CN104031963A - 利用蚕蛹制备降血糖肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用蚕蛹制备降血糖肽的方法，包括如下步骤：1)在脱脂干蚕蛹粉中加入水后搅匀，然后调节pH值为3.8～4.2，作为反应起始物；于35℃～40℃，在反应起始物中加入酸性蛋白酶，于搅拌状态下保温酶解反应3.5～4.5h；终止反应后离心，得上清液，该上清液为酶解液；2)用脱色活性炭对酶解液于35～35℃进行脱色处理，所得的脱色后酶解液经过滤，得粗滤酶解液；利用截留分子量3Kda的中空纤维聚砜超滤膜对粗滤酶解液进行超滤，先利用真空浓缩机将此超滤酶解液浓缩至原重的25～40％，然后真空冷冻干燥，得到具有降血糖功能的肽粉。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及利用蚕蛹制备降血糖肽的方法。
背景技术
目前，糖尿病已成为继肿瘤、心血管疾病之后严重威胁人类健康的慢性病，是威胁人类健康的三大慢性疾病之一，餐后高血糖是糖尿病的主要风险因子，α－葡萄糖苷酶抑制剂能通过抑制小肠上皮绒毛膜刷状缘上α－葡萄糖苷酶的活性，减少食物中碳水化合物的消化，延缓葡萄糖的生成，在降低餐后血糖中具有重要作用。目前已开发出一些化学合成的α-葡萄糖苷酶抑制剂(如阿卡波糖片)，并应用于临床治疗。但化学合成的α-葡萄糖苷酶抑制剂对人体能产生一定的副作用，如损害肝脏、导致胃肠气胀和肠功能紊乱等。
目前人们已从深海鱼、牛奶等食物中分离到了具有降血糖活性的多肽。但这些方法原料成本相对较高。
已有研究中，张海娜发现蚕蛹蛋白以碱性蛋白酶和复合蛋白酶制备ACE活性抑制肽，同时具有一定降低小鼠血糖的功效，但活性不高，且未报道其降血糖机制。李国荣通过碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解蚕蛹粉制备的多肽，能抑制酵母的α-葡萄糖苷酶活性，但未涉及动物体α-葡萄糖苷酶的抑制活性，且活性不高。蚕蛹源活性肽针对动物体内α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究尚无报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、降血糖效果好的利用蚕蛹制备降血糖肽的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用蚕蛹制备降血糖肽的方法，包括如下步骤：
1)、在脱脂干蚕蛹粉中按照1:13～17(较佳为1:15)的重量比加入水后搅匀，然后调节pH值为3.8～4.2(较佳为4.0)，作为反应起始物；于35℃～40℃，在反应起始物中加入为脱脂干蚕蛹粉重量2～3％的酸性蛋白酶，于搅拌状态下保温(35℃～40℃)酶解反应3.5～4.5h(较佳为4h)；
将酶解反应所得产物于10min内(一般为5～10分钟)升温至95～100℃，并保温8～12min(较佳为10min)；然后自然冷却至室温以终止反应；然后离心，得上清液，该上清液为酶解液；
2)、用脱色活性炭对所述酶解液于35～35℃(较佳为40℃)进行脱色处理，所得的脱色后酶解液经过滤，得粗滤酶解液；
利用截留分子量3Kda的中空纤维聚砜超滤膜(即，聚砜中空纤维超滤膜)对粗滤酶解液进行超滤，工作压力0.1～0.2Mpa，工作温度0～45℃(例如为20～45℃)，得到超滤酶解液；
先利用真空浓缩机将此超滤酶解液浓缩至原重的25～40％，然后真空冷冻干燥，得到具有降血糖功能的肽粉(即，降血糖肽)。
作为本发明的利用蚕蛹制备降血糖肽的方法的改进：
步骤1)中酸性蛋白酶的酶活力为5万U/g。
作为本发明的利用蚕蛹制备降血糖肽的方法的进一步改进：
所述步骤2)中的真空冷冻干燥为：于真空度为65Pa，冷阱温度为-50℃，物料温度为-25℃的条件下真空冷冻干燥，直至含水率≤7％(质量％)。
作为本发明的利用蚕蛹制备降血糖肽的方法的进一步改进：
所述步骤1)中的离心为：3500～4500r/min下离心18～22min(较佳为4000r/min离心20min)。
作为本发明的利用蚕蛹制备降血糖肽的方法的进一步改进：
所述步骤2)中的过滤为3层致密纱布袋粗滤。
