CN104025983A

CN104025983A - 丛枝菌根真菌和根瘤菌双接种促进豆科植物吸收矿物磷的应用

Info

Publication number: CN104025983A
Application number: CN201410247847.XA
Authority: CN
Inventors: 金海如; 刁亚南
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2014-06-06
Filing date: 2014-06-06
Publication date: 2014-09-10

Abstract

丛枝菌根真菌和根瘤菌双接种促进豆科植物吸收矿物磷的应用，属于豆科植物的培养方法技术领域。该应用中单株豆科植物中丛枝菌根真菌接种菌量为30～50个孢子/ml，根瘤菌接种量为浓度1.0×10⁹cfu.mL^-1的根瘤菌菌液5～15mL。该应用中矿物磷含量为每kg豆科植物培养基质中含有0.1～0.2g难溶性磷，难溶性磷为有效磷含量为0.67g/kg的磷矿粉。本发明为丛枝菌根真菌和根瘤菌双接种豆科植物吸收难溶性矿物质提供了理论依据，为减少化学肥料使用及促进豆科植物更好地利用营养物质提供了理论依据。

Description

丛枝菌根真菌和根瘤菌双接种促进豆科植物吸收矿物磷的应用

技术领域

本发明属于豆科植物的培养方法技术领域，具体涉及丛枝菌根菌和根瘤菌双接种促进豆科植物吸收矿物磷的应用。

背景技术

丛枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM）真菌是一类内生菌根真菌，广泛存在于土壤中，能与陆地上90%以上的植物根系形成共生体，其宿主包括苔藓植物、蕨类植物、裸子植物和被子植物。同时AM真菌的根外菌丝可以从外界环境中吸收水分和矿质元素，促进植物生长，改善植物营养状况。根瘤菌是革兰氏阴性细菌，广泛分布于土壤中，可与相应的豆科植物根系共生，侵染豆科植物的根部形成根瘤，进而将空气中的分子态氮转化为植物可利用的氨。研究表明，豆科植物根系周围生长着大量的AM真菌和根瘤菌，它们在长期的进化过程中形成了AM真菌-豆科植物-根瘤菌三重共生体系，从而为豆科植物的生长提供了丰富的营养。

磷素是植物所必需的，对于豆科植物来说，磷酸盐浓度的高低影响着植物的生长和有效根瘤的形成，且相对较高的磷水平有利于根瘤的形成和氮的固定。但大田土壤中90%的磷素是难溶性的，植物不能直接吸收利用，施用过多磷肥又会造成营养流失，环境污染。AM真菌作为内生菌根真菌，可与90%的植物形成共生体系，并可通过增加植物根际土壤中磷酸酶活性，增加植物对土壤中磷素的吸收，满足根瘤生长和固氮作用对磷的需求。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供利用丛枝菌根真菌和根瘤菌双接种促进豆科植物吸收难溶性磷的方法的技术方案。

所述的丛枝菌根真菌和根瘤菌双接种促进豆科植物吸收矿物磷的应用。

所述的应用，其特征在于所述的单株豆科植物中丛枝菌根真菌接种菌量为30～50个孢子/ml，根瘤菌接种量为浓度1.0×10⁹cfu.mL^-1的根瘤菌菌液5～15 mL。

所述的应用，其特征在于所述的丛枝菌根真菌为根内球囊霉，来自根内球囊霉与发根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根建立的共生系统，所述的根瘤菌经YMA斜面培养基活化及YMA液体培养基摇床培养获得。

所述的应用，其特征在于矿物磷含量为:每kg豆科植物培养基质中含有0.1～0.2g难溶性磷，所述的难溶性磷为有效磷含量为0.67g/kg的磷矿粉。

所述的应用，其特征在于所述的根内球囊霉与发根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根建立的共生系统为：以发根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根作为宿主。

本发明通过对丛枝菌根真菌和根瘤菌双接种豆科植物的试验，得到了丛枝菌根真菌和根瘤菌双接种能够促进豆科植物吸收难溶性磷的用途，为丛枝菌根真菌和根瘤菌双接种豆科植物吸收难溶性矿物质提供了理论依据，为减少化学肥料使用及促进豆科植物更好地利用营养物质提供了理论依据。

