够延长性释放。

Description

用于治疗过敏反应的药物组合物

发明领域

本发明涉及在体内阻断IL-4-和IL-13-介导途径，和同时对T细胞进行过敏原刺激以增加对过敏原临床耐受的诱导的方法。

发明背景和现有技术

包括速发型(I型)超敏反应在内的过敏性疾病是由特定免疫系统的不平衡应答导致的。在I型超敏反应中，Th2细胞与过敏原呈递细胞接触后上调其表面上的CD40配体。CD40配体与B细胞上的CD40的相互作用伴随着Th2相关细胞因子如IL-4、IL-5和IL-13的产生，而且随后免疫球蛋白的类别转换导致介导多种临床症状的IgE抗体的产生。

但是，过敏原特异的Th2细胞的存在不足以使过敏反应发生，因为这些细胞在健康个体中也存在。对于过敏反应的发病机理来说，重要的是能够抑制Th1和Th2细胞的增殖和细胞因子表达，并能够作用于抗原呈递细胞(APC)的过敏原特异的调节性T细胞(Treg)的数量。

调节性T细胞被宽泛地分类为自然T调节性T细胞(nTreg)和诱导的或适应性调节性T细胞(iTreg)。自然调节性T细胞是自体抗原特异性的CD4⁺T细胞，其表达FOXP3转录因子和大量的CD24。它们在胸腺中被选择并在外周成为调节性T细胞。外周中的幼稚CD4⁺Th细胞能够发育成调节性T细胞并因此而被称为诱导的或适应性调节T细胞。FOXP3转录因子的表达被认为是调节性T细胞诱导的关键因素。包括1型调节性T细胞(Tr1)和Th3细胞的这些细胞能够产生IL-10或TGF-β或这二者，这些细胞通过它们行使其大部分抑制作用(其综述参见Schmidt-Weber, 2005; Nandakumar 等, 2009)。

调节性T细胞对免疫应答的抑制通过多种途径发生(其综述参见Schmidt-Weber, 2005; Rouse, 2007; Nandakumar 等, 2009)。IL-10直接和间接地抑制肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的活性。它还使IgG4升高。TGF-β是B细胞向IgA同种型的转换和促进因子，并因此控制外周耐受。最重要的是，TGF-β已被证明促进FOXP3表达，并抑制Th1-驱动的转录因子T-BET和Th2-驱动的转录因子GATA-3。IL-10也被证明在体外促进FOXP3表达，但是只有IL-4和IL-12被中和。这两个细胞因子代表了T-细胞分化的决定信号，且分别诱导转录因子GATA-3和T-BET。

通常，Treg-介导的抑制似乎是抗原特异性的，虽然负责的细胞因子被分泌并因此可能对于多种T细胞都是可用的。但是，最近的研究表明细胞因子和细胞因子受体可能成为APCs和T细胞之间形成的免疫突触的一部分(其综述参见Schmidt-Weber, 2005)。因此，可溶性细胞因子可以以抗原特异性的方式穿梭到邻近的细胞中，并且Tregs可以将特定的靶细胞转变为无应答、无凋亡的状态(无细胞免疫应答)。

在促成过敏性炎症发生的细胞因子中，IL-4和IL-13在哮喘和其它过敏性疾病的发病机理中起着关键作用。这两个细胞因子代表着多效性细胞因子，并与IgE同种型转换的诱导、通过B淋巴细胞的IgE的分泌，和通过上调B淋巴细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE受体的IgE-介导应答的增加相关。但是IL-4和IL-13还具有一些不同的不重叠的功能。例如，IL-4能够驱动幼稚Th细胞向Th2淋巴细胞分化，导致产生效应物细胞因子例如IL-4、IL-5、IL-9和IL-13。IL-13对于上皮细胞的成熟、粘液的产生、细胞外基质蛋白的生成、呼吸道平滑肌细胞收缩性的增加和嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和T细胞的募集具有重要的作用。

IL-4通过与细胞表面特定的I型和II型受体相互作用行使其活性(其综述参见Gessner 等, 2000)。I型受体包含140 kDa的结合链(Swiss Prot登录号P24394)、IL-4Rα (也被称为CD124)和由多个细胞因子受体共享的IL-2R的共用γ-链(γ_c)。在没有共用γ-链的情况下，IL-4可以使用II型IL-4受体，所述受体包含IL-4Rα和IL-13结合链，IL-13Rα1。这种受体复合物也是IL-13的功能性受体，并且这解释了IL-4和IL-13的大部分生物学效果的重叠，虽然这两个细胞因子仅显示出25%的同源性。I型受体复合物可以仅由IL-4形成，并似乎负责介导不表达IL-13Rα1的T细胞中的IL-4应答。II型受体复合物可以由IL-4或IL-13形成并激活。I型受体复合物在造血细胞中占主导地位，而II型受体复合物在造血细胞和非造血细胞二者上表达。IL-4和IL-13与II型受体复合物的结合序列的不同之处在于，IL-4在结合第二亚基之前首先以高亲和力与IL-4Rα结合，而IL-13首先以低亲和力与IL-13Rα1结合，然后该复合物募集IL-4Rα形成高亲和力的结合位点。

第二IL-13结合蛋白，IL-13受体α2 (IL-13Rα2)，以高亲和力结合IL-13，但不结合IL-4。但是，据信IL-13Rα2是非信号传导的，因此充当诱饵受体。已证明用IFN-γ对上皮细胞的处理通过从胞内储存的转移增加IL-13Rα2的表面表达，表明IL-13Rα2通过与IL-4Rα/ IL-13Rα1复合物竞争IL-13在应答和调节Th1/Th2平衡中起着关键作用。

缺乏跨膜域和胞内域的可溶性IL-4受体(sIL-4Rα)存在于生物流体中。然而sIL-4Rα的确切功能还有待阐明，它甚至可通过与细胞表面上的IL-13Rα1形成复合物来增强IL-13应答，由此使IL-13和IL-13Rα1的弱相互作用稳定。当在支气管成纤维细胞中进行试验时，在对次优剂量的IL-13的应答中，sIL-4Rα的存在增加IL-13-刺激的嗜酸性粒细胞趋化因子的产生。此外，sIL-4Rα可以作为载体蛋白，IL-4可以从其上随时间解离。因此，sIL-4Rα可以为IL-4抵抗蛋白质降解提供某种保护。

特异性免疫治疗

特异性过敏原免疫治疗(IT)是仅有的广泛使用的疗法，其能够重建对于过敏原的临床耐受，并与过敏原特异性Treg细胞的再诱导相关。对在健康个体对过敏原暴露的正常免疫应答中的和在特异性免疫治疗中的过敏原的外周耐受主要是足够的Treg数量的结果。因此，在特应性患者中，特异性免疫治疗的主要原则是增加能够控制过敏原特异性效应物T细胞的Tregs的数量。

成功的IT伴随着T细胞记忆由促过敏Th2表型向外周的产生IL-10的T细胞表型和除了IL-10阳性细胞之外也表现出FOXP3表达的局部表型的转变。先前已证明免疫治疗可以导致长期受益，并且中断后疾病缓解持续3年。然而，考虑到影响特异性免疫治疗方法效果的各种因素，临床结果在很大程度上有所不同并不令人惊讶。当患者是针对季节性过敏原单独致敏的，免疫治疗有效，但是如果患者是特应性的或者患者对长期过敏原应答，免疫治疗则功效较低或无效。

一个问题似乎是衍生自天然来源的过敏原提取物中的个别过敏原的量，这是因为在一些提取物中，重要的过敏原存在的量不够。但是，成功的特异性免疫治疗要求应用高过敏原剂量以促进已知作为IgE依赖性应答的负反馈调节剂的低亲和性的FcεRII (CD23)的结合。如果以足够的量存在，则被施用的过敏原不仅被特异性IgE结合，还被其它免疫球蛋白类别结合。在调节免疫应答和预防IgE-介导的应答中，IgG与过敏原的复合物是重要的。已知存在三种类型的Fcγ-受体。FcγRI和FcγRIII，主要在髓系的细胞上表达，可以介导促炎性功能例如吞噬作用、抗体依赖性的细胞毒性和炎性介质的释放。FcγRII在髓细胞和淋巴细胞上表达，将抑制信号传递到细胞内。活化的树突细胞是强力的T-细胞刺激物，并表达抑制的和活化的FcγRs 二者。鉴于这些事实，近来的进展或用于特异性免疫治疗的重组过敏原似乎是一种有前景的方法，因为它们允许设计包含最适浓度的所有重要过敏原的过敏原组合物。此外，重组过敏原允许对它们的表面结构进行定点修饰以减少B细胞表位的密度。这种过敏原修饰的目的是减少过敏原性，同时保留其免疫原性。对具有大大降低的IgE反应性的修饰的重组过敏原（其显示线性T细胞表位的全谱，但与相应的天然过敏原相比其表面结构不同）的评价，证明这种分子能够减少对天然过敏原的特异性的IgE发展(Niederberger 等, 2004; Karamloo 等, 2005)。

然而，尽管近来有所改进，特异性免疫治疗的效果还需要进一步优化。用于增加能够控制过敏原特异性效应物T细胞的Tregs的数量的合适方法还有待确定。因此本领域中需要确定影响Tregs诱导的关键因素，并需要设计更有效的过敏原耐受性治疗。

本发明的技术问题

因此，本发明的技术问题是要提供用于治疗过敏性反应的方法，其中对过敏原的临床耐受的诱导得到改善，特别是其中IL-3和/或IL-13抑制剂施用的系统性副作用被减少，并且与之结合，用于平衡特异性免疫系统应答的T-细胞刺激被增强。特别是，该技术问题是要提供药物组合物，及其用途，制造这种组合物的方法以及实现这些目的的治疗方法。

发明简述

为了解决这些技术问题，本发明提供了权利要求中所定义的主题。本发明在下面进行详细说明。

在暴露于过敏原的健康个体的正常免疫应答中以及在特异性免疫治疗中，对过敏原的外周耐受主要由足够的Treg数量导致。因此，特应性患者中特异性免疫治疗的主要原则是增加能够控制过敏原特异性效应物T细胞的Tregs的数量。在体外条件下，过敏原和缺乏Th1-或Th2-驱动因子已被证明对于Tregs的诱导是必需的。由于IL-4和IL-13在过敏性炎症的发展中具有重要的作用，本发明提供了在体内同时抑制IL-4-和IL-13-介导效果，同时对T细胞进行过敏原刺激以增加对过敏原的临床耐受的诱导的方法。

优选的适合于本发明方法的IL-4-和IL-13-介导效果抑制剂包括但不限于a) 拮抗性IL-4和IL-13衍生物，b) 可溶性Il-4和IL-13受体构建体，c)对IL-4和IL-13具有特异性能够阻断它们的生物学活性的单克隆抗体、其片段或其它蛋白质构建体，d)对IL-4和IL-13受体复合物具有特异性，能够阻断IL-4和IL-13与它们的受体亚基相互作用的单克隆抗体、其片段或其它蛋白质构建体，e)对IL-4和IL-13具有特异性能够阻断它们的生物学活性的适配体，和f)对IL-4和IL-13受体复合物具有特异性，能够阻断IL-4和IL-13与它们的受体亚基相互作用的适配体。

在一个实施方案中，本发明公开了用于在过敏原呈递部位对IL-4-和IL-13-介导效果进行延长性抑制并对过敏原进行延长性呈递的方法。为了获得在过敏原呈递部位对IL-4-和IL-13-介导效果的有效的和延长的抑制，本发明公开了用于从位于过敏原呈递部位的储存库持续释放这种抑制剂或这种抑制剂的组合的方法。

在具体实施方案中，本发明公开了用于延长性递送T-细胞分化决定信号的抑制剂的基质。优选的基质包括但不限于适合作为大量的这种抑制剂或抑制剂组合的储存库的生物可降解聚合物，其允许释放足够量的所述抑制剂或抑制剂组合以在延长的一段时间中有效局部抑制IL-4-和IL-13-介导途径，并且其与用于根据本发明方法的耐受性诱导的佐剂和一种或多种过敏原是化学和物理相容的。

在优选的具体实施方案中，生物可降解的可注射原位成型凝胶系统被用于IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的控制释放。这种原位成型凝胶系统(水凝胶)经过溶胶-凝胶-溶胶的转变，其在室温下是是自由流动的溶胶，并在体温下是不流动的凝胶。与其它生物可降解聚合物相比，可注射的热胶凝聚合物具有几个优点，包括易于制备、对生物活性分子例如IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的高封装效率以及在制备过程中无有害的有机溶剂。

在另一个实施方案中，本发明公开了用于将IL-4-和IL-13-介导效果抑制剂的高局部浓度主要限制在过敏原呈递部位以减少由于该抑制剂与远离过敏原呈递部位的靶标相互作用而引起的副作用。在一个具体实施方案中，使用提供相对短的血清半衰期的IL-4-和IL-13-介导效果抑制剂，该血清半衰期足以使得该抑制剂在从位于过敏原呈递部位的储存库释放后有局部活性，且允许在从过敏原呈递部位扩散开和运送走的时候快速地从循环中被除去。提供这种特性的优选的抑制剂包括但不限于a) 具有≤15 kDa 的分子量的拮抗性IL-4和IL-13衍生物，b) 能够抑制IL-4-和IL-13-介导效果的小抗体片段或其它蛋白质构建体，和c) 能够抑制IL-4-和IL-13-介导效果的小分子量适配体。在另一个具体实施方案中，使用的IL-4-和IL-13-介导效果抑制剂在它们从位于过敏原呈递部位的储存库释放后易于被内源酶灭活，并且其可以根据本发明方法的需要被衍生化以调节它们对于酶失活的敏感性。提供这种特性的优选的抑制剂包括但不限于适配体，其对于受内源核酸酶降解的敏感性可以通过对碱基和骨架序列进行化学修饰来调节。

在另一个实施方案中，本发明公开了适用于本发明方法的佐剂。在优选的实施方案中，所使用的佐剂为要被施用的过敏原提供了储存库效果，且引发Th2-型免疫应答。虽然主要引发Th2-型免疫应答的佐剂可能干扰Tregs的诱导，在存在IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的条件下，这种佐剂比那些主要引发Th1-型免疫应答的佐剂更适合于本发明的治疗目的。优选的引发Th2-型免疫应答的佐剂包括但不限于铝盐、Montanide乳剂(基于角鲨烯的油包水乳剂)和聚磷腈。引发组合的Th1-和Th2-型免疫应答的佐剂也可用于本发明的方法，如果这些佐剂为包含一种或多种过敏原、佐剂、IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂和介导这些抑制剂的延长性释放的基质的组合物提供了有利的性质的话。引发组合的Th1-和Th2-型免疫应答的佐剂包括但不限于基于角鲨烯的水包油乳剂、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和基于菊粉和病毒颗粒的佐剂。

在另一个实施方案中，本发明公开了可用于本发明方法的疫苗组合物。在一个具体实施方案中，疫苗组合物包含生物可降解的热胶凝聚合物溶液，其含有一种或多种可溶性IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂。这种液体制剂在注射后，随着制剂温度上升至体温，会自发地形成凝胶。因此，注射的凝胶形成不流动的储存库，使一种或多种可溶的IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂从其中缓慢且持续地释放几天。组合物中IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的量以这样的方式平衡，在聚合物复合体(composit)在体温下胶凝后，所释放的抑制剂的量对于本发明方法的治疗目的是足够的。对于胶凝的聚合物复合体部位处的延长性过敏原呈递来说，一种或多种过敏原或过敏原提取物被吸附到铝盐上或被乳化以形成基于角鲨烯的油包水乳剂(Montanide乳剂)，并被注射到胶凝的聚合物复合体附近。

