CN104031852B - 一种降解游离棉酚产朊假丝酵母菌及在棉杆饲料中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了产朊假丝酵母（Candida utilis）QC‑1 CGMCC No.9165及其在降解棉杆中游离棉酚中的应用。通过从新疆五家渠青贮饲料中取样，分离、筛选、生理生化鉴定，确定该菌种本发明提供的产朊假丝酵母（Candida utilis）QC‑1 CGMCC No.9165是一种酵母菌，具有降解棉杆中游离棉酚的良好技术效果，通过将筛选出的菌种接种于固体棉杆，在实际应用中具有良好的降解游离棉酚的效应，在饲料添加剂产业方面具有广泛的应用前景。

Description

一种降解游离棉酚产朊假丝酵母菌及在棉杆饲料中的应用

技术领域

本发明涉及游离棉酚降解生物技术领域，具体的说，本发明涉及一种产朊假丝酵母菌及其作为棉杆中游离棉酚降解菌的应用的技术领域。

背景技术

棉花是新疆的支柱性产业之一，新疆棉花种植面积约占全国的1/3，棉秆资源相当丰富。但其中含有大量的游离棉酚，限制了棉杆在饲料中的广泛应用。含有一定量的游离棉酚(Freegossypol)，可以导致动物生长受阻、生产力下降、贫血、呼吸困难、繁殖力下降、甚至不育，严重时可致死亡。因此，降低游离棉酚含量对棉杆饲料化具有重要的意义。

棉株体内棉酚的存在形式有两种，即结合棉酚(Bound gossypol)和游离棉酚(Free gossypol)，通常认为在棉花组织中呈游离状态存在的棉酚称为游离棉酚，而与其他物质(蛋白质、氨基酸和磷脂)结合的棉酚称为结合棉酚。一般认为，只有游离棉酚对人畜具有毒性，因而人们也重点关注有毒的游离棉酚。棉杆中，含有一定量的游离棉酚(Freegossypol)，可以导致动物生长受阻、生产力下降、贫血、呼吸困难、繁殖力下降、甚至不育，严重时可致死亡。

游离棉酚的去除有物理法、化学法、复合或多次溶剂浸提和微生物发酵法。最初人们发现牛、羊等反刍动物对棉籽饼粕中的棉酚有较强的耐受能力，由于反刍动物瘤胃中的微生物和酶的作用，棉酚被破坏并随纤维素而水解转入真胃中，相对解决了棉酚的毒性问题；此外人们还发现在霉变的棉籽饼中棉酚含量也非常低，说明其中所生长的某类霉菌对游离棉酚可能存在降解作用；蘑菇培养基中含有大量的棉籽壳，棉籽壳棉酚含量较高，而蘑菇却可以在其上生长良好，推测某些真菌有可能降解了其中的棉酚，由此推断，在体外适当条件下，利用合适的微生物进行棉籽粕发酵, 有可能实现棉籽粕中游离棉酚的降解或破坏。国内学者在微生物发酵降解棉酚方面进行了较多研究，而国外的相关研究则较少，这主要与国内蛋白资源匮乏、棉粕产量及其在饲料中的添加用量大有关。其中，所筛选的菌种主要是以黑曲霉为主的霉菌和以热带假丝酵母为主的酵母菌两类。棉秆经生物发酵处理后可作为粗饲料，不但扩大了饲草料的来源有效地缓解了饲草料不足的问题，还为畜牧业规模化、产业化发展带来了突破性发展。

发明内容

目前，国内外鲜有针对产朊假丝酵母 （Candida utilis）作为棉杆中游离棉酚降解菌的研究现状，本发明旨在一种产朊假丝酵母 （Candida utilis）及其作为棉杆中游离棉酚降解菌的应用，通过试验验证，采用本发明提供的产朊假丝酵母 （Candida utilis）具有良好的降解棉杆中游离棉酚的技术效果。

本发明从新疆五家渠青贮饲料中取样，进行筛选、驯化选育，分离出一株长势良好的微生物菌株，编号为QC-1,通过对所获菌株进行形态特征观察及总DNA的提取、18S rDNA序列测定及系统发育分析，初步确定了其分类地位；进行棉酚耐受实验，该菌在以1000mg/mL醋酸棉酚为碳源的培养基中长势良好，具有较高的耐受性；在棉杆固体发酵中，该菌QC-1对棉杆中降解游离棉酚有良好技术效果。

