CN104017837B - 瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法。该方法是在有机溶剂中，以式（Ⅰ）化合物为底物，在脂肪酶和手性有机胺的作用下，再添加壳聚糖或壳聚糖复合物进行反应，生成式（Ⅱ）化合物，即为瑞舒伐他汀手性中间体。本发明有效地提高了反应速度，减少了副反应，且降低了副产物对酶的毒害作用，酶的重复利用率高；同时本发明的产物收率和ee值高，操作简便，具有优越的工业化应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种瑞舒伐他汀手性中间体的脂肪酶催化制备方法，属于制药和生物化工技术领域。
背景技术
心脑血管疾病是危害人类（特别是中老年）健康最常见、最严重的疾病之一。根据近年卫生部在全国范围内进行的中国居民营养与健康状况调查显示，总患病率为18.6％，全国患者总人数达1.6亿。他汀类药物是目前治疗高血压、高血脂等心血管疾病最有效的药物。
瑞舒伐他汀在药效和安全性方面均达到令人满意的结果，被称为“超级他汀”。该他汀由阿斯利康(Astrazeneca)公司研究开发并于2002年11月首次在荷兰获批，2003年8月通过美国FDA上市审批，2009年在全球销售额高达44亿美元。
在瑞舒伐他汀的合成和制备工艺中，高光学纯度(≥99％)的手性侧链的合成是关键步骤，同时也是难点。利用传统的化学合成的方法，由于(S)-3-羟基戊二酸单甲酯或单乙酯的碳链长度比较短，而且含有羟基、羧基和酯基等活泼基团，很容易破坏产物分子的结构，其制备成本相比其他他汀类药物要高出许多，所以销售价格一直居高不下，制约了其市场的开拓和发展，同时也妨碍了心血管疾病的有效控制和治疗。
目前多篇文献已经报道了脂肪酶法催化转胺反应获得瑞舒伐他汀手性中间体(S)-3-羟基戊二酸单甲酯或单乙酯。SusanaPuertas等[J.Org.Chem.1996,61,6024-6027]在1996年的时候就报道了脂肪酶催化不带支链的有机胺胺解3-羟基戊二酸二甲酯，反应在1，4-二氧六环中进行，加入分子筛并且通氮气保护，产物的ee值仅为80%。Sa′nchez等[J.Org.Chem.1999,64,1464-1470]在同样的反应条件下，采用消旋苯乙胺胺解3-羟基戊二酸二甲酯，ee值较高能达到96%，但是产物的收率仅为45%。该反应虽然获得了很好的选择性，但是收率较低，反应体系中的水含量对于脂肪酶催化胺解反应影响很大。
脂肪酶法催化转胺反应获得瑞舒伐他汀手性中间体的方法存在着以下几个问题：（1）溶剂1，4-二氧六环的水分含量较高，会导致脂肪酶水解的副产物产生；（2）副产物甲醇量大，对酶有毒害作用；（3）分子筛容易吸附氮气，从而影响其对水和甲醇的吸附能力；（4）苯乙胺的利用率最高仅为50%，反应后处理复杂，需要通氯化氢将反应剩余的S-（-）-α-苯乙胺成盐后水洗除去。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法。本发明有效地提高了反应速度，减少了副反应，且降低了副产物对酶的毒害作用，使得酶的重复利用率高；同时本发明的产物收率和ee值高，操作简便，具有优越的工业化应用价值。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：一种瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，在有机溶剂中，以式（Ⅰ）化合物为底物，在脂肪酶和手性有机胺的作用下，再添加壳聚糖或壳聚糖复合物进行反应，生成式（Ⅱ）化合物，即为瑞舒伐他汀手性中间体。
上述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述R1为C1-C4直链或支链烷基。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述R1为甲基或乙基。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述的手性有机胺为R-（+）-α-苯乙胺。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述的脂肪酶为lipaseTLIM、Novozym435、猪胰脂肪酶PPL、lipasePS“Amano”SD或lipaseAK“Amano”。
上述的脂肪酶均为市售产品，其中lipaseTLIM购于诺维信公司、Novozym435购于诺维信公司、猪胰脂肪酶PPL购于西格玛奥德里奇公司、lipasePS“Amano”SD购于天野酶公司、lipaseAK“Amano”购于天野酶公司。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述的脂肪酶为Novozym435。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述的有机溶剂为甲苯。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述的甲苯与式（Ⅰ）化合物的质量比为1～10倍。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述壳聚糖或壳聚糖复合物的分子量为2×105～5×105。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述的壳聚糖复合物为聚乙二醇的壳聚糖复合物。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述的反应在氮气保护下进行。