在另一个具体实施方案中，疫苗组合物包含生物可降解的热胶凝聚合物溶液，该溶液含有一种或多种可溶性IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂和一种或多种过敏原(或过敏原提取物)，该过敏原(或过敏原提取物)被吸附到铝盐上、或被乳化以形成基于角鲨烯的油包水乳剂(Montanide乳剂)或与水溶性的聚磷腈聚合物佐剂预先混合。组合物中的每种组分的量以这样的方式平衡：a) 在注射到体内后，该生物可降解的热胶凝聚合物形成不流动的凝胶，其它组分包埋于其中，以及b) 在聚合物复合体在体温下胶凝化之后，所释放的组分的量对于本发明方法的治疗目的是足够的。

在又一个特定的技术方案中，疫苗组合物包含生物可降解的热胶凝聚合物溶液，该溶液含有一种或多种过敏原(或过敏原提取物)、一种或多种可溶性佐剂 (例如GM-CSF)和一种或多种可溶性IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂。组合物中的每种组分的量以这样的方式平衡：a) 在注射到体内后，该生物可降解的热胶凝聚合物形成不流动的凝胶，其它组分包埋于其中，以及b) 在聚合物复合体在体温下胶凝化之后，所释放的组分的量对于本发明方法的治疗目的是足够的。

在另一个实施方案中，本发明公开了用于将疫苗组合物掺入到适合于施用的药物组合物中的方法。

在再一个实施方案中，本发明公开了使用本发明的疫苗组合物诱导过敏原耐受的治疗方法。

本发明的具体优选实施方案随着下面的更详细描述和权利要求将会变得显而易见。

发明详述

基于现有的知识，过敏原耐受由外周诱导的调节性T细胞介导，如通过过敏患者外周血中产生过敏原特异性IL-10的T细胞的不足所证明(其综述参见Schmidt-Weber 等, 2005; Schmidt-Weber 等, 2006)。特应性患者中特异性免疫治疗的主要原则是增加能控制过敏原特异性效应物T细胞的Tregs的数量。FOXP3转录因子的表达被认为是诱导调节性T细胞的关键因素。我们和其它人已证明在人中TCR受体的触发对于诱导FOXP3表达和抑制性T细胞是必需的(Schubert 等, 2001; Mantel 等, 2006)。我们证明由IL-4诱导的GATA3抑制FOXP3的表达，而FOXP3是诱导型Treg(iTreg)分化所需要的(Mantel 等, 2007)。我们已在体内和体外证明了这种功能性拮抗作用，并且已确定了对此的机制基础是GATA3以IL-4-依赖性的方式结合FOXP3启动子并随后抑制FOXP3的转录。其结果是在产生过量IL-4的相关条件下，这种拮抗作用破坏对Tregs和耐受的诱导。

在体外条件下，抗原和Th1-或Th2-驱动因子的缺乏已被证明对于Tregs的诱导是必需的。根据该观察结果，已假设Tregs的产生代表了一种默认途径，其需要T-细胞受体活化，正如任何其它T-细胞分化那样，但是需要缺少效应物T细胞的决定信号。但是，已知在过敏原注射后，由于Th2记忆T细胞的活化，IL-4局部释放，并且IL-4在接种过程中还会持续释放。因此，在本发明中，所设计的方法在体内阻断IL-4-介导途径和同时对T细胞进行过敏原刺激，以增加对过敏原临床耐受的诱导。

由于已知IL-13也与IgE同种型转换的诱导、通过B淋巴细胞的IgE的分泌和IgE介导应答的增强有关，本发明的方法还包括在体内阻断IL-13-介导途径和同时对T细胞进行过敏原刺激。虽然T细胞缺少IL-13结合受体成分且对IL-13不应答，几项研究表明IL-13的阻断能进一步增加对过敏原临床耐受的诱导。

最重要的是，本发明公开了用于延长性抑制IL-4-和IL-13-介导效果并同时延长过敏原呈递的方法。由于T细胞分化以及由此的免疫记忆的发展需要T细胞受体(TCR)结合经过12-48 h，并且长期持续记忆可能甚至需要重复的暴露，因此过程的延长是必要的。相应地，对IL-4-和IL-13-介导效果的抑制需要至少在与过敏原从注射的过敏原-佐剂复合物中被释放的时间相同的时间阶段中，最有可能是与其一样长的时间中有效。否则，所释放的过敏原分子可能诱导Th2-驱动因子，从而抑制Tregs的诱导。本发明公开了用于从位于过敏原呈递部位的储存库中稳定释放IL-4-和IL-13-介导效果抑制剂的方法。

本发明还公开了用于在过敏原呈递部位建立高局部浓度的IL-4-和IL-13-介导效果抑制剂的方法，这与抑制剂的延长的存在同样重要。由于IL-4可以抗原特异性的方式穿梭到抗原呈递细胞和T细胞之间形成的免疫突触中，在免疫突触微环境中对IL-4-介导效果的有效抑制需要高的局部抑制剂浓度。虽然T细胞不表达IL-13Rα1，介导IL-13-诱导效果的II型受体复合物在与抗原呈递细胞和T细胞之间形成的免疫突触紧邻的造血细胞和非造血细胞二者上表达。因此，可以假设对IL-13-介导效果的有效抑制也需要高的局部抑制剂浓度。

然而，抑制剂的高局部浓度通过全身施用非常难以实现，而且大剂量的治疗常常伴随着增强的副作用。例如，IL-4突变蛋白IL-4/Y124D (位点124的酪氨酸替换为天冬氨酸)以与野生型IL-4同样的亲和力与IL-4Rα结合，但是仅有0.5%的激动活性(Letzelter 等, 1998)。这种IL-4突变蛋白是IL-4-介导效果的强有力的抑制剂，但是在体内实验中已证明IL-4/Y124D在全身施用后显示出急性毒性，与野生型IL-4在猴中类似。与野生型IL-4-和IL-4/Y124D-介导的毒性相关的细胞事件包括VCAM-1 (血管细胞黏附分子1)的上调、血清中MCP-1 (单核细胞趋化蛋白1)的上调、循环单核细胞的增加连同循环淋巴细胞的同时减少，和红细胞压积的增加(WO 97/47744)。在人中使用IL-4的临床试验中已观察到在全身施用后有类似的细胞运输(Wong 等, 1992)。这些结果表明IL-4/Y124D的这些毒性是由除了T细胞之外的细胞介导的激动剂活性造成的。根据已知的IL-4对于内皮细胞的效果，所观察到的IL-4/Y124D 的毒性表明这种IL-4突变蛋白与内皮细胞上表达的新的IL-4受体复合物之间有相互作用(WO 97/47744)。这个实例证明有必要将IL-4-和IL-13-介导效果抑制剂的高局部浓度主要限制在过敏原呈递部位。

本发明的方法通过公开使用具有相对短的半衰期的IL-4-和IL-13-介导效果抑制剂的方法解决该问题。这种抑制剂在从过敏原呈递部位的储存库释放后具有局部活性，并在其从过敏原呈递部位被扩散开和运送走的时候从循环中被快速除去。例如，美国专利6,028,176和6,313,272公开了具有强拮抗活性但是在体内具有大约3-6小时的相对短的血浆半衰期的IL-4突变蛋白。

因此，本发明公开的方法提供了在过敏原呈递部位的延长时间阶段的高局部浓度的抑制剂，而且由于其快速清除，其伴随从过敏原呈递部位向外的有限半径的抑制活性。因此，抑制剂介导的可能的副作用被显著减少。

I. T-细胞分化决定信号的抑制剂

对于本发明来说，用于IL-4和IL-13的效果的局部抑制的几个方法(principles)是合适的(其综述参见Long, 2009)。优选的方法包括但不限于拮抗性细胞因子衍生物、可溶性细胞因子受体构建体、单克隆抗体、其片段或者对IL-4和IL-13或它们各自的受体具有特异性的其它蛋白质构建体、以及抗细胞因子和抗细胞因子受体的适配体的施用。可以使用任何作为IL-4、IL-13或IL-4/IL-13拮抗剂发挥作用并适合于根据本发明方法施用的化合物。拮抗剂不需要完全破坏IL-4-或IL-13-诱导的生物学活性才是有用的。更确切地说，所给出的拮抗剂可以降低IL-4和/或IL-13的生物学活性。在本发明的方法和组合物中可以使用两种或更多种拮抗剂的组合。

最优选的IL-4和IL-13抑制剂是那些a)提供小到中等分子大小并在水性环境中具有高溶解性以快速扩散到免疫突触中的，b)可以大量包埋在适合于在延长的时间中持续释放抑制剂的基质中的，c)可以从形成储存库的基质中足量释放以在过敏原呈递部位提供高局部浓度的，和d)具有相对短的血浆半衰期以减少由于抑制剂和远离过敏原呈递位点的靶标的相互作用而导致的可能的副作用的抑制剂。

可用于本发明的治疗目的的绝大部分抗IL-4和抗IL-13的方法(principles)已被公开并在用于治疗哮喘的动物模型和临床试验中进行评价(其综述参见Long, 2009)。但是，根据本发明方法的这些抑制剂的应用还未被公开。

许多IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂，包括拮抗性细胞因子衍生物、可溶性细胞因子受体构建体、抗细胞因子和抗细胞因子受体的抗体，已被开发以在哮喘患者中中断或减少Th2依赖性的过敏性炎症。治疗的目的是使患者的免疫应答向细胞毒性T-细胞-介导的免疫应答，例如以Th1-型免疫表型为特征的免疫应答转变。相反，本发明的治疗目的不是由Th2-型免疫表型向Th1-型免疫表型转变，而是在不含Th1-或Th2-驱动因子的局部微环境中诱导Tregs，尽管存在引发Th2-型免疫应答的过敏原和佐剂。

除了用于治疗哮喘的应用外，专利WO 2009/081 201 A2公开了IL-4Rα抑制剂的临床应用，其用于a)过敏反应的治疗以抑制IgE合成(包括例如特应性皮炎和食物过敏)，b)移植的治疗以防止移植排斥，和c)抑制迟发型超敏反应或接触性超敏反应。但是，所提出的临床应用的细节尚未被公开。

通常，已公开的IL-4抑制的应用中的基本原理是患者的Th2-型免疫应答向Th1-型免疫应答的转变。例如，IL-4-介导途径抑制剂用于癌症治疗的应用是基于这样的设想，促进Th1-型免疫应答有时对于患者是有利的(WO 02/04009 A2)。而且，美国专利No 2011/0002013 A1公开了IL-4拮抗剂可用作过敏反应免疫治疗的佐剂和疫苗的佐剂，特别是当引导指向Th1应答的免疫应答对所讨论的疾病的治疗或预防将会有益时。所建议的IL-4拮抗剂作为过敏反应免疫治疗的佐剂的应用的细节也未被公开。

II.白介素变体对T-细胞分化决定信号的抑制

在本发明的一个实施方案中，能拮抗IL-4和IL-13活性的白介素变体被用作抑制剂。可以使用任何作为IL-4、IL-13或IL-4/IL-13拮抗剂发挥作用并适合用于根据本发明方法施用的白介素变体。基于白介素的拮抗剂不需要完全破坏IL-4-或IL-13-诱导的生物学活性才是有用的。更确切地说，所给出的拮抗剂可以降低IL-4和/或IL-13的生物学活性。

拮抗性IL-4突变体已有描述(Kruse 等, 1992; Muller 等, 1994; 美国专利6,028,176; 美国专利5,723,118)。在人IL-4的四个螺旋束中，D螺旋上的酪氨酸(Y124) 形成与共用γ-链(γ_c)的重要接触。当Y124突变为天冬氨酸(Y124D)时，得到的分子以与野生型IL-4相同的亲和性与IL-4Rα结合，但是仅具有0.5%的激动活性(Letzelter 等, 1998)。类似地，人IL-4的121位点的精氨酸与IL-13Rα1相互作用。R121突变产生的突变体可以结合IL-4Rα，但是是IL-4-和IL-13-诱导应答二者的拮抗剂(Kruse 等, 1993)。但是，也可以考虑通过IL-4的其它突变或者额外突变产生适用于本发明方法的IL-4变体。例如，通过IL-4的125位点的丝氨酸的突变，产生能够结合IL-4Rα的突变体，但是是IL-4-和IL-13-诱导应答二者的拮抗剂(Kruse 等, 1993)。适用于本发明方法的是具有单突变、双突变和三突变的拮抗性白介素-4变体，单突变包括但不限于氨基酸位点R121、Y124和S125；双突变和三突变包括但不限于上列氨基酸位点的组合。优选的是具有相对短的半衰期的拮抗性IL-4变体，以限制远离过敏原呈递部位的副作用。

已证明当皮下施用或通过雾化吸入施用时，人IL-4的双突变体(R121D/Y124D)保护过敏性食蟹猴免于遭受过敏原诱导的呼吸道高反应性。进一步，将这种双突变体在猴中皮下施用6周或更长时间减少皮肤风疹(wheal)反应和过敏原特异性IgE的循环浓度。最近在临床研究中已经评价了IL-4的双突变体(R121D/Y124D)对于哮喘患者中对过敏原激发的晚期哮喘反应的效果(Wenzel 等, 2007)。该研究证明对IL-4和IL-13的双重抑制可以积极影响实验性过敏原激发之后的晚期哮喘反应进程。在患有特应性哮喘或特应性湿疹的参与者中，使用双突变体进行的治疗几乎不伴有不良事件，无论是通过皮下注射(至多30mg，进行至多13周)还是通过吸入(至多60mg，进行至多4周)施用。但是，应当强调，根据本发明方法的这种双突变体在过敏反应免疫治疗中的应用还未被公开。

超过10年前，动物实验已经证明在体内IL-4/Il-13受体系统的抑制可以完全消除对过敏原的体液免疫应答和过敏症状的发生(Grunewald 等, 1999)。在用卵清蛋白(OVA)免疫小鼠之前和之后用小鼠IL-4突变体Q116D/Y119D(人IL-4双突变体R121D/Y124D的小鼠等价物)处理BALB/c小鼠完全抑制OVA-特异性IgE和IgG1的合成。此外，特异性IgG2a、IgG2b和IgG3的合成被抑制，这可以指示对OVA的耐受的发生。通过在存在Alum作为佐剂的条件下腹腔注射10 μg OVA进行免疫。在第0天，在OVA免疫前和免疫后2小时通过腹腔注射施用小鼠IL-4突变体，每次剂量50 μg。从第1至8天，继续每天两次腹腔注射30 μg突变体进行处理。作者推断小鼠IL-4突变体Q116D/Y119D在体内抑制抗原特异性体液免疫应答和由IgE或IgG1介导的过敏性症状，并且因此对于特应性病症和其它Th2-主导的疾病的治疗应当是有利的。虽然该研究的结果接近于本发明的方法和治疗目的，Grunewald 等 (1999)的研究没有公开如何在在过敏原呈递部位在延长时间阶段内提供高局部浓度的抑制剂，同时由于其快速清除，具有离开过敏原呈递部位的有限半径的抑制活性。Grunewald 等 (1999)报道了通过在用OVA免疫之前开始应用小鼠IL-4突变体Q116D/Y119D从而对OVA过敏原耐受的明显诱导，这与对于已存在过敏反应的患者的免疫治疗不能相比。对于在具有Th2-型免疫表型的个体中对过敏原耐受的诱导来说，仅有本发明的方法能提供了合适的方法，以确保在不含Th1-或Thr-驱动因子的局部微环境中充分诱导Tregs，尽管存在过敏原。