具体的，本发明提供的一种产朊假丝酵母 （Candida utilis），命名为QC-1。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2014年5月14日，保藏号是CGMCC No.9165。经微生物学鉴定为产朊假丝酵母（Candida utilis）。在YPD平板培养基上，30 ℃，培养24 h，菌落乳白色，平滑，有或无光泽，边缘整齐或菌丝状。在显微镜下，细胞呈圆形、椭圆形或腊肠形，大小为（3.5-4.5）μm×（7-13）μm。在加盖片的玉米粉琼脂培养基上，形成原始假菌丝或不发达的假菌丝，或无假菌丝；能发酵葡萄糖、蔗糖、棉子糖，不发酵麦芽糖、半乳糖、乳糖和蜜二糖。不分解脂肪，能同化硝酸盐。依照第九版《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》（《Bergey,s Manualof Systematic Bacterio-logy》）和《常用细菌系统鉴定手册》对QC-1菌株进行形态学测定，生理生化检测确定QC-1菌株为产朊假丝酵母（Candida utilis）。通过BLAST同源比对，用CLUSTAL X 进行多序列比对，并采用 Saitou和Nei 的邻接法（Neighbor Joining）用MEGA 4软件进行系统进化树的构建和同源性比较。将菌株QC-1确定为产朊假丝酵母（Candida utilis）。

通过对上述菌种产朊假丝酵母（Candida utilis）QC-1生理生化分析及18SrDNA同源分析、系统发育分析结果，将纯化的菌株QC-1进行系统进化树的构建及多样性分析，与产朊假丝酵母（Candida utilis）同源性最高，将菌种编号为QC-1的菌株鉴定为产朊假丝酵母（Candida utilis）。

进一步，本发明提供了一种产朊假丝酵母（Candida utilis）QC-1 CGMCC No.9165在降解棉杆中游离棉酚中的应用，具体为利用产朊假丝酵母（Candida utilis）作为降解耐受游离棉酚和降解棉杆中游离棉酚的菌种在固体发酵中的应用。

本发明进一步提供了菌种的保存条件。采用灭菌的脱脂牛乳洗脱试管斜面上的菌苔，制成浓厚菌悬液。然后用无菌吸管将菌悬液滴入小试管底部。每管一滴，然后转动小试管使菌液分散在试管底部的壁上。标记菌名，将小试管装在15×150mm的试管中，在大试管底部事先装上1.5cm高的(p2o5或koh)，管口用带玻璃管的橡皮塞塞紧，蜡封。将大试管与真空泵连通，抽真空至0.1～0.2mm汞柱时，将玻璃管熔封，置室温暗处或冰箱-20℃保存。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果:

本发明提供了分离得到的产朊假丝酵母（Candida utilis）CGMCC No.9165，是一种酵母菌，具有降解棉杆中游离棉酚的良好技术效果，通过将筛选出的菌种接种于固体棉杆，在实际应用中具有良好的降解游离棉酚的效果，获得降解棉秆中棉酚显著的技术效果。

附图说明

图1所示为产朊假丝酵母（Candida utilis）CGMCC No.9165的菌落形态图。

图2所示为产朊假丝酵母（Candida utilis）CGMCC No.9165的系统发育树图。

图3所示为液体培养基发酵中蛋白胨A与蔗糖B对产朊假丝酵母（Candida utilis）CGMCC No.9165增殖OD值的影响。

图4所示为棉杆固体发酵中棉杆含水量A与接种量B对产朊假丝酵母（Candidautilis）CGMCC No.9165对棉杆脱毒率的影响。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备：醋酸棉酚，MSSPX-250型生化培养箱,SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，MLS-3020高压蒸汽灭菌锅，E360K 离心机，恒温摇床 HWY-100。PCR Eppendorf No:5345,电泳仪 Bio-Rad Model 200/2.0，凝胶成像仪United-Bio，GK-330C plus，恒温水浴锅, PCR 预混液(TaKaRa Biotechnology)，其余试剂均为分析纯。

样品的采集：选取新疆五家渠农户青贮饲料，选取无污染，味道清香的青贮发酵样品，经随机取样，将样品放在自封袋中，立即带回实验室，放置4℃冰箱备用。称取10g样品，放入盛有无菌水的100mL三角瓶中。常温下，180rpm/min，震荡30min，使样品完全融于无菌水中。

本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：菌种的分离、筛选与鉴定

(1)用于细菌分离、培养和纯化的YPD培养基：

液体YPD培养基：1% Yeast Extract（酵母膏），2% Peptone（蛋白胨），2%Glucose（葡萄糖），去离子水定容至1L。

固体YPD培养基：1% Yeast Extract（酵母膏），2% Peptone（蛋白胨），2%Glucose（葡萄糖）,2%琼脂，去离子水定容至1L。

以醋酸棉酚为唯一碳源的培养基：1% Yeast Extract（酵母膏），2% Peptone（蛋白胨），2%Glucose（葡萄糖）,2%琼脂，去离子水定容至1L。7×10⁴Pa(表压)(115℃)20-30min,待温度低于50℃，将10g醋酸棉酚溶解于少量的70%的丙酮中，加入YPD中，去离子水定容至1L，配置成含有1% 醋酸棉酚YPD培养基。