附图说明

图1为三室隔离培养盒的示意图；

图2为不同浓度磷矿粉对茎叶总磷含量的影响图。

图2中磷矿粉中的有效磷含量为0.67g/kg，设置每kg 河沙中0、0.06、0.12、和0.24g磷矿粉，分别用P0、P1、P2、P3表示。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例

（1）育苗处理

选取籽粒饱满的绿豆种子，10%H₂O₂消毒10 min，蒸馏水反复冲洗干净后播种于盛有灭菌蛭石的培养杯中，置于智能光照培养箱中培养。待种子萌发，植株长出两片真叶后选取长势一致的绿豆苗进行移栽。

（2）菌剂的制备

将AM真菌根内球囊霉（Glomus. intraradices）与毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根建立的共生系统倒入粉碎机中粉碎，然后倒入400目筛子中用自来水反复冲洗至培养基消失。漂洗干净后，用蒸馏水稀释到每毫升30～50个孢子后倒入试剂瓶，内含有侵染根，孢子和菌丝。根瘤菌在YMA斜面培养基上活化后，后转接到盛于200mLYMA液体培养基的500mL三角瓶中，置于摇床上培养。

（3）培养方法

将育好的绿豆苗转移到三室隔离培养盒中（如图1所示），三室隔离培养盒是由不锈钢的白色铁皮制作，两层孔径大小为38 μm的尼龙网将培养盒分成菌根室1、隔离室2和菌丝室3。菌丝室3的体积为5 cm×10 cm×13 cm，菌根室1的体积为3 cm×10 cm×10 cm，隔离室2的体积仅为1 cm×10 cm×10 cm，并且隔离室2的尼龙网只允许菌丝通过而不允许植物根通过进入菌丝室3，这样有效地减少了菌根室和菌丝室之间的营养物质流动。同时菌根室1比菌丝室3高3cm，进一步限制了两室之间的营养物质流动。菌根室1中的培养基质为灭菌的河沙，该河沙经自来水反复冲洗后再用去离子水冲洗，然后1×10⁵ Pa灭菌2 h得到。

因根瘤菌是细菌，不能产生菌丝，不能透过隔离层吸收菌丝室的营养物质，故本试验设置3 个处理，接种根瘤菌、 AM真菌及根瘤菌和AM真菌双接种。AM真菌接种菌剂为2 mL（孢子数约为60～100个），根瘤菌菌液5～15 mL（浓度约1.0×10⁹cfu.mL^-1），在接种根瘤菌之前先用根瘤菌菌液浸泡根5min，后都置于智能光照培养箱中培养，光照温度为25℃，夜间温度为18℃。每隔6d向菌根室加5mL的Hoagland限氮限磷营养液（如表1）。30d后往菌丝室施加灭菌河沙，继续培养10d，保证菌根室1的菌丝可以延伸进入到菌丝室3，在此培养过程中每隔6d在菌根室1和菌丝室3加入5mL的 Hoagland限氮限磷营养液。

表1 Hoagland限氮限磷营养液

菌丝进入菌丝室后，向菌丝室施加不同浓度的磷肥，依次为每kg 河沙中0、0.06、0.12、和0.24g磷矿粉，分别用P0、P1、P2、P3表示。同时菌根室1和菌丝室3每6d加一次5mL缺磷营养液（如表2）。接种根瘤菌的植株也做相同试验。每个处理重复3次，共36盆（3×3×4），培养30d收获。

表2 缺磷营养液配方

（4）测定项目和方法

收获后的绿豆地上茎叶和地下菌根分别保存。菌根用自来水冲洗干净，然后在不同部位取根，并将它们剪成1cm大小的根段，采用曲利苯蓝染色-方格交叉法测定菌根侵染率；叶绿素含量采用丙酮乙醇提取法测定；剩余的茎叶和根系通过低温冷冻干燥后，茎叶中总磷含量采用钼锑抗显色法测定，菌根中的Arg含量则用甲萘酚-双乙酰法测定。