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述脂肪酶与式（Ⅰ）化合物的质量比为0.001～100∶1。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述脂肪酶与式（Ⅰ）化合物的质量比为0.1～0.2∶1。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述手性有机胺与式（Ⅰ）化合物的摩尔比为0.01～50∶1。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述手性有机胺与式（Ⅰ）化合物的摩尔比为1.05～1.1∶1。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述壳聚糖或壳聚糖复合物与式（Ⅰ）化合物的质量比为0.01～100∶1。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述壳聚糖或壳聚糖复合物与式（Ⅰ）化合物的质量比为0.5～2∶1。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述反应的温度为-10～90℃。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述反应的温度为30～40℃。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述反应的时间为1～72h。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，所述反应的时间为8～12h。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，反应后所得的反应液，经过滤除去脂肪酶和壳聚糖或壳聚糖复合物，再通空气30～400min，水溶液萃取1～3次，水相用二氯甲烷萃取2～5次，合并所有有机相，旋转蒸发干燥得粗产品，再经乙酸乙酯重结晶得式（Ⅱ）化合物。
前述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法中，再通空气60～120min，水溶液萃取1次，水相用二氯甲烷萃取3次。
与现有技术相比，本发明一方面采用了水含量较低的溶剂甲苯，并且采用了壳聚糖或壳聚糖复合物高效地吸附水和甲醇，避免了氮气的竞争性吸附，有效地阻止了脂肪酶水解的副反应进行，降低了甲醇对脂肪酶的毒害作用，促进了胺解反应快速地向正向进行，提高了反应速度和转化率，同时酶可以被重复利用，降低了成本。另一方面本发明采用R-（+）-α-苯乙胺为底物，原子利用度高，光学选择性好，简化了反应后处理步骤。采用本发明获得的产物收率和ee值高，提高了产品质量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：聚乙二醇的壳聚糖复合物Ⅰ的制备
将3g的壳聚糖加入100mL20g/L的醋酸溶液中，配制成30g/L的壳聚糖醋酸溶液，搅拌1h。然后加入1.5g的致孔剂聚乙二醇（分子量600g/mol），继续搅拌1h。过滤去除杂质，滤液通过蠕动泵滴加入缓慢搅动的碱性固化液（500mL甲醇与100mL400g/L的NaOH溶液的混合溶液）中成型，得到白色壳聚糖颗粒。将所得颗粒水洗至中性，加蒸馏水煮沸1h，取出风干，置于80～100℃的烘箱中烘24h，直至重量不再减少，得到壳聚糖复合物Ⅰ，取出保存于真空干燥器中备用。
实施例2：聚乙二醇的壳聚糖复合物Ⅱ的制备
将3g的壳聚糖加入100mL20g/L的醋酸溶液中，配制成30g/L的壳聚糖醋酸溶液，搅拌1h。然后加入0.5g的致孔剂聚乙二醇（分子量600g/mol），继续搅拌1h。过滤去除杂质，滤液通过蠕动泵滴加入缓慢搅动的碱性固化液（500mL甲醇与100mL400g/L的NaOH溶液的混合溶液）中成型，得到白色壳聚糖颗粒。将所得颗粒水洗至中性，加蒸馏水煮沸1h，取出风干，置于80～100℃的烘箱中烘24h，直至重量不再减少，得到壳聚糖复合物Ⅱ，取出保存于真空干燥器中备用。
实施例3：3-羟基戊二酸二甲酯的脂肪酶法胺解
将0.5g（2.84mmol）3-羟基戊二酸二甲酯、0.52g（4.26mmol）R-（+）-α-苯乙胺以及0.25gNovozym435置于2.5g甲苯中，通氮气保护，反应温度为30℃，反应时间24h。反应液过滤除去脂肪酶，在滤液中通空气120min，用5mL水萃取1次，水相用二氯甲烷洗2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，旋干得0.7g粗产品。
粗产品用乙酸乙酯重结晶无产物，于是采用硅胶柱分离，洗脱剂为正己烷∶乙酸乙酯(1∶1)，TLC跟踪，收集产物，旋干后得0.61g产品，反应收率为81.1%。
产物ee值检测采用高效液相色谱，检测条件为：Agilent1100液相色谱，ChiralcelOD-H色谱柱，流动相为正己烷∶异丙醇（93∶7），流速0.8mL/min，柱温30℃，紫外检测波长210nm，产品取5μL溶于1mL流动相中，进样量为2μL。出峰时间：苯乙胺（9.2min，10.8min），二酯（19.2min），产物（21.5min，25min）。检测结果显示产品ee值为98.3%。
实施例4：添加壳聚糖的3-羟基戊二酸二甲酯的脂肪酶法胺解