对上述制备好的培养基进行高压蒸汽灭菌。此法是将待灭菌物品放在高压蒸汽灭菌锅内，利用高压时水的沸点上升，从而造成蒸汽温度升高，由此产生高温达到杀灭杂菌的目的。由于本实验的培养基含有糖类物质，因此一般采用7×10⁴Pa(表压)(115℃)20-30min，以免糖类因高温而分解。由于高压蒸汽灭菌是通过提高蒸汽压力而使其升高温度以杀死微生物，所以加压前应尽量排尽锅内的空气。灭菌完毕后，对需要制成斜面的固体培养基，趁热将试管上部垫于一根玻璃棒上，使培养基斜面长度为试管长度的1/2。

（2）耐受游离棉酚菌种的分离：

涂布法，将青贮饲料样品混合液，按8个浓度梯度 10^-1-10^-8 cfu/mL涂布于以醋酸棉酚为唯一碳源的培养基平板，各设一个重复，于30℃培养箱培养3-5天。选择合适的浓度平板，按照形态、大小、颜色，挑取细菌的典型单个菌落，在YPD培养基上纯化后，对筛选到的菌株进行斜面保存,在4℃冰箱，备用。

经平皿培养，得到在1% 醋酸棉酚YPD平板上长势良好的菌株QC-1，产朊假丝酵母（Candida utilis）CGMCC No.9165的菌落形态图参见附图1。

（3）降解游离棉酚菌种的筛选：

种子液摇床培养：从菌种包藏斜面中挑取一环菌体，置入已制备完毕的YPD液体培养基中，摇匀。将盛有液体培养基的三角瓶放置于振荡培养箱中摇床培养，培养条件为30℃，转速为120r／min，培养时间为12小时。在以上培养条件下，使菌体生长迅速，并处于对数生长期内，制备种子液，孢子悬液控制在1-2×10⁹。

棉杆固体培养基：将收割后的棉秆用铡草机切割成3-5 厘米，称取棉杆 100g 于500mL 锥形瓶内，0.1Mpa、121℃灭菌 20min，除去棉杆杂菌，避免对产朊假丝酵母QC-1固体发酵产生影响。室温下，5.5%接种量，1:0.6的料水比，发酵30d；对照组不接种，1:0.6的料水比，发酵30d，最终棉杆脱毒率达53.9%。

游离棉酚含量测定及脱毒率计算：参照中华人民共和国国家标准GB 13086-91《饲料中游离棉酚的测定方法》，标准参照采用国际标准ISO 6866-1985《动物饲料中游离的和总棉酚的测定方法》。

具体操作如下：采集具有代表性的棉杆样品，至少2kg，四分法缩分至约250g，磨碎，过2.8mm孔筛，混匀，装密闭容器，防止试样变质，低温保存备用。称取1-2g试样(精确到0.001g )> 置于250 mL具塞三角烧瓶中，加入20粒玻璃珠，用移管准确加入50 mL溶剂A(量取约500mL异丙醉、正己烷混合溶剂(体积比为6:4 )，2mL 3-氨基-1-丙醇，8mL冰乙酸和50mL水于1000mL的容量瓶中，再用异丙醇-正己烷混合溶剂定容至刻度。)，塞紧瓶塞， 放入振荡器内振荡1h(每分钟120次左右)。用燥的定墩滤纸过滤，过滤时在漏斗上加盖一表玻璃以减少溶剂挥发，弃去最初几滴滤液，集滤液于100mL具塞三角 烧瓶中。用吸量管吸取等量双份滤液5-10mL(每份约含50-100μg的棉酚)分别至 两个25mL棕色容量瓶a和b中，如果需要，用溶剂A补充至10mL。用异丙醇-正己烷混合溶剂稀释瓶a至刻度，摇匀，该溶液用作试样测定液的参比溶液。用移液 管吸取2份10mL的溶剂A分别至两个25mL棕色容量瓶a_o和b_o中。用异丙醇-正己烷 混合溶剂补充瓶a。至刻度，摇匀，该溶液用作空白测定液的参比溶液。加2.0m L苯胺于容量瓶b和b中，在沸水浴上加热30min显色。冷却至室温，用异丙醇-正己烷混合溶剂定容，摇匀并静置1 h,用10 mm比色池，在波长440nm处，用分光光度计以a。为参比溶液测定空白测定液b的吸光度，以a为参比溶液测定试样测定液b的吸光度，从试样测定液的吸光度值中减去空白测定液的吸度值，得到校正吸光度A。