可用于本发明方法的IL-13突变体包括但不限于IL-13突变体E13K，它是 人IL-13的强有力的拮抗剂，并且还能部分抑制人IL-4的应答(Kioi 等, 2004)。IL-13第13位的谷氨酸与IL-4Rα结合，且将其突变为赖氨酸降低其与IL-4Rα的结合。虽然IL-13E13K防止IL-4Rα与IL-13Rα1结合，但由于可利用可选的IL-4R 复合物，IL-4Rα:γ_c，无法实现对IL-4应答的完全抑制。

在优选的实施方案中，人IL-4双突变体R121D/Y124D被用于根据本发明的方法进行对IL-4-和IL-13-介导途径的抑制。人IL-4双突变体能够拮抗IL-4的活性以及IL-13的活性(Grunewald 等, 1998; Tony 等, 1994)。

III.可溶性细胞因子受体构建体对T-细胞分化决定信号的抑制

在本发明的一个实施方案中，可溶性细胞因子受体构建体被用于本发明的方法，以抑制IL-4-和IL-13-介导途径。优选的构建体包括但不限于IL-4Rα的可溶性胞外域，及其保留有IL-4结合能力的变体、片段和衍生物。人以及小鼠IL-4受体和它们的核苷酸序列已有描述(美国专利5,599,905; Idzerda 等, 1990 (人IL-4受体); Mosley 等, 1989 (小鼠IL-4受体))。编码的人IL-4受体包含N-末端信号肽，后面接着是胞外域、相应于氨基酸208-381的跨膜区域和相应于氨基酸232-800的胞质区。由可变mRNA构建体，例如可以是由于转录后的不同mRNA剪接事件产生的构建体，和产生能结合IL-4的多肽的构建体，产生的IL-4受体多肽属于本文所公开的IL-4受体多肽。IL-4受体变体包括那些具有通过一个或多个取代、缺失或插入而不同于天然序列，但保留了IL-4受体蛋白的生物学活性的氨基酸或核苷酸序列的变体。本发明还包括具有或不具有相关的天然糖基化模式的IL-4受体蛋白。糖基化模式可以根据用于生产蛋白质的宿主细胞的类型而有所不同。另一种选择是通过定点突变使N-糖基化位点失活。IL-4受体蛋白的衍生物包括那些与天然蛋白相比显示出不同结构，具有衍生化氨基酸(例如通过交联试剂，或聚乙二醇)的衍生物。

在另一个实施方案中，IL-4Rα的可溶性胞外域、其保留有结合IL-4能力的其变体、片段和衍生物与其它蛋白质或多肽的N-末端或C-末端化学缀合或融合。优选的IL-4受体融合蛋白或多肽包括但不限于利于纯化(例如His-标签)或识别(例如Flag肽)的肽，和具有促进寡聚化的性质的蛋白质或肽(例如亮氨酸拉链)。在优选的具体实施方案中，IL-4Rα的可溶性胞外域与任何同种型的人免疫球蛋白的Fc部分或选定的恒定域，或它们的能够二聚化的片段融合。如果融合蛋白由抗体的重链和轻链二者组成，则可能形成IL-4受体的多达四个胞外域的寡聚物。优选的构建体还包括异源寡聚物，其中IL-4Rα的可溶性胞外域和IL-13Rα1的可溶性胞外域与能够寡聚化的人蛋白或多肽融合。

在适用于本发明方法的基于细胞因子受体的抑制剂中，包含IL-4Rα的可溶性胞外域和IL-13Rα1的可溶性胞外域二者的异二聚体是最优选的。竞争性抑制IL-4与其受体结合的由人IL-4R-α链(shIL-4R)的胞外部分组成的可溶性IL-4受体片段在早期人的研究中似乎很有前景(Borish 等, 2001)。但是，随后的大规模临床试验表明这种试剂在哮喘中没有临床效果。这种欠佳的应答可以是由于shIL-4R和IL-13Rα1在细胞表面形成复合物，由此使IL-13和IL-13Rα1的弱相互作用稳定，导致增强的IL-13应答所造成的。为了抑制IL-4-和IL-13-介导应答二者，已产生了可溶的异二聚受体构建体，其包含IL-4Rα和IL-13Rα1的胞外域，二者与人IgG1的Fc部分融合(Economides 等, 2003)。这种异二聚构建体以高亲和力与IL-4和IL-13结合。IL-13以低亲和力与未复合的IL-13Rα1结合，但IL-13Rα1和IL-4Rα的复合物形成对IL-13的高亲和力结合位点，且IL-4甚至以高亲和力与未复合的IL-4Rα结合(Andrews 等, 2006)。根据本发明方法的为IL-13和IL-4提供结合位点的异二聚构建体在过敏反应免疫治疗中的应用还未公开。

IV.抗体对T-细胞分化决定信号的抑制

在另一个实施方案中，作为IL-4或IL-13拮抗剂的抗体被用于本发明的方法。抗体优选是单克隆抗体或其抗原结合片段。有利地，使用人源化或嵌合单克隆抗体。最优选的是人单克隆抗体。合适的抗体的实例是与IL-4或IL-13分别和IL-4受体或IL-13受体的结合相互作用的那些抗体。这些抗体，本文中称为阻断抗体，可以针对细胞因子IL-4和IL-13或细胞因子受体IL-4Rα和IL-13Rα1产生，并且可以在常规测定中筛选其干扰IL-4和IL-13与它们各自的受体亚基结合的能力。这些抗体的抗原结合片段，包括Fab和F(ab’)2或人工抗体构建体例如scFv或其它蛋白质构建体例如anticalins也适用于本发明的方法。其它实施方案包括嵌合抗体和其抗原结合片段，例如小鼠单克隆抗体的人源化形式，和人单克隆抗体及其抗原结合片段。

在优选的实施方案中，具有对IL-4和IL-13的特异性能够阻断这两种细胞因子的生物活性的两种或更多种人源化或人单克隆抗体的组合被用于本发明的方法。根据本发明的方法，这两个细胞因子的生物活性需要被阻断，以在过敏原呈递部位创造不含Th1-或Th2-驱动因子的局部微环境。

能阻断IL-4和IL-13的生物学活性的合适的单克隆抗体最近已有综述(Holgate 等, 2008; Long, 2009)。例如，抗IL-4人源化单克隆抗体pascolizumab已被证明在体外有效阻断IL-4应答(Hart 等, 2002)。虽然这种抗体在对哮喘的治疗中仅产生平常的结果，但它对于本发明的方法来说可能是一种有发展前景的候选物。IL-13与IL-4Rα的结合可以被完全人源化的单克隆IgG1抗体IMA-638有效阻断，并且IL-13和IL-13Rα1的相互作用可以被完全人源化的单克隆IgG1抗体IMA-026抑制(Gauvreau 等, 2010)。这两种抗体在食蟹猴的哮喘的治疗中都表现出效果，但是只有IMA-638能够在II期临床研究中减少早期和晚期两者的哮喘反应(Gauvreau 等, 2010)。根据本发明方法的这些抗体，其片段和人工构建体，以及其它抗细胞因子的蛋白质构建体在过敏反应免疫治疗中的应用未曾被公开。

在本发明的另一个实施方案中，能够使细胞因子受体失活的抗体被用于抑制IL-4-和IL-13-介导途径。优选的是对IL-4Rα具有特异性能够阻断IL-4和IL-13二者的生物学活性的人源化或人单克隆抗体。例如，完全人的单克隆IgG2抗体AMG317以高亲和力(K_d = 1.8 x 10^-10 M)与IL-4Rα结合，且有力地阻断IL-4和IL-13二者的生物学活性(Corren 等, 2010)。而且，AMG317已被证明在体外对炎症具有重要作用。虽然在II期研究中，在患有哮喘的患者中，AMG317未证明对于整个群体的患者具有临床效果(Corren 等, 2010)，但对于本发明的方法来说，该抗体提供了优选的性质。但是，应当强调，根据本发明方法的该抗体和其它抗细胞因子受体的抗体，其片段和人工构建体，以及其它抗细胞因子受体的蛋白质构建体在过敏反应免疫治疗中的应用未曾被公开。

V. 适配体对T-细胞分化决定信号的抑制

在本发明的另一个实施方案中，适配体被用于抑制IL-4-和IL-13-介导途径。适配体是通过多轮体外选择产生的核酸结合体(其综述参见Famulok 等, 1999; Yan 等, 2005)。典型地，所选择的适配体与其靶标非常紧密地(通常是在低的纳摩尔的范围)和特异地结合。适配体还可以区别紧密相关的蛋白质靶标。适配体具有几个关键特征，其使得它们非常适合作为本发明方法的试剂。首先，适配体相对较小并易于接近大分子难以靶向的位点，例如在抗原呈递细胞和T细胞之间形成的免疫突触。本发明的另一个优点是有可能改造适配体对于降解核酸酶的稳定性，由此确定它们的抑制活性的时间阶段。未修饰的基于RNA-和DNA-的适配体在血清中可以在数分钟内开始降解，然而包含修饰的碱基和硫代磷酸酯键的适配体对于降解核酸酶显示出显著增强的稳定性。例如，2’-氨基密啶-修饰的RNA已被证明在数天内保持稳定。而且，修饰还可以被应用于适配体末端以使其具有更强的稳定性。例如，可以加入3’-3’键以防止3’-核酸外切酶降解。可以通过Spiegelmer-技术 (其综述参见Famulok 等, 1999)或通过使用肽核酸(EP 1 785 490 B1)产生稳定的适配体。肽核酸(PNA)代表了一类核酸类似物，其中带电荷的脱氧核糖-磷酸二酯骨架被替换为含有N-(2-胺乙基)甘氨酸单体的肽链，具有核酸碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶链接到所述单体的α-碳上。由于它的人工特性，PNA提供对核酸酶和蛋白酶的完全抵抗力。

在优选的实施方案中，两个或更多个对IL-4和IL-13具有特异性能够阻断这两个细胞因子的生物学活性的适配体的组合被用于本发明的方法。

在本发明的另一个优选实施方案中，能够使细胞因子受体失活的适配体被用于抑制IL-4-和IL-13-介导途径。优选的是对IL-4Rα具有特异性能够阻断IL-4和IL-13二者的生物学活性的适配体。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所使用的适配体提供对酶促降解的有限的抵抗，其足以在过敏原呈递部位及其附近有效抑制IL-4-和IL-12-介导途径，但是确保适配体从该部位扩散开的时候快速降解。在具体实施方案中，根据本发明方法的需要通过修饰其结构调整抑制性适配体的稳定性，所述修饰包括但不限于硫代磷酸酯键的引入，碱基修饰(例如通过2’-氨基嘧啶的修饰)，以及向适配体末端添加3’-3’键。

在本发明的另一个优选的实施方案中，根据本发明方法的需要调整抑制性适配体的生理清除。在非常快速清除的情况下，抑制性适配体的血浆半衰期可以通过与脂类或高分子量化合物例如40 kD聚乙二醇部分连接而被延长。

VI.用于T-细胞分化决定信号抑制剂的延长递送的基质

在优选的实施方案中，用于IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的局部递送的基质a)可以作为大量抑制剂或抑制剂组合的储存库，b)允许释放足够量的抑制剂或抑制剂组合，以在延长的时间阶段内(最佳地是几天)有效局部抑制IL-4-和IL-13-介导途径，c)是生物可降解的，以及d)与用于根据本发明方法进行的耐受诱导的佐剂和一种或多种过敏原是化学和物理相容的。

在本发明的一个实施方案中，生物可降解聚合物被用于IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的控制递送。优选的被FDA批准的并用于临床试验中的生物可降解聚合物包括但不限于聚(D,L-乳酸)、聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)和L-丙交酯和D,L-丙交酯的共聚物。这些聚合物的重要特性是它们能够被局部应用，其允许维持抑制剂在病灶内的浓度，而系统性毒副作用减到最小。所有被FDA批准的聚合物都已被广泛研究过其生物相容性、毒理学和降解动力学。而且，这些聚合物已被证明在体外释放包埋药物几小时至多40周，且在体内几周有效。例如，包含抗-VEGF RNA适配体EYE001的PLGA微球已被证明在20天的时间期间以持续的方式释放适配体，具有平均速度为每天2 μg(Carrasquillo 等, 2003)。

在更优选的实施方案中，生物可降解的可注射的原位成型凝胶系统被用于IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的控制递送。优选的原位成型凝胶系统(水凝胶)经过溶胶-凝胶-溶胶的转变，其在室温下是自由流动的溶胶，在体温下是不流动的凝胶。与其它生物可降解聚合物相比，可注射的热胶凝聚合物具有几个优点，包括易于制备，对生物活性分子例如IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的高封装效率，以及在制备过程中不含有害的有机溶剂(Qiao 等 2005)。

在一个具体实施方案中，所使用的生物可降解热胶凝嵌段聚合物是基于单甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)的，包括但不限于a) 由MPEG和聚(ε-己内酯)(PCL)组成的二嵌段共聚物(Hyun 等, 2007)，b) MPEG-b-(PCL-ran-PLLA)二嵌段共聚物(Kang 等, 2010)，和c) 由MPEG和PLGA组成的二嵌段共聚物(Peng 等, 2010)。包含PCL的MPEG共聚物提供的优点是，与包含PLLA和PLGA的MPEG共聚物相反，它们在生物降解后不形成酸性环境(Hyun 等, 2007)。

在另一个具体实施方案中，所使用的生物可降解的热胶凝三嵌段聚合物包括但不限于a) PLGA-PEG-PLGA (Qiao 等, 2005)，b) PEG-PLGA-PEG (Zhang 等, 2006)，和c) PEG-PCL-PEG (PECE) (Gong 等, 2009 a)。由PLGA和PEG制成的各种生物可降解热胶凝三嵌段聚合物在专利申请WO 99/18142中公开。在较低的温度，在水溶液中，共聚物链的亲水PEG段和水分子之间的氢键占主导地位，导致这些共聚物在水中溶解。随着温度升高，氢键连接变得较弱，而疏水段例如PLGA段的疏水作用力变得较强，导致溶胶-凝胶的转变。PEG、PLGA和PCL是熟知的被FDA批准的生物可降解的和生物相容的材料，其在生物医学领域已被广泛使用。

在另一个具体实施方案中，使用生物可降解热胶凝二嵌段和三嵌段共聚物，其由聚环氧乙烷(PEO)和生物可降解的聚酯例如聚-L-乳酸(PLLA)组成(Jeong 等, 1997)。但是，这些嵌段共聚物在较高温度是自由流动的溶胶，而在较低温度形成凝胶。例如，PEO-PLLA-PEO (M_r 5,000-2,040-5,000)的23% 水溶液在45℃是溶胶，而在37℃变为凝胶。通过改变生物可降解嵌段长度，可以操纵溶胶-凝胶转变温度，例如，增加PLLA嵌段长度使嵌段共聚物在水中聚集的倾向增加，导致凝胶-溶胶转变曲线的斜率变得陡峭，并且在较低的浓度就开始胶凝化。溶胶-凝胶转变温度是嵌段聚合物浓度以及组成的函数。