所得结果如下面所示。

（1）不同浓度磷矿粉下AM真菌和根瘤菌对绿豆生长的影响

由表3显示，随着施磷浓度增加，单接根瘤菌、AM真菌和双接种的茎叶干重均呈先升后降趋势，并在 P2水平时达到最大值；双接种茎叶干重在P2水平时显著高P0水平，而单接根瘤菌和单接AM真菌比P0水平略高，但差异均未达到显著水平。株高和叶绿素含量变化趋势与茎叶干重一致，最大值也出现在 P2 水平，且三种接种处理中的株高在P2 水平时显著高于P0水平，而叶绿素含量随磷水平的变化，差异不显著。接种情况同样影响绿豆的茎叶干重、株高和叶绿素含量，由表3知双接种处理明显高于单接AM真菌和单接根瘤菌处理。

表3不同浓度磷矿粉对绿豆生长状况的影响

（2）不同浓度的磷矿粉对绿豆菌根侵染率及根瘤的影响

单接根瘤菌的绿豆处理未发现有菌根的侵染，而接种AM真菌的绿豆植株均有一定程度的侵染，但不同磷浓度之间菌根侵染率无显著差异；同一施磷条件下，双接种处理显著提高了宿主植物绿豆的菌根侵染率，接种株最高侵染率出现在 P2水平，但随施磷量增加，绿豆的菌根侵染率反而降低，由此说明，高浓度磷矿粉不利于AM真菌的侵染。

由表4显示，随着磷矿粉水平的增加，单接根瘤菌的植株根瘤数及根瘤鲜重均呈现上升趋势，且在P3水平时最高。与单接根瘤菌相比，双接种使绿豆的根瘤数和根瘤鲜重明显增加，其变化趋势为先升后降，在P2水平时最高，是同种磷水平下单接根瘤菌植株的1.81倍和2.11倍。

表4 不同浓度磷矿粉对绿豆菌根侵染及根瘤的影响

（3）AM真菌和根瘤菌吸收不同浓度磷矿粉对茎叶中总磷含量的影响

如图2所示，随着施加磷水平的增加，单接根瘤菌的植株茎叶中总磷含量没有明显的变化规律，差异不显著；而单接AM真菌和双接种处理均呈现先升后降的趋势，在P2水平时总磷含量最高，不同磷水平对茎叶总磷含量的影响趋势均为P2>P1>P3>P0。双接种处理中，P2水平下的总磷含量分别比P0、P1、P3水平下提高了53.20%、19.16%、40.27%。同一磷浓度下，双接种和单接AM真菌处理比单接根瘤菌（对照）茎叶中总磷含量有显著提高，并且双接种下总磷含量高于单接AM真菌，且在P1和 P3水平差异显著，分别增加了28.59%和18.92%。

本发明以绿豆作为宿主植物播种于三室隔离培养盒，同时接种AM真菌、根瘤菌和双接种，并且在菌丝室施加磷矿粉。随着磷矿粉的浓度增加，对绿豆的生长状况、菌根侵染、根瘤数及茎叶总磷含量都产生了一定的影响，并且双接种条件下对其影响最明显。这为双接种技术应用于农业生产，吸收难溶性矿物质提供了理论依据，同时还可减少化学肥料的应用。

Claims

1.丛枝菌根真菌和根瘤菌双接种促进豆科植物吸收矿物磷的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的单株豆科植物中丛枝菌根真菌接种菌量为30～50个孢子/ml，根瘤菌接种量为浓度1.0×10⁹cfu.mL^-1的根瘤菌菌液5～15 mL。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的丛枝菌根真菌为根内球囊霉，来自根内球囊霉与发根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根建立的共生系统，所述的根瘤菌经YMA斜面培养基活化及YMA液体培养基摇床培养获得。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于矿物磷含量为:每kg豆科植物培养基质中含有0.1～0.2g难溶性磷，所述的难溶性磷为有效磷含量为0.67g/kg的磷矿粉。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的根内球囊霉与发根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根建立的共生系统为：以发根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根作为宿主。