计算公式：X=A*1250*1000/a*m*V=A*1.25*10⁶/amV

式中:X-游离棉酚含量，mg/kg；A-校正吸光度；m试样质量，g：V-测定用滤液的体积，mL：a-质量吸收系数，游离棉酚为62.5cm^-1·g^-1·L。

每个试样取2个平行样进行测定， 以其算术平均值为结果，结果表示到20mg/kg。

脱毒率的计算：脱毒率(%)＝1－发酵产物中 FG 含量/ 对照棉籽粕底物中 FG含量。

（4）产朊假丝酵母（Candida utilis）的生理生化测定：

产朊假丝酵母（Candida utilis），细胞呈椭圆形，大小为3.5μm-4.5μm×7.0μm-13.0μm,以多边出芽方式进行无性繁殖，形成假菌丝。无有性孢子，不产生色素。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落乳白色，平滑，有或无光泽，边缘整齐或菌丝状；在加钙片的玉米粉琼脂培养基上，菌落形成假菌丝；在葡萄糖蛋白胨酵母提取物培养基上，表面无菌膜，液体浑浊，管底有菌体沉淀。

结合中华人民共和国农业行业标准（NY/T 1969-2012）中饲料添加剂产阮假丝酵母标准，对菌株的生理生化特征进行分析。采用杜氏管(Durham tube)法进行糖发酵试验，选取26种碳源化合物作为同化试验对象，观察菌株在无维生素培养基上的生长状况，分别进行了熊果苷裂解，类淀粉化合物的形成，抗放线菌酮，尿素分解，DBB，温度，高渗透压生长，1%乙酸培养基生长等生理生化试验。菌株QC-1生理生化结果见表1。

表 1 ：菌株QC-1的生理生化特性

（5）对菌株QC-1进行18S rDNA 序列扩增及其测序

采用CTAB/NaCl法提取QC-1基因组DNA。将菌株接种于液体YPD培养基，30℃震荡培养过夜。取1.5ml培养物12000rpm离心2min。沉淀物加入567 ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h。加入100ul 5mol/LNaCl, 充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min, 将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇。TE溶解得到DNA。

采用扩增真菌 18SrDNA 的通用引物EF4/EF3：

5’-GGAAGGG[G/A]TGTATTTATTAG-3’

5’-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3’

PCR 扩增反应体系为50 μL，含有24μL premix Taq，引物1 1μL，引物2 1μL，模板2μL，无菌水 22μL。扩增条件：94°C 4 min；94°C 30 s，55°C 90 s，72°C 30 s，30 个循环；72°C 7 min。扩增产物(约 1500 bp)经 1%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，PCR 产物直接进行测序，测序基因序列参见附后的基因序列表。

经测定，产朊假丝酵母（Candida utilis）QC-1 CGMCC No. 9165的18s rRNA基因序列为1597bp，参见附后提供的基因序列表：SEQUENCE LISTING。

菌株QC-1的18S rDNA序列如下：

gatcctgcca gtagtcatat gcttttgtct caaaagatta agccatgcat gtctaagtat 60

aagcaatttt tgaactgcga atggctcatt ttatagtttt attgatagta cttggataac 120

cgtgggtaat tctagagcta atacatgcta aaaccgactg cttggagggg tgtatttatt 180

agataaaaaa tcaatgccct cgggctcttt gatgattcat aataacttgt cgaatcgcat 240

ggctttacgc cggcgatggt tcattcaaat ttctgcccta tcaactttcg atggtaggat 300

agtggcctac catggtggca acgggtaacg gggaataagg gttcgattcc ggagagggag 360

cctgagaaac ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcctaa 420

ttcagggagg tagtgacaat aaataacgat acagggccct tctgggtctt gtaattggaa 480

tgagtacaat gtaaatacct taacgaggaa caattggagg gcaagtctgg tgccagcagc 540

cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat taaagttgtt gcagttaaaa agctcgtagt 600