在又一个具体实施方案中，使用泊洛沙姆(商品名Pluronics)。泊洛沙姆是非离子三嵌段共聚物，其由中间的聚环氧丙烷(PPO)疏水链和两侧的两个聚(氧化乙烯)(PEO)的亲水链组成(Gilbert 等, 1987)。泊洛沙姆在水溶液中也显示出溶胶-凝胶转变的性质，已被用于几种治疗剂的持续释放。但是，泊洛沙姆不是生物可降解的，并可以在体内积聚，其可导致毒副作用。因此，泊洛沙姆在生物医学领域的应用受到很大限制。在最近的研究中，Pluronic F127 (100-单位的PEO链围绕着一个65-单位的PPO)已被用于与PECE形成复合热敏水凝胶(Gong 等, 2009-b)。根据该研究的结果，Pluronic F127/PECE复合水凝胶是生物相容的，具有低的细胞毒性，并且因此可以也适用于本发明的方法。

不同的生物可降解热胶凝聚合物提供了不同的稳定性特性。例如，泊洛沙姆三嵌段聚合物提供优良的热敏性，但是由于PPO嵌段的弱疏水性，这种共聚物形成快速溶蚀的凝胶，已有报道其在体内最多坚持几个小时。在体外条件下将泊洛沙姆凝胶暴露于磷酸盐缓冲液证明在2天之内发生凝胶溶蚀(Hyun 等, 2007)。当聚合物溶液被皮下注射到大鼠中的时候观察到类似的结果。2天后不能观察到泊洛沙姆凝胶(Hyun 等, 2007)。用MPEG-PCL凝胶获得了不同的结果。在体外条件下，MPEG-PCL凝胶保持其结构完整性大于28天，且在皮下注射到大鼠中后，MPEG-PCL凝胶保持其结构完整性大于30天。但是，MPEG-PCL凝胶的稳定性也可产生问题，这是由于与PLA、PGA或PLGA的降解速度相比，PCL在体内的降解速度相当低(2-3年)(其综述参见Sinha 等, 2004)。因此，在体内在行使递送IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的功能之后，MPEG-PCL共聚物在生理条件下在体内可保留不确定时间阶段。因此，用于本发明方法的最优选的生物可降解热胶凝聚合物是其结构完整性保持几天但在体内保留不超过一周的那些聚合物。

在本发明的优选的实施方案中，使用生物可降解热胶凝聚合物，其允许改变它们的降解动力学。例如，PLLA段可以被掺入到MPEG-PCL共聚物的PCL段中，由于PLLA提供更好的水对PLLA的酯键的可接近性，由此增强了共聚物的水解降解(Kang 等, 2010)。得到的MPEG-b-(PCL-ran-PLLA)二嵌段共聚物通过改变PCL段中PLLA的量，提供从几周到几个月的可调节的治疗窗(Kang 等, 2010)。在另一个实例中，PLGA-PEG-PLGA水凝胶溶蚀的速度可以通过改变PLGA段中DL-丙交酯/乙交酯的摩尔比来改变。DL-丙交酯分子比乙交酯分子更疏水。因此，通过增加PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的PLGA段中DL-丙交酯/乙交酯的摩尔比，由于共聚物分子中更强的疏水作用而形成更稳定的水凝胶(Qiao 等 2005)。

已经分析了几种生物可降解热胶凝聚合物介导蛋白质持续释放的能力。虽然不同的蛋白质例如细胞因子突变体、可溶性细胞因子受体构建体和抗体有可能以各自的方式影响每种共聚物的释放行为，对模式蛋白例如牛血清清蛋白(BSA)的释放的表征提供了重要的信息。使用包含不同百分比的PECE 和Pluronic F127的复合水凝胶，BSA的体外释放行为证明是依赖于水凝胶组合物、初始BSA加样量和水凝胶浓度的 (Gong 等, 2009-b)。使用包含60% PECE和40% Pluronic F127的复合水凝胶，在存在30wt%水凝胶的条件下加入4 mg BSA，实现了大于15天的BSA的持续释放。使用MPEG-PCL共聚物，BSA的体外持续释放结果是大于20天，且在体内条件下(皮下注射到大鼠中后)，持续释放持续了大于30天(Hyung 等, 2007)。

虽然对于大部分临床应用来说，治疗药物在几周的时期中从生物可降解热胶凝聚合物中的持续释放是令人期望的，本发明的方法不需要IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂有这种延长的持续释放，因为免疫记忆的发生需要T细胞受体(TCR)结合仅1-2天的时间阶段。而且，IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂经过几周时间阶段的延长的持续释放可产生局部副作用。因此，优选的是在不超过一周的有限时间内递送IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的生物可降解热胶凝聚合物。

PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物代表了为本发明方法提供有利的降解和释放动力学的水凝胶的一个实例。如近期的研究中所证明的，胰岛素从PLGA-PEG-PLGA 三嵌段共聚物中的释放持续大约4天，在第一天中有最初的突释效果(Choi 等, 2003)。最初的突释效果在过敏原呈递的初始阶段对于IL-4-和IL-13-介导途径的完全抑制可以是有利的。但是，可以通过与锌的络合降低IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的溶解性从而改变释放动力学，如锌-胰岛素复合物所显示的那样(Choi 等, 2003)。

虽然泊洛沙姆凝胶不是生物可降解的，泊洛沙姆407 (商品名Pluronic F127)凝胶也代表了为本发明方法提供有利的降解和释放动力学的热胶凝水凝胶的一个实例。虽然在体外条件下，证明BSA从泊洛沙姆407凝胶中的释放几乎在1天内完成，BSA在体内条件下(皮下注射到大鼠中后)的持续释放持续了3天(Hyung 等, 2007)。

VII.佐剂

由于T细胞分化以及由此的免疫记忆的发生要求T细胞受体(TCR)结合大于12-48 h，而且长期持续记忆甚至可能需要反复暴露，因此抗原暴露的时间非常重要。佐剂例如油和alum提供了储存效果，其延长抗原的寿命，并由此延长抗原对T细胞的刺激。但是，除了储存效果，目前可用的佐剂触发Th1-型或Th2-型免疫应答或二者(其综述参见Leroux-Roels, 2010; Nicholls 等, 2010)。基于这样的假设：Tregs的产生代表了一种默认途径，其需要T-细胞受体激活但需要缺乏效应物T细胞决定信号，目前可用的佐剂对于本发明的目的来说不是最佳的。为本发明的方法所需要的佐剂促进过敏原摄取和对T细胞的延长的刺激，而不提供决定信号，由此诱导Treg增加。遗憾的是，提供所有期望性质的佐剂仍未可得。

脂质体，由脂质层组成的合成纳米微球，代表了一种经典的其本身没有活性的佐剂。它们主要的作用方式是通过抗原呈递。脂质体可以将过敏原封装在其中并作为过敏原递送媒介物。但是，脂质体不适合于过敏原的缓慢释放，而缓慢释放对于延长免疫刺激来说是必需的。

在本发明的优选实施方案中，引发Th2-型免疫应答的佐剂，包括但不限于铝盐、Montanide乳剂(基于角鲨烯的油包水乳剂)和聚磷腈被用于本发明的方法。虽然主要引发Th2-型免疫应答的佐剂可能干扰Tregs的诱导，在存在IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的条件下，这种佐剂比那些主要引发Th1-型免疫应答的佐剂更适用于本发明的治疗目的。在存在IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的条件下，引发Th2-型免疫应答的佐剂的反作用活性(contra-productive activity)显著减少或甚至被破坏，而Th1-型促进佐剂的活性可以不受影响。因此，Th1-型细胞因子会干扰Tregs的诱导。

在一个优选的具体实施方案中，含铝佐剂，典型地是磷酸铝或氢氧化铝凝胶(通常被称为alum)被用于本发明的方法。一种作用机理是由于它使免疫分子在体内停留在特定部位，允许它们可以缓慢释放并因此有延长的免疫应答，即所谓的储存效果。alum也似乎是通过将抗原保持为颗粒(而不是溶解)形式行使其佐剂活性，从而增强APCs对抗原的吞噬作用。树突细胞(DC)能够摄取溶解的抗原和吸附在含铝佐剂上的抗原。而且，已经清楚alum能够直接激活免疫细胞。Alum可以诱导单核细胞/巨噬细胞成熟化为DC-样细胞。这个过程依赖于NLRP3 (NOD-样受体家族，含热蛋白结构域的蛋白3)的激活，NLRP3是引起促炎性细胞因子例如IL-1β和IL-18产生的炎性体的一部分。首先，alum引发Th2应答，包括IL-4和IL-5的产生以及B细胞产生IgG1和IgE(其综述参见Nicolls 等, 2010)。

过敏原与含铝佐剂温育后，过敏原通过静电相互作用以及磷酸基团和羟基基团之间的交换被部分或完全吸附到佐剂上。几项研究已证明吸附到含铝佐剂上可防止过敏原的快速酶促降解，但是吸附过程也可能诱导结构变化，导致热稳定性降低(其综述参见Clapp 等, 2011)。一种提高疫苗热稳定性的方法是使用缓冲液的组合来改变含铝佐剂的表面化学和控制过敏原氨基酸侧链的离子化状态。另一个方法是鉴别使溶液状态的一种或多种过敏原稳定的条件，并使用该条件作为使一种或多种过敏原的吸附诱导的热不稳定作用的程度最小化的指导。但是，实际上稳定方法可以被忽略，这是因为抗原(包括过敏原)向含铝佐剂的吸附对于免疫应答的重要性在近期的研究中受到质疑(其综述参见Clapp 等, 2011)。例如，针对母鸡卵清溶菌酶在兔中引发的免疫应答与吸附在含铝佐剂上的抗原级分无关(Chang 等, 2001)。但是，为了使免疫应答达到最大，某种程度的吸附或者至少抗原和佐剂的接近似乎是重要的。

在另一个优选的具体实施方案中，聚磷腈(水溶聚合物)被用于本发明的方法。聚[二(羧酸苯氧基)磷腈] (PCPP)已被证明增强抗体应答，同时具有可忽略不计的反应原性(Nicolls 等, 2010)。

在又一个具体实施方案中，基于角鲨烯的油包水乳剂(Montanide乳剂)被用于本发明的方法。Montanide乳剂与不完全弗氏佐剂类似，但它们是生物可降解的，并因此具有显著较小的毒性，并且已被用在几项临床试验中(Nicolls 等, 2010)。

在另一个实施方案中，引发组合的Th1-和Th2-型免疫应答的佐剂被用于本发明的方法。虽然引发组合的Th1-和Th2-型免疫应答的佐剂有可能在一定程度上干扰Tregs的诱导，但这种佐剂可以为组合物提供有利的性质，其可能对本发明的方法是有益的。引发组合的Th1-和Th2-型免疫应答的佐剂包括但不限于基于角鲨烯的水包油乳剂、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和基于菊粉和病毒颗粒的佐剂(其综述参见Nicholls 等, 2010)。

VIII. 包含IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂、介导这种抑制剂的延长性递送的基质、过敏原和佐剂的疫苗组合物。

为了实现一种或多种过敏原的延长的呈递以及在过敏原呈递部位对IL-4-和IL-13-介导效果的延长的抑制，一种或多种过敏原和一种或多种抑制剂二者以限制这些组分从过敏原呈递部位扩散开的方式共同施用。可用于本发明的有用的扩散限制技术包括但不限于将组分吸附到含铝材料上，用组分制备油包水或水包油乳剂，以及将组分掺入到生物可降解聚合物包括生物可降解热胶凝聚合物中。

对于某些组分来说，为实现本发明的治疗目的组合两种或更多种扩散限制技术是有用的。本发明方法的一个重要方面是治疗组合物中组分的相容性。例如，将过敏原和IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂吸附到含铝材料上提供了过敏原的延长的呈递连同Th2-型佐剂的效果，但是问题是一种或多种抑制剂的延迟释放是否足以在过敏原呈递期间有效抑制IL-4-和IL-13-介导途径。将抑制剂掺入到快速降解聚合物中提供了更好的机会以实现在过敏原呈递期间对IL-4-和IL-13-介导途径的有效抑制。因此，这两种技术的组合比任一种单独的技术更有可能保证较好的治疗效果。类似的考虑适用于油包水或水包油乳剂作为IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的扩散限制技术的使用，因为抑制剂从这种乳剂释放的动力学可能不足以满足本发明方法的需要。但是，生物可降解聚合物具有潜力以提供足以满足本发明方法需要的延长的过敏原呈递和IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的持续释放。近期的研究已证明与抗原一同包埋在生物可降解水凝胶中的可溶性佐剂是引发免疫应答的强有力的组合物。使用由MPEG-PLGA 组成的二嵌段共聚物进行乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和GM-SCF 的水凝胶共递送，可能引发高HBsAg-特异性抗体和T-辅助细胞应答，甚至是在由于其H-2单体型对现有的HBsAg疫苗不应答的小鼠品系中(Chou 等, 2010)。

在本发明的一个优选的实施方案中，疫苗组合物包含生物可降解热胶凝聚合物，所述生物可降解热胶凝聚合物含有一种或多种部分或完全吸附到含铝佐剂上的过敏原或者过敏原提取物，以及一种或多种可溶性IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂。通过在生物可降解热胶凝聚合物为自由流动的溶胶的温度(例如室温)下将所有组分混合制备该组合物。组合物中每种组分的量以这样的方式平衡：a) 在注射后，该生物可降解热胶凝聚合物形成不流动的凝胶，其它组分包埋于其中，以及b) 在聚合物复合体在体温下胶凝化之后，所释放的组分的量对于本发明方法的治疗目的是足够的。

在本发明的另一个优选实施方案中，聚合物包埋的IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂和alum-吸附的过敏原(或过敏原提取物)在同一部位，但作为单独的制备物注射。聚合物复合体在注射部位胶凝化之后，将alum-吸附的过敏原(或过敏原提取物)注射到凝胶的聚合物复合体附近。所述聚合物复合体包含生物可降解的热胶凝聚合物和一种或多种可溶性IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂，并且通过在生物可降解热胶凝聚合物为自由流动的溶胶的温度(例如室温)下将所有组分混合来制备。组合物中每种组分的量以这样的方式平衡：a) 在注射后，该生物可降解热胶凝聚合物形成不流动的凝胶，其它组分包埋于其中，以及b) 聚合物复合体在体温下胶凝化之后，所释放的组分的量对于本发明方法的治疗目的是足够的。

在本发明的另一个优选实施方案中，疫苗组合物包含生物可降解热胶凝聚合物，该生物可降解热胶凝聚合物含有一种或多种与由基于角鲨烯的油包水乳剂(Montanide乳剂)组成的佐剂或水溶性聚磷腈聚合物预混的过敏原或过敏原提取物，和一种或多种可溶性IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂。通过在生物可降解热胶凝聚合物为自由流动的溶胶的温度(例如室温)下将所有组分混合制备该组合物。组合物中每种组分的量以这样的方式平衡：a) 在注射后，该生物可降解热胶凝聚合物形成不流动的凝胶，其它组分包埋于其中，以及b) 在聚合物复合体在体温下胶凝化之后，所释放的组分的量对于本发明方法的治疗目的是足够的。