作为本发明的利用蚕蛹制备降血糖肽的方法的进一步改进：所述步骤2)中：脱色活性炭与酶解液的重量比为9～11％(较佳为10％)；脱色处理时间为1.5～2.5h(较佳为2h)。
备注说明：
1、本发明中作为原料的脱脂干蚕蛹粉或蚕蛹蛋白粉，其含水率均≤1.5％(重量％)；脂肪含量≤3％(重量％)。
2、本发明所指的室温为10～30℃。
3、本发明的酸性蛋白酶，例如可选用上海源叶生物科技有限公司公司生产的M0010酸性蛋白酶BR。
4、采用本发明方法制备而得的降血糖活性肽的使用方法和用量为口服，每日两次，每次2-3g。
本发明的利用蚕蛹制备利用蚕蛹制备降血糖肽的方法的方法，具有如下优点：
1)、本发明所制备的降血糖肽是脱脂干蚕蛹或蚕蛹蛋白粉经生物酶水解而得，对高血糖患者具有降血糖的作用，安全、无毒副作用，对血糖水平正常者可起到保健作用，对正常血糖水平无影响。
2)、本发明所采用的原料来源广泛，价格低廉，经过本发明的技术转化可以有效的提高丝厂蚕蛹副产物的附加值，对继续促进桑蚕产业的发展具有重要意义。
即，从而使采用缫丝后经脱脂的干蚕蛹这一原料广泛、价格低廉的蛋白质源制备降血糖肽的技术具有更广泛的应用前景。
3)、本发明的产品可以作为药品、保健食品、食品、食品添加剂、药物增效剂等，工艺科学合理，操作简单，具有较强的工业实施性。
综上所述，本发明是一项针对动物体内α-葡萄糖苷酶具有高抑制活性的蚕蛹蛋白源降血糖肽的制备方法，对于深化蚕蛹蛋白资源在功能食品和医药领域的应用具有重要意义。本发明以蚕蛹蛋白(脱脂干蚕蛹粉)为原料，选择酸性蛋白酶对蚕蛹蛋白进行酶解，通过特定的酶解条件，制备所得的蚕蛹蛋白降血糖肽具有对α-葡萄糖苷酶活性高，稳定性好的特点。
具体实施方式
下述案例中的脱脂干蚕蛹粉的水分含量1.5％，蛋白质含量75.03％，脂肪含量3％，上述％均为重量％；该脱脂干蚕蛹粉例如可购自南通福丽尔生物制品有限公司。
实施例1、一种利用蚕蛹制取降血糖肽的方法，依次进行以下步骤：
1)、称取粉碎后的脱脂干蚕蛹粉10kg，加水150kg搅匀后，用适量HCl调节pH值为4.0后，作为反应起始物，控制温度为35℃～40℃，在反应起始物中加入酸性蛋白酶(酶活力为5万U/g)300g，继续保温(35℃～40℃)并不断搅拌进行酶解反应4h。
反应时间到达后，将酶解反应所得产物于5～10分钟内升温至95～100℃，并保温(95～100℃)10min；然后自然冷却至室温来终止反应。
然后在4000r/min下离心20min，得上清液98kg，该上清液为酶解液；
2)、用9.8kg的脱色活性炭对此酶解液脱色2h，温度控制在40℃；所得的脱色后酶解液经3层致密纱布袋粗滤，得粗滤酶解液。利用中空纤维聚砜超滤膜(截留分子量3KDa)对粗滤酶解液进行超滤，工作压力0.1～0.2Mpa，工作温度20～45℃，得到超滤酶解液50kg。
利用真空浓缩机将此超滤酶解液浓缩至20kg，进行真空冷冻(真空度达65Pa，冷阱温度为-50℃，物料温度为-25℃)至干燥(即，含水率≤7％)，得到具有降血糖功能的肽粉(蚕蛹肽)0.96kg，肽含量为90.2％，产品得率为8.66％。
配制3mg/mL的上述蚕蛹肽溶液，测得其对小鼠肠内α-葡萄糖苷酶抑制活性为73.9％，其IC50为2.03mg/mL。
测试方法参考文献：Pierre Chapdelaine,Roland RTremblay,Jean Y DubeP-Nitrophenol-a-D-Glucopyranoside as substrate for measurement of maltase activity in HumanSemen[J].CLIN CHEM1987,2(24)208-211进行。
实施例2、一种利用蚕蛹制取降血糖肽的方法，依次进行以下步骤：
1)、称取粉碎后的脱脂干蚕蛹粉40kg，加水600kg搅匀后，用适量HCl调节pH值为4.0后，作为反应起始物，控制温度为35℃～40℃，在反应起始物中加入酸性蛋白酶(酶活力为5万U/g)800g，继续保温并不断搅拌进行酶解反应4h。
酶解时间到达后，将酶解反应所得产物于5～10分钟内升温至95-100℃，并保温10min；然后自然冷却至室温来终止反应。
然后在4000r/min下离心20min，得上清液390kg，该上清液为酶解液；