tgaactttgg gcctggcagg ccggtccgct ttttggcgag tactgaccct gccgggcctt 660

tccttctggc taccctcccc tctggagagg cgaaccagga cttttacttt gaaaattaga 720

gtgttcaaag caggcctttg ctcgaatata ttagcatgga ataatagaat aggacgtttg 780

gttctaaatg attaataggg acggtcgggg gcatcagtat tcagttgtca gaggtgaaat 840

tcttggattt actgaagact aactactgcg aaagcatttg ccaaggacgt tttcattaat 900

caagaacgaa agttagggga tcgaagatga tcagataccc gtcgtagtct taaccataaa 960

ctatgccgac tagggatcgg gtgttgtttt tataatgact cactcggcac cttacgagaa 1020

atcaaagtct ttgggttctg gggggagtat ggtcgcaagg ctgaaactta aaggaattga 1080

cggaagggca ccaccaggag tggagcctgc ggcttaattt gactcaacac ggggaaactc 1140

accaggtcag ggaaactcac caggtcgggg aaactcacca ggtccaggag tggagcctgc 1200

ggcttaattt gactcaacac ggggaaactc accaggtcca gacacaataa ggattgacag 1260

attgagagct cttcttgatt ttgtgggtgg tggtgcatgg ccgttcttag ttggtggagt 1320

gatttgtctg cttaattgcg ataacgaacg agaccttaac ctactaaata gcgcgactag 1380

cttttgctgg tgctgacgct tcttagaggg actatcgatt tcaagtcgat ggaagtttga 1440

ggcaataaca ggtctgtgat gcccttagac gttctgggcc ccgcacgcgc gctacactga 1500

cggagccagc gagtctagcc ttggccgana ggtcatgggt aatcttgtga aactccgtcg 1560

tgctgggggg atagagcatt gcaattattg ctctttt 1597

（5）序列分析与系统进化树构建 将测序得到的 18S rDNA 序列与 GenBank 数据库中的核苷酸序列进行 BLAST 分析，从中获取相近的18S rDNA 序列，用 ClustalX 软件和 MEGA 4.1 中的Neighbor-joining 法构建系统进化树，其系统进化树见参见附图2。将所得序列提交GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，用Blast软件对各序列进行相似性搜索，获取最相近标准菌株的18S rDNA基因序列，利用MEGA 4.0软件包采用邻接法 (Neighbor-Joining) 进行系统进化树的构建及多样性分析。比对结果表明，菌种QC-1与产朊假丝酵母 （Candida utilis）同源性最高，达96%，但是两者之间存在明显的分支和差异，依据微生物分类方法，将菌种编号为QC-1菌株初步鉴定为产朊假丝酵母（Candidautilis）。

实施例二：产朊假丝酵母（Candida utilis）的液态发酵和固态发酵降解游离棉酚条件优化

（1）菌体液体发酵培养基优化

初始培养基：葡萄糖5.0%、酵母粉2.0%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.1%、硫酸铵0.1%，pH值5.5。

在此基础上，根据实验设计，将蔗糖、乳糖、麦芽糖等不同的发酵成分取代葡萄糖作为碳源，将牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵等取代酵母粉作为氮源。最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为蛋白胨。

在单因素试验的基础上，选取了影响QC-1增值发酵较明显的蔗糖、蛋白胨、磷酸二氢钾等三个主要因素，根据 Box-Behnken 中心组合设计原理, 以OD值为响应值, 利用Design Expert8.0.6软件设计了三因素三水平的响应面法试验，共有 15 个试验点, 其中12个为析因点, 3个为零点以估计误差。获得最优的增值发酵培养基组成为蛋白胨36.32g/L，蔗糖76.17g/L，磷酸二氢钾1.98g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸铵1g/L。结果见表2。

表2 ：Box- Behnken 设计方案及响应值结果

试验编号	蛋白胨	蔗糖	KH2PO4	OD值
					1	40	75	2	0.805
2	40	85	1.5	0.861
					3	50	75	1.5	0.766
4	50	75	2.5	0.748
					5	40	65	1.5	0.728
6	30	85	2	0.893
					7	30	65	2	0.783
8	30	75	2.5	0.824
					9	40	85	2.5	0.863
10	50	65	2	0.696
					11	40	75	2	0.791
12	50	85	2	0.814
					13	30	75	1.5	0.844
14	40	65	2.5	0.733
					15	40	75	2	0.785

利用软件对试验结果进行二次多元回归拟合，对表2的数据进行方差分析后得到模型的二次多项回归方程为:

OD=0.90-0.040*A+0.062*B-3.625E-003*C+2.750E-003*A*B+2.500E-0.04*A* C-2.500E-0.03* B * C-0.052* A2-0.049* B2-0.052* C2,方差分析结果见表3。

表3 ：方差分析

变异来源	自由度	总偏差平方和	平均偏差平方和	F值	Pr > F
						X1	1	0.013	0.013	23.95	0.0045
X2	1	0.030	0.030	56.84	0.0007
						X3	1	1.051E-004	1.051E-004	0.20	0.6759
X1X2	1	3.025E-005	3.025E-005	0.057	0.8214
						X1X3	1	2.500E-007	2.500E-007	4.677E-004	0.9836
X2X3	1	2.500E-005	2.500E-005	0.047	0.8373
						X1X1	1	9.952E-003	9.952E-003	18.62	0.0076
X2X2	1	8.926E-003	8.926E-003	16.70	0.0095
						X3X3	1	0.010	0.010	18.80	0.0075
模型	9	0.068	7.602E-003	14.22	0.0046
						残差	5	2.672E-003	5.345E-004
失拟项	3	3.978E-004	1.326E-004	0.12	0.9426
						纯误差	2	2.275E-003	1.137E-003
总值	14	0.071