在本发明的另一个优选的实施方案中，聚合物包埋的IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂和包埋在Montanide乳剂中或与水溶性聚磷腈聚合物混合的过敏原(或过敏原提取物)在同一部位，但以单独的制备物注射。聚合物复合体在注射部位胶凝化之后，将包埋在Montanide乳剂中或与水溶性聚磷腈聚合物混合的过敏原(或过敏原提取物)注射到胶凝化的聚合物复合体附近。所述聚合物复合体包含生物可降解的热胶凝聚合物和一种或多种可溶性IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂，并且通过在生物可降解热胶凝聚合物为自由流动的溶胶的温度(例如室温)下将所有组分混合来制备。组合物中每种组分的量以这样的方式平衡：a) 在注射后，该生物可降解热胶凝聚合物形成不流动的凝胶，其它组分包埋于其中，以及b) 在聚合物复合体在体温下胶凝化之后，所释放的组分的量对于本发明方法的治疗目的是足够的。

在本发明的又一优选的实施方案中，疫苗组合物包含生物可降解热胶凝聚合物，所述生物可降解热胶凝聚合物含有一种或多种过敏原或过敏原提取物、一种或多种引发组合的Th1-和Th2-型免疫应答的可溶性佐剂(例如GM-CSF)、和一种或多种可溶性IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂。通过在生物可降解热胶凝聚合物为自由流动的溶胶的温度(例如室温)下将所有组分混合制备该组合物。组合物中每种组分的量以这样的方式平衡：a) 在注射后，该生物可降解热胶凝聚合物形成不流动的凝胶，其它组分包埋于其中，以及b) 在聚合物复合体在体温下胶凝化之后，所释放的组分的量对于本发明方法的治疗目的是足够的。

IX. 治疗方法

如本文所使用的，对蛋白质过敏原敏感的个体的T细胞应答的降低或改变被定义为在个体中对蛋白质过敏原的症状的减少，如通过标准临床操作确定(参见例如Brit. Med. J. 1990; 302: 265)。如本文中所提及的，对过敏原症状的减少包括在使用如本文所述的多肽进行的治疗方案之后，个体对于过敏原的过敏反应的任何减少。这种症状上的减少可以主观确定(例如患者在暴露于过敏原时感觉更舒适)，或者临床确定，例如进行标准皮肤测试。

为进行免疫治疗，包含一种或多种过敏原、一种或多种佐剂、一种或多种IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂和介导这种抑制剂的延长性递送的基质的本发明的疫苗组合物，以多个公开的免疫治疗方案中所定义的时间间隔重复施用。疫苗组合物中一种或多种过敏原的剂量逐渐增加到有效减少个体对一种或多种过敏原的过敏反应的程度。在具体实施方案中，未包埋的IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂可以和疫苗组合物共同施用以增强施用部位的抑制效果。施用途径的优选实施例包括但不限于皮肤内和皮下施用。可以调整给药方案以提供最佳的治疗反应。例如，可以每天进行几次分次剂量的施用。

在本发明的一个优选实施方案中，应用聚合物包埋的IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂和alum-吸附的过敏原以用于免疫治疗。首先，皮下注射含有一种或多种可溶性IL-4-和IL-13-介导途径抑制剂的生物可降解热胶凝聚合物溶液。聚合物包埋的抑制剂的量取决于生物可降解热胶凝聚合物的释放动力学，且被调整为确保在3-5天的时间阶段中进行治疗有效剂量的连续释放的水平。在第二步中，在胶凝化的聚合物复合体的部位皮下注射alum-吸附的过敏原。alum-吸附的过敏原的量将根据例如个体对一种或多种过敏原的敏感度、个体年龄、性别和体重、组合物在个体中诱导对一种或多种过敏原的耐受的能力这些因素的不同而不同。在随后的步骤中，首先注射聚合物包埋的抑制剂，然后在胶凝化的聚合物复合体部位注射alum-吸附的过敏原。虽然聚合物包埋的抑制剂的量保持不变，alum-吸附的过敏原的量逐渐增加到有效减少个体对过敏原的过敏反应的程度。聚合物包埋的抑制剂和alum-吸附的过敏原以多个公开的免疫治疗方案中定义的时间间隔重复施用，直到实现过敏原耐受。

治疗有效剂量的确定在本领域技术人员的能力范围之内。治疗有效剂量可以最初在动物模型，通常是小鼠、大鼠、兔、狗、猪或非人灵长动物中进行估计。动物模型还可以用于确定合适的施用浓度范围和施用途径。这些信息然后可以用于确定人中的施用有效剂量和施用途径。

X. 药物制剂

在一个实施方案中，疫苗组合物被掺入到适合于施用的药物组合物中。这种组合物典型地包含疫苗组合物和药学可接受的载体。如本文所使用的，“药学可接受的载体”意在包括任何的和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌试剂、等渗系统等，它们与疫苗组合物和药物施用(pharmaceutical administration)的组分相容。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域是熟知的。补充的活性化合物也可以掺入到所述组合物中。

用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬液可以包括下述组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐溶液、不挥发油、聚乙烯醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶剂，抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂例如乙二胺四乙酸，缓冲剂例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节毒性的试剂例如氯化钠或右旋葡萄糖。可以用酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠调节pH。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗试剂，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇、氯化钠。组合物应当是易于注射的流体。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，通过在分散的情况下保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂保持适当的流动性。组合物在制造和储存条件下必须是稳定的，并且其保存必须能抵抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。可以通过各种抗细菌和抗真菌试剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、thimoseral等实现对微生物作用的预防。在所有的情况下，组合物必须是无菌的。无菌注射液可以通过过滤灭菌制备。制备物可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末，优选的制备方法是由其之前的无菌过滤溶液通过真空干燥和冻干产生活性成分加任何其它所需成分的粉末。实际上，应当记住铝吸附疫苗对冷冻敏感，因此不能冻干。

引用的并且通过引用的方式合并入本文的参考文献

附图简述

图1 显示了所构建的用于不同表达系统的表达载体的示意图。构建了6个载体用于在大肠杆菌(E. coli)中表达小鼠IL-4突变蛋白QY，构建了2个载体用于在昆虫细胞中表达(TriEx + pACgp67)，并且构建了2个载体用于在哺乳动物细胞中表达(pTriEx + pcDNA3.1)。试验性表示显示使用pETER-22b+构建体的表达在每个时间内递送最佳的蛋白产量，尽管其需要再折叠。构建3个原核载体用于表达人IL-4突变蛋白RY (pTriEX, pET22b+, pETER-22b+)。

图2 显示了Ni-柱纯化和再折叠的mIL4 QY 的PAGE分析，其在Tuner(DE3)中在pTriEx中表达。还原性样品缓冲条件。从左至右：M=蛋白质大小标准(PageRuler? Plus, Fermentas)，1-8=Ni-NTA柱洗脱级分。蛋白质被表达，但是产量相对较低。

图3 显示了Ni-柱纯化和再折叠的mIL4 QY 的PAGE分析，其在pETER-22b+和BL21(DE3)中表达。考马斯染色，还原性样品缓冲条件。从左至右：M =蛋白质大小标准(PageRuler? Plus, Fermentas)，I=8 M脲中的纯化的包含体，1-8=级分11, 13, 15, 17, 19, 21, 23和25。蛋白质的表达与初始的TriEx构建体中的表达相比产量较好。

图4 显示了对大肠杆菌XL10Gold 中的pMalc2x的mIL4QY的MBP-融合蛋白切割后的PAGE分析。考马斯染色，还原性样品缓冲条件。从左至右：M =蛋白质大小标准(PageRuler? Plus, Fermentas)，1=与重组TEV蛋白酶(Mobitec, 带His-标签的)在30℃温育1小时的MBP-突变蛋白融合蛋白。2=在分批工艺中通过直链淀粉基质纯化后的切割反应。3=在分批工艺中通过Ni-NTA基质纯化后的切割反应。发生了切割，但似乎并不完全。通过直链淀粉和Ni-NTA的切割反应的纯化表明或者切割的mIL4QY非特异性地与基质结合，或者其量不足以被检测到。

图5 显示了对大肠杆菌BL21(DE3)中用pTYB11表达的mIL4QY的CBD-融合蛋白表达的PAGE分析。考马斯染色，还原性样品缓冲条件。从左至右：M=蛋白质大小标准(PageRuler? Plus, Fermentas)，1= 超声处理(sonificated)细胞的上清。2=超声处理细胞的不可溶蛋白质，溶解于8 M脲中。

图6 显示了对来自SF9中的pAcgp67B 中表达的包含mIL4 QY的不同表达的细胞裂解物的蛋白印迹分析，使用抗-V5抗体。还原性样品缓冲条件。从左至右：M =蛋白质大小标准(PageRuler? Plus, Fermentas)，1=第1次细胞裂解物，1 μl病毒原液，2=第1次细胞裂解物，5 μl病毒原液，3=第1次细胞裂解物，25 μl病毒原液，4=第2次细胞裂解物，1 μl病毒原液，5=第2次细胞裂解物，5 μl病毒原液，6=第2次细胞裂解物，25 μl病毒原液，7=第3次细胞裂解物，1 μl病毒原液，8=第3次细胞裂解物，5 μl病毒原液，9=第3次细胞裂解物，25 μl病毒原液。蛋白质在上清中仅能微弱地被检测到(数据未显示)，大部分蛋白质在细胞裂解物中被检测到，特别是在第1次和第2次的裂解物中具有最高的MOI。条带模式表明信号肽仅被部分切割。

图7 显示了使用His-标签对根据Levine 等进行的再折叠步骤与在Ni-基质上进行的再折叠的比较。PAGE凝胶，考马斯染色，还原性样品缓冲条件。从左至右： M=蛋白质大小标准(PageRuler? Plus, Fermentas)，I1=根据Levine 等的方法的包含体。L=Levine 等的纯化方案最终的可溶性mIL4蛋白。P=Levine 等的纯化方案最终的沉淀蛋白。I2=根据Ni-基质方法的包含体。N =Ni-基质纯化方案最终的可溶性mIL4蛋白。

图8 显示了通过Ni-基质再折叠方法获得的再折叠mIL4QY的CD(圆二色)光谱，在10 mM MES中，pH 5.0。光谱与公开的人IL-4的光谱非常相似。α-螺旋结构清晰可见。光谱提示仅有少量的未折叠蛋白，如果存在的话。

图9 显示了mIL-4 QY 突变蛋白对IL-4诱导增殖的抑制。由1 μg/ml抗-CD40和3 ng/ml小鼠IL-4诱导的对小鼠B-细胞增殖的抑制，对突变蛋白浓度是剂量依赖性的。通过对小鼠B-细胞进行FACS分选和抗-CD19标记来对细胞数目进行定量。加入不同浓度的mIL-4 QY突变蛋白而不进行IL-4刺激，其结果是B-细胞量没有显著变化(数据未显示)。

图10 显示了水凝胶溶液的胶凝温度的确定。在不同的温度通过倾斜试管检查凝胶的胶凝。A) 低于胶凝温度的温度。B) 胶凝温度或更高的温度。

图11 显示了突变蛋白从200 μl 1x PBS中的25%水凝胶中的释放，在37℃温育期间其上覆盖1.8 ml PBS。突变蛋白的浓度通过夹心ELISA，与100%样品(2ml PBS中的1 μg突变蛋白)相比较来确定。y-轴显示了释放到缓冲液中的突变蛋白的量，以百分数计。x-轴显示了温育时间，以小时计。

实施例

下述实施例意在举例说明，并非要限制本发明。

实施例1: 小鼠IL-4拮抗剂QY的克隆、表达和纯化

在体内检测人拮抗性IL-4突变体效果的主要障碍是IL-4的种属特异性。人IL-4不与小鼠受体结合，反之亦然。因此生成小鼠IL-4拮抗剂QY (Q116D/Y119D)用于概念验证，其中氨基酸谷氨酰胺116和酪氨酸119被突变为天冬氨酸。该小鼠IL-4突变体是人IL-4 R121D/Y124D双突变体的类似物，以高亲和力与小鼠IL-4Rα结合，而不诱导信号传导，并且对于小鼠细胞的增殖或分化没有可检测的活性，而且过量的小鼠QY突变体已被证明完全抑制对野生型小鼠IL-4的应答(Grunewald 等, 1997)。而且，在缺乏γ的条件下小鼠QY突变体也是小鼠IL-4的完全抑制剂(Andersson 等, 1997)。

小鼠IL-4拮抗剂QY (Q116D/Y119D)的克隆。

天然成熟小鼠IL4蛋白的序列被修饰以包括凝血酶可切割的N-末端6xHis-标签和QY (Q116D/Y119D)突变(参见SEQID 9)。使用用于在原核大肠杆菌细胞中表达的密码子优化将蛋白序列翻译为DNA(Puigbo 等, 2007; Grote 等, 2005)。合成序列(SEQID 10)并使用NcoI和Bsu36I限制性位点将其克隆到大肠杆菌表达载体pTriEx中(pTriEx mIL-4 QY)。将突变蛋白序列重新克隆到载体pET-22b+(Novagen，在BL21(DE3)中原核表达，N-末端pelB前导序列以及6xHis标签)、pMAL-c2X (New Englang Biolabs，在XL10Gold中原核表达，麦芽糖结合蛋白融合蛋白，具有TEV切割位点)、pTYB11 (New England Biolabs，在BL21(DE3)中原核表达，与自切割的内含肽-几丁质-结合域融合)、pETER-22b+ (在BL21(DE3)中原核表达，修饰的pET-22b+，没有pelB 前导序列，具有N-末端6xHis-和V5-表位以及TEV切割位点)、pACgp67 (在BaculoGold转染的SF9昆虫细胞中真核表达)和pcDNA3.1 (在HEK-293中真核表达，具有10xHis-和V5-表位以及TEV切割位点)中。所有载体构建体的示意图在图1中给出。这些构建体的蛋白表达的比较表明pETER-22b+构建体在每个表达时间内在蛋白产量方面提供最好的表达性能。

为进行pET-22b+构建体的构建，用引物1(IL4his-for, SEQID 5)和3(MOIL4mut-back, SEQID 11)使用PCR扩增pTriEX中的突变蛋白序列(SEQID 10)，使用Pfu聚合酶，按照制造商说明进行，且退火温度从最初5个循环的50℃上升到60℃，共30个循环。得到的PCR片段在1%琼脂糖(GeneJET Gel Extraction Kit, Fermentas)中进行凝胶纯化，并转至进行包含Nde I和Xho I (Fermentas)的限制性酶的双消化。将限制性消化产物再次进行凝胶纯化并将片段连接到Nde I和Xho I切割的pET-22b (Novagen)表达载体中。将连接产物转化到化学感受态的大肠杆菌BL21(DE3)中。对克隆pET-22b+ mIL4QY#4进行测序验证并选择用于表达研究。

为进行pETER-22b+构建体的构建，pET-22b+ mIL4QY#4被用作模板，使用引物mIL4NcoI (SEQID 12)和J#90 (SEQID 13)的PCR。使用Pfu聚合酶，按照制造商说明进行PCR，且退火温度为58.5℃，且共30个循环。得到的PCR片段在1%琼脂糖(GeneJET Gel Extraction Kit, Fermentas)中进行凝胶纯化，并转至进行包含NcoI和Not I (Fermentas)的限制性酶的双消化。将限制性消化产物再次进行凝胶纯化并将片段连接到NcoI和Not I切割的pETER-22b+表达载体中。将连接产物转化到化学感受态的大肠杆菌BL21(DE3)中。对克隆pETER-22b+ mIL4QY#8.1进行测序验证并选择用于表达研究。