2)、用39kg的脱色活性炭对此酶解液脱色2h，温度控制在40℃；所得的脱色后酶解液经3层致密纱布袋粗滤，得粗滤酶解液。利用中空纤维聚砜超滤膜(截留分子量3KDa)对粗滤酶解液进行超滤，工作压力0.1～0.2Mpa，工作温度20～45℃，得到超滤酶解液200kg。
利用真空浓缩机将此超滤酶解液浓缩至50kg，进行真空冷冻至干燥(真空度达65Pa，冷阱温度为-50℃，物料温度为-25℃)至干燥(即，含水率≤7％)，得到具有降血糖功能的肽粉3.68kg，肽含量为92.5％，产品得率为8.51％。
配制3mg/mL的上述蚕蛹肽溶液，测得其对小鼠肠内α-葡萄糖苷酶抑制活性为75.1％，IC50为2.00mg/mL。
对比例1、将脱脂干蚕蛹粉按照背景技术中告知的“利用深海鱼分离具有降血糖活性多肽”的方法进行制备；
即，以脱脂干蚕蛹粉替代等干重的深海鱼，其余内容等同于该方法。
所得结果为：
得到具有降血糖功能的肽粉0.89kg，肽含量为87.4％，产品得率为7.78％。
配制3mg/mL的上述蚕蛹肽，测得其对小鼠肠内α-葡萄糖苷酶抑制活性为28.6％，IC50为5.24mg/mL。
对比例2-1、将实施例1中的“酸性蛋白酶(酶活力为5万U/g)300g”改成“碱性蛋白酶(酶活力为10万U/g)300g”，且将调节pH值为4.0相应的更改成调节pH值为9-11；反应温度更改为50～60℃；其余等同于实施例1。
所得结果为：
得到的具有降血糖功能的肽粉中肽含量为90.7％，产品得率为20.6％。
配制3mg/mL的上述蚕蛹肽，测得其对小鼠肠内α-葡萄糖苷酶抑制活性为13.2％，IC50为11.36mg/mL。
通过上述结果可见，该案例虽然水解度相对高，因此得率较高；可是所得的蚕蛹肽对小鼠肠内α-葡萄糖苷酶抑制活性却大大降低。
对比例2-2、将实施例1中的“酸性蛋白酶(酶活力为5万U/g)300g”改成“复合蛋白酶(酶活力为12万U/g)200g”，且将调节pH值为4.0相应的更改成调节pH值为6-8；反应温度为40～50℃；其余等同于实施例1。
所得结果为：
得到具有降血糖功能的肽粉0.81kg，肽含量为91.3％，产品得率为7.4％。
配制3mg/mL的上述蚕蛹肽，测得其对小鼠肠内α-葡萄糖苷酶抑制活性为7.8％，IC50为19.23mg/mL。
通过对比例结果可见，该案例所得的蚕蛹肽对小鼠肠内α-葡萄糖苷酶抑制活性却大大降低。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1.利用蚕蛹制备降血糖肽的方法，其特征是包括如下步骤：
1)、在脱脂干蚕蛹粉中按照1:13～17的重量比加入水后搅匀，然后调节pH值为3.8～4.2，作为反应起始物；于35℃～40℃，在反应起始物中加入为脱脂干蚕蛹粉重量2～3％的酸性蛋白酶，于搅拌状态下保温酶解反应3.5～4.5h；
将酶解反应所得产物于10min内升温至95～100℃，并保温8～12min；然后自然冷却至室温以终止反应；然后离心，得上清液，该上清液为酶解液；
2)、用脱色活性炭对所述酶解液于35～35℃进行脱色处理，所得的脱色后酶解液经过滤，得粗滤酶解液；
利用截留分子量3Kda的中空纤维聚砜超滤膜对粗滤酶解液进行超滤，工作压力0.1～0.2Mpa，工作温度0～45℃，得到超滤酶解液；
先利用真空浓缩机将此超滤酶解液浓缩至原重的25～40％，然后真空冷冻干燥，得到具有降血糖功能的肽粉。
2.根据权利要求1所述的利用蚕蛹制备降血糖肽的方法，其特征是：
所述步骤1)中酸性蛋白酶的酶活力为5万U/g。
3.根据权利要求1或2所述的利用蚕蛹制备降血糖肽的方法，其特征是：
所述步骤2)中的真空冷冻干燥为：于真空度为65Pa，冷阱温度为-50℃，物料温度为-25℃的条件下真空冷冻干燥，直至含水率≤7％。
4.根据权利要求3所述的利用蚕蛹制备降血糖肽的方法，其特征是：
所述步骤1)中的离心为：3500～4500r/min下离心18～22min。
5.根据权利要求4所述的利用蚕蛹制备降血糖肽的方法，其特征是：
所述步骤2)中的过滤为3层致密纱布袋粗滤。
6.根据权利要求5所述的利用蚕蛹制备降血糖肽的方法，其特征是：
所述步骤2)中：脱色活性炭与酶解液的重量比为9～11％；脱色处理时间为1.5～2.5h。
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