由表3可知，失拟项不显著( P=0.9426>0.05)，而模型的P值为0.0046，小于 0.05，表明模型显著。还可以看出因素一次项A、B，二次项A²、B²、C²对结果影响是显著的( P<0.05)，一次项C，交互项AB、AC、BC对结果影响不显著( P>0.05)，因此手动对回归模型进行优化，优化结果见表4，优化后的回归方程为：

OD=0.90-0.040*A+0.062*B-3.625E-003*C+2.750E-003*A*B-0.052* A²-0.049*B²-0.052*C²

表4 ：优化后结果

变异来源	自由度	总偏差平方和	平均偏差平方和	F值	Pr > F
						X1	1	0.013	0.013	33.21	0.0007
X2	1	0.030	0.030	78.83	<0.0001
						X3	1	1.051E-004	1.051E-004	0.27	0.6176
X1X2	1	3.025E-005	3.025E-005	0.078	0.7874
						X1X1	1	9.952E-003	9.952E-003	25.82	0.0014
X2X2	1	8.926E-003	8.926E-003	23.16	0.0019
						X3X3	1	0.010	0.010	26.07	0.0014
模型	7	0.068	9.770E-003	25.35	0.0002
						残差	7	2.698E-003	3.854E-004
失拟项	5	4.230E-004	8.460E-005	0.074	0.9903
						纯误差	2	2.275E-003	1.137E-003
总值	14	0.071

由表4可以看出，失拟项不显著( P=0.9903大于0.05)，而模型的P=0.0002, 表明模型高度显著，且优化后的模型的F-value值和模型的lack of fit值较优化前变化不大，表明新的拟合方程仍然能够满足响应面分析的要求，可以用此模型对QC-1增值发酵培养基最优组合进行分析和预测，在所选取的因素水平范围内，各因素对结果的影响排序为B-蔗糖>A-蛋白胨>C-KH₂PO₄。

对经手动优化后的回归方程中的AB交互项所作的响应曲面图参见附图3。通过响应面结果分析，仅蛋白胨A与蔗糖B之间交互作用显著。当KH₂PO₄和其它因素恒定时，CQ-1增殖发酵的OD值随着蔗糖和蛋白胨含量的增加都有先增大后减小的趋势。参见附图3可见，响应曲面图呈钟罩型，说明蔗糖和蛋白胨含量的交互作用比较显著，这和表4所显示的结果相一致。

（4）固体发酵条件优化

固体培养基：将收割后的棉秆用铡草机切割成3-5厘米，准备若干棉花秸秆制作成发酵饲料，采用7×10⁴Pa(表压)(115℃)30min，除去棉杆杂菌，避免对产朊假丝酵母QC-1固体发酵产生影响。

选用2000mL的太空杯作为发酵器，选用棉杆含水量X₁、接种量X₂和发酵时间X₃为试验因素，以游离棉酚脱毒率为因变量，按照中心组合试验设计确定棉杆固体发酵最优条件。中心组合具体试验方案和脱毒率Y的结果见表5。

表5 ：中心组合实验设计及结果

试验编号	X1	X2	X3	Y
					1	70	7.5	30.0	67.1
2	70	7.5	30.0	66.2
					3	70	10.0	25.0	68.7
4	70	5.0	35.0	51.2
					5	80	7.5	35.0	60.5
6	60	7.5	35.0	66.1
					7	60	7.5	25.0	65.3
8	70	7.5	30.0	64.8
					9	60	10.0	30.0	70.0
10	60	5.0	30.0	50.1
					11	70	5.0	25.0	55.3
12	80	10.0	30.0	53.9
					13	70	10.0	35.0	68.1
14	70	7.5	30.0	61.8
					15	70	7.5	30.0	60.5
16	80	5.0	30.0	55.6
					17	80	7.5	25.0	59.2

根据表5的试验结果,借助Design-Expert.V8.0.6.1进行二次响应面回归分析,结果见表6。相关系数R²为91.22%，说明模型可以解释91.22%实验游离棉酚降解变化，方程的F值为585.58，显著性系数<0.0001,表明方程的拟合较好。