表达。

pTriEx mIL-4 QY构建体被转化到包含DE3遗传因子的不同的大肠杆菌菌株(Origami?2(DE3)pLacI、Rosetta?(DE3)pLacI、Rosetta-gami B?(DE3)pLacI、BL21(DE3)pLysS、Tuner?(DE3)pLysI)中。转化的细菌在包含适当抗生素和1%葡萄糖的2xYT 培养基上生长，在37℃ 以220 rpm摇动(Innova 4300培养箱，New Brunswick Scientific)。OD600为0.8时，用1 mM IPTG诱导细胞并在37℃温育，再摇动3小时。将细胞在11.000xg 和4℃离心20分钟(Eppendorf 5804R离心机)。弃去上清并将沉淀重悬于一半体积(相应于表达培养基体积)的含有新加溶菌酶(0.1 mg/ml)的裂解缓冲液(50 mM Tris, 5 mM 钠-EDTA, pH 8.0)中。沉淀可以储存于-20℃直至开始进行再折叠方法。

包含pETER-22b+ mIL4QY#8.1的大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)在500 ml 2xYT培养基中在37℃摇动(220 rpm)生长直至OD600=0.8-1。加入1 mM IPTG诱导表达并将细胞在37℃温育，再摇动3小时。将细胞在5.000xg 和4℃离心30分钟(Eppendorf 5804R离心机)。弃去上清并将沉淀的细胞在50 ml培养基中重悬并合并(combined)。细胞再次在5.000xg 和4℃离心15分钟(Eppendorf 5804R离心机)。弃去上清并将细胞沉淀冷冻于-20℃。

根据制造商的建议表达其它载体构建体。这些构建体的示意图在图1中给出。

pMalc2x 中mIL4与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白的表达根据制造商的建议在大肠杆菌XL10Gold中进行，导致可溶性融合蛋白良好的表达产量。当用TEV蛋白酶切割时，获得的游离mIL4蛋白无法大量检测到(另见图4)。问题最有可能是归因于不利的MBP和mIL4的分子大小之比以及游离mIL4QY非特异性结合于表面的明显倾向，也许归因于不充分的折叠和暴露的疏水区。

pTYB11中mIL4与几丁质-结合域(CBD)的融合蛋白的表达根据制造商的建议在大肠杆菌BL21(DE3)中进行。当细胞在几丁质柱缓冲液中进行超声处理时，融合蛋白在不可溶的蛋白级分中发现(另见图5)，这使得其不进行再折叠就无法纯化。

pACgp67B构建体的表达在SF9细胞中使用BaculoGold (Becton Dickinson)病毒产生和扩增方法进行。使用病毒原液稀释液，经过3次病毒原液扩增之后用不同的MOI进行测试性表达。结果是使用单克隆抗-V5抗体(Invitrogen)仅在上清中检测到少量分泌mIL4。大部分蛋白质在细胞裂解物中被检测到，表明信号肽仅被部分切割(参见图6)。

从包含体再折叠。

pTriEx表达的细胞沉淀或者直接在冰上冷却或者在冰上解冻，并超声处理10分钟，占空比30%，输出功率设定为4，并使用?’’超声波发生器(Branson Sonifier 250)。溶液在11.000xg和4℃离心20分钟。弃去上清，将沉淀重悬于含有2 M脲的1/3体积的裂解缓冲液中以洗涤包含体。悬液在11.000xg和4℃离心20分钟。再次弃去上清并将沉淀重悬于含有2 M脲的裂解缓冲液中并在11.000xg和4℃离心20分钟。弃去上清并将沉淀溶解于1/6体积的提取缓冲液(6M盐酸胍，50 mM磷酸钾，1 mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0)中。在室温摇动10分钟。样品在11.000xg和4℃离心10分钟。弃去沉淀并将上清加样到Ni-柱 (Pharmacia HiTrap?FF, 1 ml)上，用提取缓冲液进行平衡，大约每分钟1 ml。用5倍体积(5 ml)的洗涤缓冲液(7 M脲，50 mM磷酸钾，100 mM氯化钠，1 mM还原型谷胱甘肽，pH 6.8)洗涤柱。用5x体积的去折叠缓冲液(7 M脲，50 mM磷酸钾，100 mM氯化钠，1 mM还原型谷胱甘肽，0.1 mM氧化型谷胱甘肽，pH 6.8)洗涤柱，且对再折叠缓冲液(50 mM磷酸钾，100 mM氯化钠，1 mM还原型谷胱甘肽，0.1 mM氧化型谷胱甘肽，pH 6.8)应用由50x体积组成的线性梯度。用5x体积的再折叠缓冲液洗涤柱并用5x体积的洗脱缓冲液(10 mM Tris, 250 mM咪唑，pH 8.0)洗脱。在15%丙烯酰胺凝胶上分析级分，且阳性级分用PBS(包含5 mM氯化镁和5 mM氯化钙)透析。发现pTriEx载体构建体在表达和再折叠中的产量在Tuner菌株中是最好的 ，但通常较低(参见图2)，因此检测了其它构建体。从表达的简便和产量的角度来说，pETER-22b+构建体是优选的。

来自基于pETER-22b+的表达的细胞被解冻并重悬于50 ml Tris缓冲液(50 mM Tris, pH 7.5; Sigma-Aldrich)中，并在冰上超声处理10分钟(40%占空比，输出功率设定为4，使用?’’超声波发生器；Branson Sonifier 250)。溶液在10.000xg和4℃离心30分钟(Sorvall RC-5B)。将沉淀重悬于45 ml含有1.5% Triton X-100(Sigma-Aldrich)的Tris缓冲液中。将重悬液使用上述设定再次超声处理并在旋转混合器(roller)上的50 ml管中在4℃温育过夜。溶液在10.000xg和4℃再次离心30分钟，弃去上清并将沉淀重悬于Tris缓冲液中。溶液在10.000xg和4℃再次离心30分钟，弃去上清并将沉淀重悬于5 ml包含8 M脲的1x PBS (磷酸盐缓冲液)中，pH调节为8.0。溶液再次离心并将上清加样到与?kta层析仪器(Pharmacia, ?kta Prime)连接的Ni-亲和基质柱(Pharmacia, HiTrap? Ni 1 ml)上。用55 ml PBS + 8 M 脲洗涤柱然后换用不含脲的160 ml PBS pH 8.0。并然后用195 ml包含10 mM咪唑的PBS pH 8.0洗涤柱，然后用250 ml包含300 mM咪唑的PBS洗脱柱。在考马斯染色的PAGE上分析的洗脱级分显示于图3。

一种可选的再折叠策略是根据已公开的Levine 等(1995)的方法进行。纯化的包含体溶解于提取缓冲液A(50 mM CHES，4 M盐酸胍，500 mM NaCl，50 mM DTT, pH 9.5)中并在室温放置6小时。溶液针对15倍体积的二硫化物慢速形成缓冲液B (50 mM CHES，4 M盐酸胍，500 mM NaCl，20 mM半胱氨酸，pH 9.5)在室温透析12小时。然后透析缓冲液与二硫化物快速形成缓冲液C(50 mM CHES, 4 M盐酸胍，500 mM NaCl，20 mM半胱氨酸，pH 9.5)交换。12小时后更换为缓冲液D(50 mM CHES，4 M盐酸胍，500 mM NaCl, pH 9.5)。12小时后将缓冲液更换为新鲜缓冲液D。氧化的mIL4然后针对再折叠缓冲液E(50 mM CHES, 500 mM NaCl, pH 9.5)透析12小时。更换新的缓冲液E继续再透析12小时。针对缓冲液F(50 mM CHES, pH 9.5)透析除去盐。特别是在最后一步中形成黄白色沉淀形式。透析之后溶液在4℃ 在10.000xg离心30分钟以除去不可溶的沉淀形式。再折叠的mIL4针对储存缓冲液G(50 mM乙酸，pH 5)透析。在透析过程中形成大量发白的沉淀。通过离心再次除去它们。对沉淀的分析表明其主要由不可溶的mIL4蛋白组成。根据Levine 等的再折叠方法的总时间范围是大约4天。图7中显示了两种折叠方法的比较。可以看出在Levine 等的方法的最后一步中大部分蛋白沉淀，仅有少量蛋白保持可溶。Ni-基质再折叠策略中可溶性mIL4浓度较高。

His-标签的去除。

优选通过将融合蛋白与重组TEV蛋白酶(带His-标签的, Mobitec)温育，在4℃ 过夜切割除去His-标签，根据制造商的建议进行。残留的TEV蛋白酶可以通过在Ni-亲和基质上进行层析除去。将被切割的蛋白过Ni-基质微球除去His-标签。纯化的样品在所期望的缓冲液中透析并保持在4℃进行短期保存或在存在25%甘油的条件下储存于-80℃。

正确再折叠的分析。

小鼠IL-4拮抗剂QY的结构完整性通过圆二色性进行分析。光谱显示其α-螺旋模式与类似的已公开的人IL4的光谱相同。可以推断所分析的再折叠的来自于pETER-22b+ 的mIL4QY处于均一的折叠状态。

对正确折叠的另一种功能性测试是小鼠IL-4和小鼠IL-4拮抗剂QY对小鼠IL-4受体的细胞结合测定。在T细胞增殖测定中确定小鼠IL-4和小鼠IL-4拮抗剂QY的功能(详见实施例2)。

实施例2: 用于小鼠IL-4和小鼠IL-4拮抗剂QY定量确定的体外测定

用于小鼠IL-4和小鼠IL-4拮抗剂QY的体外测定包括ELISA-类型的测定和细胞测定。ELISA-类型的测定提供被抗-小鼠IL-4抗体识别的小鼠IL-4表位的浓度和完整性的相关信息。小鼠IL-4拮抗剂QY的结构-功能完整性的相关信息由分析小鼠IL-4和小鼠IL-4拮抗剂QY与小鼠IL-4受体的结合的细胞结合测定获得。在T细胞增殖测定中确定小鼠IL-4和小鼠IL-4拮抗剂QY的功能。

ELISA分析。

小鼠IL-4或小鼠IL-4突变体的浓度通过ELISA(小鼠IL-4夹心ELISA cat# CMC0043, Invitrogen)确定，根据制造商的说明进行。

用于小鼠IL-4和小鼠IL-4拮抗剂QY的细胞结合测定。

使用生物素化的抗-IL-4抗体和荧光标记的链霉亲和素蛋白通过FACScan分析检测小鼠IL-4和小鼠IL-4拮抗剂QY与小鼠脾细胞或CTLL-2细胞表面上的IL-4受体分子的结合。小鼠CTLL-2细胞是IL-2-依赖性的，且典型地每个细胞表达2000-5000个Il-4受体。

小鼠CTLL-2细胞，得自ATCC (ATCC TIB 214)，在包含8%胎牛血清、100单位/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，并加入100 ng/ml IL-2的RPMI 1640中培养。为进行细胞结合检测，5 x 10⁶个细胞在150 μl包含1% (w/v) BSA、1 x 10^-9 M重组小鼠(rmu) IL-4或小鼠IL-4拮抗剂QY的PBS (pH 7.4)中在37℃温育30分钟。将混合物冷至4℃，在包含1% (w/v) BSA的大量PBS (pH 7.4)中洗涤一次，重悬于150 μl PBS (pH 7.4)中并进行FACScan分析。

T细胞增殖测定–CTLL-2细胞。

Il-4诱导的CTLL-2细胞的增殖通过文献所述(Duschl 等, 1992)的[³H]胸腺嘧啶掺入来确定。小鼠IL-4拮抗剂QY的抑制效果通过向IL-4加入递增量的拮抗剂来确定。

在最后4小时期间掺入的[³H]胸腺嘧啶的量被确定之前，CTLL-2细胞以密度为5 x 10⁵/ml的0.2 ml的等分试样与小鼠IL-4的log 2稀释液温育3天。产生半最大应答的IL-4的浓度被用于确定小鼠IL-4拮抗剂QY的抑制活性。在这些实验中，小鼠IL-4拮抗剂QY的log 2稀释液被加入到野生型的小鼠IL-4中。

T细胞增殖测定–小鼠脾B-细胞。

根据Hasbold 等(Eur. J. Immunol. 28:1040-1051, 1998)进行增殖测定。来自于C57/BL/6小鼠的幼稚脾细胞在CO₂-控制的无菌培养箱中在组织培养盘(Nunc)中在培养基(具有1%谷氨酰胺，1%青霉素-链霉素，10%胎牛血清，50 μM β-巯基乙醇，1%丙酮酸钠和1%非必需氨基酸(NEAA)的RPMI 1640 + L-谷氨酰胺 (Gibco))中培养。每孔200 μl培养基中共培养2*10⁶个小鼠脾细胞。用抗-CD40 (1μg/ml)和小鼠重组IL-4 (3ng/ml)诱导细胞增殖。向培养基中加入IL-4QY突变蛋白以抑制增殖反应。突变蛋白的肠毒素浓度确定为0.01-0.02 ng/μg。根据Grunewald 等 (1997)中公开的动力学数据选择小鼠IL-4和mIL-4 QY的浓度。向增殖反应中加入0, 250, 500和1000 ng/ml突变蛋白。增殖被允许继续进行4天。通过FACS对细胞进行计数。通过用抗-CD19抗体标记对B细胞进行特异性计数。

在250和1000 ng/ml之间的重组mIL-4 QY 突变蛋白检测到增加的对增殖的抑制，所述突变蛋白在大肠杆菌中表达(pETER-22b+构建体)并在Ni-基质上再折叠(参见图9)。加入不同浓度的mIL-4 QY 突变蛋白而不进行IL-4刺激导致B-细胞数量没有显著变化(数据未显示)。

实施例3: 热胶凝PLGA-PEG-PLGA 水凝胶的合成和表征

本实施例中所描述的生物可降解三嵌段聚合物由30% PEG (1500)和摩尔比为15/1(重量比为18.6/1)的丙交酯/乙交酯组成。三嵌段共聚物的合成根据已公开的方案(Quiao 等, 2005; WO 02/102309)进行。

共聚物合成。

聚乙二醇(PEG 1500)购自Fluka，聚(DL-丙交酯)来自Sigma，乙交酯(1,4-二噁烷-2,5-二酮)来自Sigma，含锡2-己酸乙酯来自Aldrich。

使用共25 g的DL-丙交酯、乙交酯和PEG进行聚合反应(16.61 g DL-丙交酯、0.89 g乙交酯、7.5 g PEG 1500)。在氮气气氛下，PEG 1500在圆形烧瓶(装有氩气/真空进口)中干燥，在真空下在120℃搅拌2 h。在氩气下加入丙交酯和乙交酯，在搅拌状态下用注射器加入40 μl含锡2-己酸乙酯。然后在氩气下将管子密封。将密封管浸入并保持在150℃恒温的油浴中。8 h后将管子冷却到室温，并将产品在冷水中溶解。完全溶解后，将共聚物溶液加热到80℃以使共聚物沉淀并除去水溶性的低分子量共聚物和未反应的单体。倾去上清，将沉淀的共聚物再次在冷水中溶解，然后加热以诱导沉淀。这个溶解后沉淀的过程重复三次。最后，在室温在真空下干燥共聚物，直至恒重。