得到多元二次响应面回归模型如下：Y=-141.60500+4.57725*X1+25.80100*X2-3.30900*X3-0.21600*X1*X2+2.50000E-003*X1*X3+0.070000*X2*X3-0.023650*X12-0.69040*X22+0.042400*X32 式中，Y为脱毒率；X1、X2、X3为棉杆含水量、接种量和发酵时间。

表6： 中心组合试验方差分析表

变异来源	自由度	总偏差平方和	平均偏差平方和	F值	Pr > F
						X1	1	62.16	62.16	7.72	0.0274
X2	1	294.03	294.03	36.51	0.0005
						X3	1	0.84	0.84	0.10	0.7555
X1X2	1	116.64	116.64	14.48	0.0067
						X1X3	1	0.062	0.062	7.760E-0.03	0.9323
X2X3	1	3.06	3.06	0.38	0.5570
						X1X1	1	23.55	23.55	2.92	0.1310
X2X2	1	78.40	78.40	9.73	0.0168
						X3X3	1	4.73	4.73	0.59	0.4685
模型	9	585.58	65.06	8.08	0.0058
						残差	7	56.38	8.05
失拟项	3	24.23	8.08	1.01	0.4772
						纯误差	4	32.15	8.04
总值	16	641.96

从表6中看出，因素一次项A、B;交互项AB;交互项AB;二次项B2对结果影响是显著的( P<0.05), 一次项C、交互项AC、BC,二次项A2、C2对结果影响不显著( P>0.05)，因此手动对回归模型进行优化，优化结果见表7，优化后的回归方程为：Y=-141.60500+4.57725*X1+25.80100*X2 -0.21600*X1*X2 +0.042400*X32 式中，Y为脱毒率；X1、X2、X3为棉杆含水量、接种量和发酵时间。

表7：优化后响应面分析结果

变异来源	自由度	总偏差平方和	平均偏差平方和	F值	Pr > F
						X1	1	62.16	62.16	8.52	0.0129
X2	1	294.03	294.03	40.28	<0.0001
						X3	1	103.68	103.68	34.04	0.0002
X1X2	1	116.64	116.64	15.98	0.0018
						X2X2	1	81.53	81.53	11.17	0.0059
模型	4	554.36	138.39	18.99	<0.0001
						残差	12	87.60	7.30
失拟项	8	55.45	6.93	0.86	0.6038
						纯误差	4	32.15	8.04
总值	16	641.96

由表7可以看出，失拟项不显著( P=0.6038大于0.05)，而模型的P<0.0001, 表明模型高度显著，且优化后的模型的F-value值和模型的lack of fit值较优化前变化不大，表明新的拟合方程仍然能够满足响应面分析的要求，可以用此模型对QC-1固体发酵培养最优条件进行分析和预测。在所选取的因素水平范围内，各因素对结果的影响排序为B-接种量>A-棉杆含水量>C-发酵时间。最终得到，以棉杆中游离棉酚含量为测定指标，对发酵时间、含水量和接种量进行优化，确定在60%含水量，10%接种量发酵30d为QC-1的最适固体发酵条件。通过响应面结果分析，仅棉杆含水量A与接种量B之间交互作用显著。

对经手动优化后的回归方程中的AB交互项所作的响应曲面图参见附图4。但棉杆含水量A达到60%时，棉杆脱毒率最高，含水量越大，脱毒率呈下降趋势。而接种量B达到10%时，棉杆脱毒率最大。

（6）QC-1在棉杆固体混合发酵中的初步应用

根据QC-1固体发酵优化最佳条件：60%含水量，10%接种量发酵30d。此外，为提高棉杆营养加入辅料尿素、玉米粉；根据氮源考察的结果和实地取材的已获得性，暂定尿素的添加量为1%，玉米粉为2%；对照组：不添加任何菌剂及辅料；实验组：添加菌剂与辅料；一次粉碎成型的杆状或絮状棉花秸秆，每组60公斤，压缩打包密封存放。发酵30d后，开封样品，取样品中部，色泽鲜艳，气味清香，并测定样品游离棉酚的含量、pH值、鲜重、干重、粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、几种重金属含量，测定结果见表8。

其中，pH值测定具体方法参见NY/T 1973-2010；鲜重、干重测定具体方法参见GB/T6435-2006;粗蛋白质测定参见GB/T 6432-1994;粗脂肪测定参见GB/T 6433-2006；粗纤维GB/T 6434-2006；镉含量测定参见GB/T 13082-1991;铅含量测定参见GB/T 13080-2004;铬含量测定参见GB/T 13088-2006。

表8：棉杆固体发酵生理生化检测

编号	处理	对照
			游离棉酚（mg/kg）	92	263
pH值	5.08	5.66
			粗蛋白质（%）	9.41	7.32
粗脂肪（g/kg）	14.5	9.5
			粗纤维（%）	35.2	40.4
鲜重（%）	57.0	63.6
			干重（%）	7.1	7.2
镉（mg/kg）	0.36	0.40
			铅（mg/kg）	4.66	4.66
铬（mg/kg）	0.86	1.42