分子量确定。

共聚物的分子量通过凝胶渗透层析确定，使用如Quiao 等 (2005)所述的聚苯乙烯标准。

胶凝温度的测量。

胶凝温度如Quiao 等 (2005)所述进行确定。200 μl的水中的25% w/w水凝胶聚合物溶液被转移至置于温控培养箱中的2 ml圆底反应管中。溶液以每次测量1℃的控制速度进行加热。在每个温度，管子被移出培养箱并倾斜至90度。当溶液显示出胶凝和固态，温度计上读取的温度被确定为胶凝温度(另见图10)。上述水凝胶的胶凝温度确定为32℃。

实施例4: 热胶凝PLGA-PEG-PLGA水凝胶的体外降解

在磷酸盐缓冲液(PBS)中温育后通过随时间经过的质量损失和分子量减少评价实施例3的共聚物的体外降解行为。

200 μl PBS中的25%水凝胶被转移至2 ml管(确定空管质量)中并在37℃进行胶凝。凝胶上覆盖1.8 ml PBS。在水浴中轻微搅动的条件下在37℃在pH 7.4的PBS中温育几个样品。在预定的时间间隔取走一个样品，小心吸去上清。对装有固体凝胶残余物的管子进行称重(重量包括水凝胶、缓冲盐和水)并随后进行冻干。对装有干燥凝胶的管子进行称重(重量包括水凝胶和缓冲盐)并计算重量损失。假定1 ml水包含9.8 μg盐(1x PBS)。然后将固体残余物在冷水中溶解并使用聚苯乙烯标准通过凝胶渗透层析进行分析，如Quiao 等 (2005)所述。上述的凝胶在6个小时期间膨胀+23%并在48小时达到最大的+41%，如凝胶水含量差异所确定的。同时，凝胶在1小时后降解4%，3小时后降解27%，6小时后降解51%，并在48小时后达到55%的重量损失，如冻干水凝胶重量差异所确定的。合成凝胶的性质允许假设由于膨胀和降解的组合作用导致在最初的6-12小时中包埋的小分子发生升高的释放，然后在凝胶较慢降解的其余时间中更为恒定地释放。

实施例5: 小鼠IL-4拮抗剂从PLGA-PEG-PLGA/小鼠IL-4拮抗剂QY复合体中的体外释放

将实施例3的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物在室温溶解于蒸馏水中，得到30% w/w原液溶液。包含小鼠IL-4拮抗剂QY(1 μg/ml)的25% w/w水凝胶溶液通过将166,6 μl水凝胶原液3、33 μl water、20 μl 10x PBS和10 μl mIl-4QY (200 μg/ml)混合来制备。然后将200 μl的配制物置于2 ml反应管中，在37℃温育5分钟直至胶凝，并用1.8 ml预加温的1x PBS pH 7.4覆盖。将小瓶进一步在37℃温育。在指定的样品收集时间，除去上清并替换以相同体积的PBS pH 7.4以维持释放条件。

释放的小鼠IL-4拮抗剂QY的量通过ELISA-类型的测定确定，如实施例2所述。1小时后，~2%的突变蛋白释放。12小时后~3.5%且24小时的时候~5.5%的突变蛋白由上述水凝胶释放(参见图11)。

实施例6: PLGA-PEG-PLGA/小鼠IL-4拮抗剂QY复合体的生物降解和释放特征

为了测试包含小鼠IL-4拮抗剂QY的PLGA-PEG-PLGA水凝胶复合体的体内凝胶形成行为和释放特征，将该复合体皮下注射到已用乙醚麻醉的小鼠中。然后在试验期间允许获得的凝胶植入物在体内发展。在每个注射后的取样点，处死小鼠并从皮下注射部位移出凝胶植入物。在确定所移出的凝胶植入物的体积之后，如实施例5所述确定小鼠IL-4拮抗剂QY剩余的体外可释放量。

野生型BALB/c小鼠(1组:16只小鼠)被用于分析体内凝胶形成行为和释放特征。使用包含递增剂量的小鼠IL-4拮抗剂QY(0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml或2.0 mg/ml)的25% (w/w)聚合物。根据下述计划进行分析：在第0天植入200 μl聚合物复合体，在第1,2,3,4,5,10,20和30天在两只小鼠中进行大小和剩余释放的分析。

实施例7: 聚合物包埋的IL-4拮抗剂QY和alum-吸附的卵清蛋白的共注射对于小鼠中体液免疫应答的效果

本实施例显示了皮下注射聚合物包埋的小鼠IL-4拮抗剂QY，然后在胶凝的聚合物复合体的部位注射alum-吸附的卵清蛋白(OVA)对于小鼠中体液免疫应答和过敏症状发展的效果。

8-12周龄的雌性野生型BALB/c小鼠购自Charles River (Sulzfeld, Germany)。将动物置于特定的无病原体条件下并用不含卵清蛋白的饮食饲养。V级卵清蛋白(OVA)购自Sigma，Imject Alum来自Pierce/KMF，大鼠抗小鼠IgE和IgG1单克隆抗体和羊抗小鼠IgG2a、IgG2b和IgG3抗血清来自BD Pharmigen。

alum-吸附的卵清蛋白(OVA)的制备。

OVA (100 μg)溶解于0.3 ml的PBS, pH 7.4中，并与0.70 ml Imject Alum混合。

处理方法。

将溶解于包含递增剂量(0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml或2.0 mg/ml)的小鼠IL-4拮抗剂QY的蒸馏水中的200 μl 的实施例3的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物对小鼠进行皮下注射。这些实验中共聚物的最终浓度为25% w/w。对照组接受不包埋IL-4拮抗剂QY的共聚物。在用OVA进行免疫之前，进行OVA-特异性抗体、血清中的细胞因子水平和FOXP3和GATA3 mRNA表达的分析。6个小时后，在胶凝的聚合物复合体的部位皮下注射100 μl alum-吸附的OVA (10 μg，在100 μl PBS/Imject Alum中) (胶凝聚合物的每一侧50 μl)。用OVA免疫后的第5天，给一组小鼠(第6组)再次注射100 μl的包含小鼠IL-4拮抗剂QY的实施例3的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物。用OVA免疫后的第10天，分析OVA-特异性抗体的血清水平。进一步，评价经由OVA皮内注射(每组3只小鼠)激发后皮肤应答中的速发型超敏反应和静脉内注射OVA(每组3只小鼠)后过敏性休克的发展。腹股沟淋巴结被用于对T细胞表型进行详细分析。

分析六组野生型BALB/c小鼠(每组：6只小鼠)：第1组(对照1)：无负载聚合物，假免疫；第2组(对照2)：无负载聚合物，用alum-OVA免疫；第3组：一次注射有负载聚合物(100 μg拮抗剂)，用alum-OVA免疫；第4组：一次注射有负载聚合物(200 μg拮抗剂)，用alum-OVA免疫；第5组：一次注射有负载聚合物(400 μg拮抗剂)，用alum-OVA免疫；以及第6组：两次注射有负载聚合物(共600 μg拮抗剂)，用alum-OVA免疫。

OVA-特异性抗体的血清水平的分析。

在用OVA免疫前的第0天和10天后从小鼠取血。通过ELISA确定小鼠抗-OVA IgE和IgG亚类。用100 μl 0.1 M NaHCO₃中的10 μg OVA在37℃ 包被板6 h，然后用200 μl PBS, pH 7.4中的3% BSA 在37℃封闭2 h。洗涤后，将100 μl包含1% BSA 的1:40的血清的PBS, pH 7.4稀释液在4℃温育过夜。用对小鼠重链类(IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3)具有特异性的辣根过氧化物酶缀合的抗体分析结合抗体的量。在微板自动判读仪中在405 nm进行分析。

细胞因子的血清水平的分析。

细胞因子上清用包括Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13在内的一组27个细胞因子进行描述。

FOXP3和GATA3 mRNA表达的分析。

用T细胞分化的表现（read-out）是FOXP3和GATA3 mRNA的表达，其被可逆地调节。此外，使用STAT6应答性荧光素酶系统报告系统对释放进行实时跟踪。

速发型皮肤超敏反应的分析。

静脉注射200 μl PBS, pH 7.4中的0.5%伊文思蓝染料后通过皮肤测试检测主动皮肤过敏反应。之后给腹部皮肤刮毛，并在皮肤上用签字笔标记四个注射部位。两个标记的注射部位皮内注射50 μl包含50 μg OVA 的PBS, pH 7.4，且另外两个部位注射不含蛋白质的PBS, pH 7.4。15分钟后，用颈椎脱臼法处死小鼠并剥下皮肤用于检查注射部位。由于肥大细胞脱颗粒时流体外渗入注射部位导致的皮肤背面形成的蓝色斑块的密度由两个独立的观察者来评分。当蓝色斑块直径大于在小鼠皮肤上被预先标记的5 mm时，反应被认定为阳性。发蓝的密度按如下方式认定： 0=没有蓝色斑块形成；1=轻微发蓝；2=明显发蓝；3=强烈发蓝。

过敏性休克症状的分析。

小鼠被静脉内注射200 μl 0.5%伊文思蓝溶液中的500 μg OVA。15分钟后，评价过敏性休克的症状，包括发蓝(没有=0；轻微=1；强烈=2)，竖毛(没有=0；轻微=1；强烈=2)，自发活动(到处跑=0；顺从地坐=1；躺倒=2)，以及对外部刺激的反应性(触碰时逃跑=0；轻微反应=1；无反应=2)。如果由两个并不知道每个动物的敏化状态的独立观察者观察到所指出的四个症状中的至少三个，则视为动物处于休克状态。

腹股沟淋巴结中的T细胞表型分析。

移除右边和左边的腹股沟淋巴结并通过用过敏原体外再刺激来测试T细胞表型(ELISPOT/Luminex)。

实施例8: 用alum-吸附的OVA和PLGA-PEG-PLGA/小鼠IL-4拮抗剂QY复合体对OVA-致敏的小鼠的特异性免疫治疗

本实施例显示了使用皮下注射的聚合物包埋的IL-4拮抗剂QY和在胶凝的聚合物复合体部位共注射的alum-吸附的OVA，在OVA-致敏小鼠中的免疫治疗疗效。

8-12周龄的雌性野生型BALB/c小鼠购自Charles River (Sulzfeld, Germany)。将动物置于特定的无病原体条件下并用不含卵清蛋白的饮食饲养。V级卵清蛋白(OVA)购自Sigma，Imject Alum购自Pierce/KMF，大鼠抗小鼠IgE和IgG1单克隆抗体和羊抗小鼠IgG2a、IgG2b和IgG3抗血清购自BD Pharmigen。

alum-吸附的卵清蛋白(OVA)的制备。

OVA (100 μg)溶解于0.3 ml的PBS, pH 7.4中，并与0.70 ml Imject Alum(Pierce/KMF)混合。

变应性致敏方法。

通过腹腔注射与70 μl作为佐剂的Imject Alum混合的200 μl PBS, pH 7.4中的10 μg OVA免疫小鼠三次。第二次腹腔注射在第一次注射后7天进行，第三次注射在第一次注射后14天进行。

免疫治疗。

第三次用OVA免疫后一周，对小鼠进行两种不同形式的免疫治疗，一种是基于用递增剂量的alum-吸附的OVA进行的常规治疗，另一种是基于在存在聚合物包埋的小鼠IL-4拮抗剂QY的条件下用递增剂量的alum-吸附的OVA进行的治疗。递增剂量的alum-吸附的OVA的皮下施用以10天的间隔进行。在10天的间隔内的第0天和第5天进行聚合物包埋的小鼠IL-4拮抗剂QY的皮下施用。

对于仅仅使用alum-吸附的OVA对小鼠进行的免疫治疗，100 μl包含递增剂量的OVA(5, 15, 30, 60, 90 μg)的PBS/Imject Alum以10天的间隔进行皮下注射。

对于在存在聚合物包埋的小鼠IL-4拮抗剂QY的条件下用alum-吸附的OVA对小鼠进行的免疫治疗，首先皮下注射200 μl包含实施例3的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的蒸馏水(15% w/w或25% w/w)和400 μg小鼠IL-4拮抗剂QY。聚合物复合体胶凝后，在胶凝的聚合物复合体的部位皮下注射100 μl包含递增剂量的OVA(5, 15, 30, 60, 90 μg)的PBS/Imject Alum(胶凝聚合物每侧50 μl)。在每个10天间隔内的第5天，在第一次注射的部位皮下注射100 μl包含实施例3的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的蒸馏水(15% w/w或25% w/w)和200 μg小鼠IL-4拮抗剂QY。在不同的皮下部位重复注射程序三次，直至最高剂量的alum-吸附的OVA被注射。

最后一次免疫治疗性治疗之后的第10天，分析OVA-特异性抗体的血清水平。进一步，评价通过OVA皮内注射激发后皮肤反应中的速发型超敏反应和OVA静脉注射后过敏性休克的发展。

分析三组野生型BALB/c小鼠(每组：10只小鼠)：第1组：免疫(3 x alum-OVA)，用无负载聚合物和PBS治疗；第2组：免疫(3 x alum-OVA)，用无负载聚合物和alum-OVA治疗；以及第3组：免疫(3 x alum-OVA)，用alum-OVA治疗。

OVA-特异性抗体的血清水平的分析。

在用OVA免疫前的第0天和10天后从小鼠取血。通过ELISA确定小鼠抗-OVA IgE和IgG亚类。用100 μl 0.1 M NaHCO₃中的10 μg OVA在37℃ 包被板6 h，然后用200 μl PBS, pH 7.4中的3% BSA 在37℃封闭2 h。洗涤后，将100 μl包含1% BSA 的1:40血清的PBS, pH 7.4稀释液在4℃温育过夜。用对小鼠重链类(IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3)具有特异性的辣根过氧化物酶缀合的抗体分析结合抗体的量。在微板自动判读仪中在405 nm进行分析。

细胞因子的血清水平的分析。

细胞因子上清用包括Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13在内的一组27个细胞因子进行描述。

FOXP3和GATA3 mRNA表达的分析。

T细胞分化的表现是FOXP3和GATA3 mRNA的表达，其被可逆地调节。此外，使用STAT6应答性荧光素酶系统报告系统对释放进行实时跟踪。

速发型皮肤超敏反应的分析。

静脉内注射200 μl PBS, pH 7.4中的0.5%伊文思蓝染料后通过皮肤测试检测主动皮肤过敏反应。之后给腹部皮肤刮毛，并在皮肤上用签字笔标记四个注射部位。两个标记的注射部位皮内注射50 μl包含50 μg OVA 的PBS, pH 7.4，另外两个部位注射不含蛋白质的PBS, pH 7.4。15分钟后，用颈椎脱臼法处死小鼠并剥下皮肤用于检查注射部位。由于肥大细胞脱颗粒时流体外渗入注射部位导致的皮肤背面形成的蓝色斑块的密度由两个独立的观察者来评分。当蓝色斑块直径大于在小鼠皮肤上被预先标记的5 mm时，反应被认定为阳性。发蓝的密度按如下方式认定： 0=没有蓝色斑块形成；1=轻微发蓝；2=明显发蓝；3=强烈发蓝。

过敏性休克症状的分析。

小鼠被静脉内注射200 μl 0.5%伊文思蓝溶液中的500 μg OVA。15分钟后，评价过敏性休克的症状，包括发蓝(没有=0；轻微=1；强烈=2)，竖毛(没有=0；轻微=1；强烈=2)，自发活动(到处跑=0；顺从地坐=1；躺倒=2)，以及对外部刺激的反应性(触碰时逃跑=0；轻微反应=1；无反应=2)。如果由两个并不知道每个动物的敏化状态的独立观察者观察到所指出的四个症状中的至少三个，则视为动物处于休克状态。

腹股沟淋巴结中的T细胞表型分析。

移除右边和左边的腹股沟淋巴结并通过用过敏原体外再刺激来测试T细胞表型(ELISPOT/Luminex)。

实施例9: 人IL-4拮抗剂RY的克隆、表达和纯化

人IL-4拮抗剂RY(R121D/Y124D)的克隆。

天然成熟人IL-4蛋白的序列被修饰以包括TEV可切割的N-末端6xHis-标签和RY (R121D/Y124D)突变(参见SEQID 03)。使用在原核大肠杆菌细胞中表达的密码子优化(Puigbo 等, 2007; Grote 等, 2005)将蛋白序列翻译为DNA。合成并使用引物1(SEQID 5, IL4his-for)和2(SEQID 6, HUIL4mut-back)通过PCR扩增得到的序列(SEQID 04)，使用Pfu聚合酶，按照制造商说明进行，且退火温度从最初5个循环的40℃上升到55℃，共30个循环。得到的PCR片段在1%琼脂糖(GeneJET Gel Extraction Kit, Fermentas)中进行凝胶纯化，并转至进行包含Nde I和Xho I (Fermentas)的限制性酶双消化。将限制性消化片段再次进行凝胶纯化并将片段连接到Nde I和Xho I切割的pET-22b (Novagen)表达载体中。得到的克隆用作模板以产生pETER-22b+构建体，如用小鼠IL-4突变蛋白QY所述的。

表达。

包含人IL-4突变蛋白表达载体pETER-22b+ mIL4 RY的大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)在500 ml 2xYT培养基中在37℃摇动(220 rpm)生长直至OD600=0.8-1。加入1 mM IPTG诱导表达并将细胞在37℃温育，再摇动3小时。将细胞在5.000xg 和4℃离心30分钟(Eppendorf 5804R离心机)。弃去上清并将沉淀的细胞在50 ml培养基中重悬并合并。细胞再次在5.000xg和4℃离心15分钟(Eppendorf 5804R离心机)。弃去上清并将细胞沉淀冷冻于-20℃。

从包含体再折叠。

来自基于pETER-22b+的表达的细胞被解冻并重悬于50 ml Tris缓冲液(50 mM Tris, pH 7.5; Sigma-Aldrich)中，并在冰上超声处理10分钟(40%占空比，输出功率设定为4，使用?’’超声波发生器；Branson Sonifier 250)。溶液在10.000xg和4℃离心30分钟(Sorvall RC-5B)。将沉淀重悬于45 ml含有1.5% Triton X-100的Tris缓冲液(Sigma-Aldrich)中。将重悬液使用上述设定再次超声处理并在旋转混合器上的50 ml管中在4℃温育过夜。溶液在10.000xg和4℃再次离心30分钟，弃去上清并将沉淀重悬于Tris缓冲液中。溶液在10.000xg和4℃再次离心30分钟，弃去上清并将沉淀重悬于5 ml包含8 M脲的1x PBS (磷酸盐缓冲液)中，pH调节为8.0。溶液再次离心并将上清加样到与?kta层析仪器(Pharmacia, ?kta Prime)连接的Ni-亲和基质柱(Pharmacia, HiTrap? Ni 1 ml)上。在4℃进行层析。用55 ml PBS + 8 M 脲洗涤柱然后换用不含脲的160 ml PBS pH 8.0。然后用195 ml包含10 mM咪唑的PBS pH 8.0洗涤柱，然后用250 ml包含300 mM咪唑的PBS洗脱柱。蛋白质浓缩为大约2 mg/ml。

His-标签的去除。

优选通过将融合蛋白与重组TEV蛋白酶(带His-标签的, Mobitec)温育，在4℃过夜切割除去His-标签，根据制造商的建议进行。残留的TEV蛋白酶可以通过在Ni-亲和基质上进行层析除去。将被切割的蛋白过Ni-基质微球除去His-标签。纯化的样品在所期望的缓冲液中透析并在4℃进行短期保存或在存在25%甘油的条件下储存于-80℃。

正确再折叠的分析。

小鼠IL-4拮抗剂RY的结构完整性通过圆二色性进行分析。光谱显示其α-螺旋模式与类似的已公开的人IL4或小鼠IL-4突变蛋白QY的光谱相同。可以推断所分析的再折叠的来自于pETER-22b+ 的mIL4RY正确地折叠。

对正确折叠的另一种功能测定是小鼠IL-4和小鼠IL-4拮抗剂QY对小鼠IL-4受体的细胞结合测定。在T细胞增殖测定中确定小鼠IL-4和小鼠IL-4拮抗剂QY的功能(详见实施例10)。

实施例10: 用于人IL-4和人IL-4拮抗剂RY的定量确定的体外测定

用于人IL-4和人IL-4拮抗剂RY的体外测定包括ELISA-类型的测定和细胞测定。ELISA-类型的测定提供被抗-人IL-4抗体识别的人IL-4表位的浓度和完整性的相关信息。人IL-4拮抗剂RY的结构-功能完整性的相关信息由分析人IL-4和人IL-4拮抗剂RY与人IL-4受体的结合的细胞结合测定获得。在T细胞增殖测定中确定人IL-4和人IL-4拮抗剂RY的功能性。

ELISA分析。

人IL-4或人IL-4突变体的浓度通过ELISA(LEGEND MAX?人IL-4 ELISA试剂盒, BioLegend GmbH)确定，根据制造商的说明进行。

细胞结合测定。

使用生物素化的抗-IL-4抗体和荧光标记的链霉亲和素蛋白通过FACScan 分析检测人IL-4或人IL-4拮抗剂RY与人Raji B-淋巴细胞表面上的IL-4受体分子的结合。

人Raji B-淋巴细胞得自ATCC (ATCC CLL-86)，在包含10%胎牛血清的RPMI 1640中培养。细胞(5 x 10⁶)在150 μl包含1% (w/v) BSA、1 x 10^-9 M人 IL-4或人IL-4拮抗剂RY的PBS (pH 7.4)中在37℃温育30分钟。将混合物冷冻至4℃，在包含1% (w/v) BSA的大体积PBS (pH 7.4)中洗涤一次，重悬于150 μl PBS (pH 7.4)中并进行FACScan分析。

T细胞增殖测定。

外周血单核细胞得自健康供体，由Ficoll-Hypaque离心法(Pharmacia)纯化，并在-80℃以等分试样储存。解冻的细胞用9 μg/ml 植物血凝素(PHA; HA-15, Wellcome)培养7天，且在这个阶段包含高百分率的活化的T-细胞(PHA-原始细胞)。在确定细胞计数之前，细胞(10⁵/200 μl)与人IL-4的log 2稀释液温育4天。产生最大半应答的IL-4的浓度被用于确定人IL-4拮抗剂RY的抑制活性。在这些实验中，人IL-4拮抗剂RY的log 2稀释液被加入到野生型的人IL-4中。

实施例 11: 人IL-4拮抗剂RY从PLGA-PEG-PLGA/人IL-4拮抗剂RY复合体中的体外释放

将实施例3的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物在室温溶解于包含不同浓度人IL-4拮抗剂RY(0.5 mg/ml至多2.0 mg/ml)的蒸馏水中，以制备25% w/w溶液。然后将200 μl的配制物置于2 ml反应小瓶中，在37℃温育5分钟直至胶凝，并加入1.8 ml PBS pH 7.4。将小瓶在37℃以100 rpm摇动。在指定的样品收集时间，取出样品并替换以相同体积的PBS pH 7.4以维持释放条件。

释放的人IL-4拮抗剂RY的量通过如实施例10所述的ELISA-类型的测定确定。释放的人IL-4拮抗剂RY的结构完整性通过如实施例10所述的细胞结合测定来确定。释放的人IL-4拮抗剂RY的功能性通过如实施例10所述对IL-4-诱导的T细胞增殖的抑制来确定。

序列

<110> PLS-Design GmbH

<120> 用于过敏反应治疗的药物组合物

<160> 13

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 614

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> 来源

<222> 1..614

<223> /分子类型="未定义的DNA"

/注释="人白介素-4，前肽序列"

/生物="智人"

<400> 1

<210> 2

<211> 153

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 人白介素-4，前肽翻译的DNA序列

<400> 2

<210> 3

<211> 150

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 人白介素-4 (RY-双突变体，N-末端具有His-标签

成熟肽序列

<400> 3

<210> 4

<211> 450

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> 来源

<222> 1..450

<223> /分子类型="未定义的DNA"

/注释="人白介素-4，N-末端具有His-标签的成熟肽

序列"

/生物="智人"

<400> 4

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> 来源

<222> 1..29

<223> /分子类型="未定义的DNA"

/注释="引物1 (IL4his-for)"

/生物="智人"

<400> 5

aaaaaaccat atgggttctt ctcaccacc 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> 来源

<222> 1..29

<223> /分子类型="未定义的DNA"

/注释="引物2 (HUIL4mut-back)"

/生物="智人"

<400> 6

aaaactcgag ttaagaagag catttagag 29

<210> 7

<211> 580

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>

<221> 来源

<222> 1..580

<223> /分子类型="未定义的DNA"

/注释="小鼠白介素-4, 前肽序列"

/生物="小鼠"

<400> 7

<210> 8

<211> 140

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<223> 小鼠白介素-4, 前肽翻译的DNA 序列

<400> 8

<210> 9

<211> 141

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<223> 小鼠白介素-4, QY-双突变体，具有His-标签.

<400> 9

<210> 10

<211> 423

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>

<221> 来源

<222> 1..423

<223> /分子类型="未定义的DNA"

/注释="小鼠白介素-4 QY-双突变体"

/生物="小鼠"

<400> 10

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>

<221> 来源

<222> 1..29

<223> /分子类型="未定义的DNA"

/注释="引物3 (MOIL4mut-back) "

/生物="小鼠"

<400> 11

aaaactcgag ttaagagtcg tccatgtcc 29

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>

<221> 来源

<222> 1..41

<223> /分子类型="未定义的DNA"

/注释="引物4 (mIL4NcoI) "

/生物="小鼠"

<400> 12

gatcccatgg gcacattcac gggtgtgaca aaaatcatct g 41

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>

<221> 来源

<222> 1..38

<223> /分子类型="未定义的DNA"

/注释="引物5 (J#90)"

/生物="小鼠"

<400> 13

gatcgcggcc gctcagctgt catccatatc catgatcg 38

Claims (15)

1.药物组合物，其由一种或多种制备物组成，且包含生理学有效剂量的至少一种IL-4和/或IL-13抑制剂和至少一种过敏原，以及基质，其中至少所述抑制剂是溶解的或包埋于所述基质中，或者至少所述抑制剂包被或吸附于所述基质上，其中选择所述基质以使得所述抑制剂能够延长性释放。

2.根据权利要求1的组合物，其中所述抑制剂选自拮抗性IL-4和/或IL-13衍生物、对IL-4和/或IL-13和/或它们的前体具有特异性的可溶性细胞因子受体构建体、对IL-4和/或IL-13和/或它们的前体和/或它们的受体具有特异性的单克隆抗体、这些抗体的结合片段、对IL-4和/或IL-13和/或它们的前体和/或它们的受体具有特异性的蛋白质构建体以及对IL-4和/或IL-13和/或它们的前体和/或它们的受体具有特异性的适配体组成的组。

3.根据权利要求1或2的组合物，其中包含至少两种不同的抑制剂，其中至少一种抑制剂抑制IL-4且至少一种其它抑制剂抑制IL-13，或者其中包含至少一种抑制IL-4和IL-13二者的抑制剂。

4.根据权利要求1-3之一的组合物，其中所述抑制剂具有小于7天的血浆半衰期，优选小于1天，最优选小于6或5个小时。

5.根据权利要求1-4之一的组合物，其中所述抑制剂是具有一至三个突变的人IL-4突变体，优选在位置R121、Y124和S125的至少一个。

6.根据权利要求1-5之一的组合物，其中所述基质是生物可降解的或非生物降解的有机聚合物，优选生物可降解的，更优选热胶凝的，特别是选自基于苯乙烯-异丁烯的嵌段共聚物、烯烃聚合物、聚乙烯、聚丙烯、聚环氧乙烷(PEO)、聚环氧丙烷(PPO)、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、氟化乙烯丙烯共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(poly (ethylene teraphthalate))、聚氨酯、聚脲、硅橡胶、聚酰胺、聚碳酸酯、聚醛、天然橡胶、聚酯共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物乙烯乙酸乙烯酯、聚原酸酯、聚亚胺基碳酸酯、脂肪族聚碳酸酯、聚己酸内酯(PCL)、聚-D,L-乳酸(PDLLA)、聚-L-乳酸(PLLA)、所述乳酸的丙交酯、聚磷腈聚环氧乙烷、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)（polyethylene teraphtholate）、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、PEBAX、Nylon、聚原酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸、白蛋白、单甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)或上述任一种的共聚物或混合物，包括聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)、L-丙交酯和D,L-丙交酯的共聚物、由MPEG和PCL，MPEG和(PCL-ran-PLLA)，MPEG和PLGA组成的二嵌段共聚物、由PLGA-PEG-PLGA，PEG-PLGA-PEG，PEG-PCL-PEG组成的三嵌段共聚物、由PEO和PLLA组成的二嵌段和三嵌段共聚物、泊洛沙姆。

7.根据权利要求6的组合物，其中所述聚合物是热胶凝的，且其中高于其开始胶凝的胶凝温度在20℃和40℃之间，优选在25℃和30℃之间。

8.根据权利要求6或7之一的组合物，其中在体内环境中聚合物90重量-%的降解和/或抑制剂从聚合物中90重量-%的释放在1-10天内完成，优选在1-2天内完成。

9.根据权利要求1-8之一的组合物，其中另外包含佐剂，其中所述佐剂优选选自脂质体、铝盐、Montanide乳剂、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、基于胰岛素的佐剂、病毒颗粒和聚磷腈，最优选选自磷酸铝或氢氧化铝凝胶。

10.根据权利要求1-5之一的组合物，其中所述基质是根据权利要求9的佐剂。

11.根据权利要求1-10之一的组合物，其中：

所有组分混合作为单一的制备物，或者

所述基质和所述抑制剂混合作为第一制备物，且所述过敏原和佐剂混合作为第二制备物。

12.根据权利要求1-11之一的组合物，其中所述组合物制备为适合于用于通过皮下注射施用的盖伦制剂。

13.根据权利要求1-12之一的组合物在制备用于治疗免疫病症，特别是过敏反应的药物中的用途，优选其中所述药物以治疗有效剂量施用给需要治疗免疫病症的人。

14.制造根据权利要求1-12之一的药物组合物的方法，其中所述组分以生理有效量彼此混合，以获得根据权利要求11的组合物，其中任选地盖仑化合物与所述制剂另外混合。

15.用于治疗免疫病症，特别是过敏反应的方法，其中根据权利要求1-12之一的组合物以治疗有效剂量施用给需要治疗的人。