根据我国现行饲料卫生标(GB13078-2001)有明确的规定：棉籽饼粕原料≤1200mg/kg，配合饲料中肉用仔鸡、生长鸡≤100 mg/kg，产蛋鸡≤20mg/kg，生长肥育猪≤60mg/kg；此外，国家饲料卫生标准中没有对反刍动物日粮中游离棉酚允许量进行规定。美国对反刍动物日粮中游离棉酚限量是：在动物 0-3 周龄时≤100mg/kg，3-24 周龄时≤200 mg/kg，大于 24周龄时母畜≤600mg/kg，育种公畜≤200mg/kg。经过处理过的棉杆，游离棉酚含量为92 mg/kg，已达到饲喂标准。

另外，粗蛋白质、粗脂肪含量提高，粗纤维、重金属含量均有不同程度的下降。说明经过产阮假丝酵母（Candida utilis）以及添加适量辅料，固体发酵棉杆，降低了棉杆毒性，增加了棉杆营养及适口性。

SEQUENCE LISTING

<110> 新疆农业科学院微生物应用于研究所

<120> 一种降解游离棉酚的产阮假丝酵母菌及在棉杆饲料中应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1597

<212> DNA

<213> 产阮假丝酵母（Candida utilis）

<400> 1

gatcctgcca gtagtcatat gcttttgtct caaaagatta agccatgcat gtctaagtat 60

aagcaatttt tgaactgcga atggctcatt ttatagtttt attgatagta cttggataac 120

cgtgggtaat tctagagcta atacatgcta aaaccgactg cttggagggg tgtatttatt 180

agataaaaaa tcaatgccct cgggctcttt gatgattcat aataacttgt cgaatcgcat 240

ggctttacgc cggcgatggt tcattcaaat ttctgcccta tcaactttcg atggtaggat 300

agtggcctac catggtggca acgggtaacg gggaataagg gttcgattcc ggagagggag 360

cctgagaaac ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcctaa 420

ttcagggagg tagtgacaat aaataacgat acagggccct tctgggtctt gtaattggaa 480

tgagtacaat gtaaatacct taacgaggaa caattggagg gcaagtctgg tgccagcagc 540

cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat taaagttgtt gcagttaaaa agctcgtagt 600

tgaactttgg gcctggcagg ccggtccgct ttttggcgag tactgaccct gccgggcctt 660

tccttctggc taccctcccc tctggagagg cgaaccagga cttttacttt gaaaattaga 720

gtgttcaaag caggcctttg ctcgaatata ttagcatgga ataatagaat aggacgtttg 780

gttctaaatg attaataggg acggtcgggg gcatcagtat tcagttgtca gaggtgaaat 840

tcttggattt actgaagact aactactgcg aaagcatttg ccaaggacgt tttcattaat 900

caagaacgaa agttagggga tcgaagatga tcagataccc gtcgtagtct taaccataaa 960

ctatgccgac tagggatcgg gtgttgtttt tataatgact cactcggcac cttacgagaa 1020

atcaaagtct ttgggttctg gggggagtat ggtcgcaagg ctgaaactta aaggaattga 1080

cggaagggca ccaccaggag tggagcctgc ggcttaattt gactcaacac ggggaaactc 1140

accaggtcag ggaaactcac caggtcgggg aaactcacca ggtccaggag tggagcctgc 1200

ggcttaattt gactcaacac ggggaaactc accaggtcca gacacaataa ggattgacag 1260

attgagagct cttcttgatt ttgtgggtgg tggtgcatgg ccgttcttag ttggtggagt 1320

gatttgtctg cttaattgcg ataacgaacg agaccttaac ctactaaata gcgcgactag 1380

cttttgctgg tgctgacgct tcttagaggg actatcgatt tcaagtcgat ggaagtttga 1440

ggcaataaca ggtctgtgat gcccttagac gttctgggcc ccgcacgcgc gctacactga 1500

cggagccagc gagtctagcc ttggccgana ggtcatgggt aatcttgtga aactccgtcg 1560

tgctgggggg atagagcatt gcaattattg ctctttt 1597

Claims (2)

1.一种产朊假丝酵母（Candida utilis）QC-1 ，其特征在于，所述的产朊假丝酵母（Candida utilis）QC-1保藏编号为CGMCC No.9165。

2.如权利要求1所述的产朊假丝酵母（Candida utilis）QC-1 CGMCC No.9165在降解棉杆中游离棉酚中的应用。