将0.5g（2.84mmol）3-羟基戊二酸二甲酯[即式（Ⅰ）化合物]、0.36g（2.98mmol）R-（+）-α-苯乙胺、0.5g壳聚糖（脱乙酰度≥85%）以及0.25gNovozym435（或者是lipaseTLIM、猪胰脂肪酶PPL、lipasePS“Amano”SD、lipaseAK“Amano”）置于5g甲苯中，通氮气保护，反应温度为40℃，反应时间24h。反应液过滤除去脂肪酶和壳聚糖，在滤液中通空气120min，用5mL水萃取1次，水相用二氯甲烷洗2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，旋干得0.76g粗产品。乙酸乙酯重结晶得0.69g，收率为91.7%，产品ee值为98.5%。
实施例5：添加壳聚糖复合物Ⅰ的3-羟基戊二酸二甲酯的脂肪酶法胺解
将0.5g（2.84mmol）3-羟基戊二酸二甲酯、0.38g（3.12mmol）R-（+）-α-苯乙胺、0.25g壳聚糖复合物Ⅰ以及0.25gNovozym435置于0.5g甲苯中，通氮气保护，反应温度为30℃，反应时间为12h。反应液过滤除去脂肪酶和壳聚糖复合物Ⅰ，在滤液中通空气30min，用5mL水萃取1次，水相用二氯甲烷洗3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，旋干得0.75g粗产品。乙酸乙酯重结晶得0.73g，收率为96.8%，产品ee值为98.9%。
实施例6：添加壳聚糖复合物Ⅱ的3-羟基戊二酸二乙酯的脂肪酶法胺解
将0.58g（2.84mmol）3-羟基戊二酸二乙酯、0.38g（3.12mmol）R-（+）-α-苯乙胺、0.3g壳聚糖复合物Ⅱ以及0.25gNovozym435置于0.58g甲苯中，通氮气保护，反应温度为40℃，反应时间为24h。反应液过滤除去脂肪酶和壳聚糖复合物Ⅱ，在滤液中通空气30min，用5mL水萃取1次，水相用二氯甲烷洗3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，旋干得0.79g粗产品。乙酸乙酯重结晶得0.77g，收率为97.2%，产物ee值为99.3%。
实施例7：添加壳聚糖复合物Ⅰ的3-羟基戊二酸二甲酯的脂肪酶法胺解的放大反应
将5g（28.4mmol）3-羟基戊二酸二甲酯、3.6g（2.98mmol）R-（+）-α-苯乙胺、2.5g壳聚糖复合物Ⅰ以及2.5gNovozym435置于25g甲苯中，通氮气保护，反应温度为30℃，反应时间为12h。反应液过滤除去脂肪酶和壳聚糖复合物Ⅰ，在滤液中通空气30min，用5mL水萃取1次，水相用二氯甲烷洗3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，旋干得7.8g粗产品。乙酸乙酯重结晶得7.41g，收率为98.4%，产物ee值为99.0%。
从实施例4-7可以得出，采用本发明获得的式（Ⅱ）化合物，即为瑞舒伐他汀手性中间体，的收率达91%以上、ee值达98%以上，产品的质量非常理想。
实施例8：脂肪酶的重复利用率
按照实施例7的反应条件，脂肪酶重复使用5批，产物的收率分别为98.4%，98.5%，97.7%，97.2%以及95.3%，而产物ee值分别为99.0%，99.2%，98.7%，98.9%以及97.2%。可见本发明可以有效阻止脂肪酶水解的副反应进行，降低了甲醇对脂肪酶的毒害作用，使得酶的重复利用率好，降低了制备成本。
Claims (21)
1.瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：在有机溶剂中，以式(Ⅰ)化合物为底物，在脂肪酶和手性有机胺的作用下，再添加壳聚糖或壳聚糖复合物进行反应，生成式(Ⅱ)化合物，即为瑞舒伐他汀手性中间体；所述的手性有机胺为R-(+)-α-苯乙胺。
2.根据权利要求1所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述R1为C1-C4直链或支链烷基。
3.根据权利要求2所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述R1为甲基或乙基。
4.根据权利要求1所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述的脂肪酶为lipase TL IM、Novozym 435、猪胰脂肪酶PPL、lipase PS“Amano”SD或lipase AK“Amano”。
5.根据权利要求4所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述的脂肪酶为Novozym 435。
6.根据权利要求1所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为甲苯。
7.根据权利要求6所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述的甲苯与式(Ⅰ)化合物的质量比为1～10倍。
8.根据权利要求1所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述壳聚糖或壳聚糖复合物的分子量为2×105～5×105。
9.根据权利要求8所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述的壳聚糖复合物为聚乙二醇的壳聚糖复合物。
10.根据权利要求1所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述的反应在氮气保护下进行。
11.根据权利要求1所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述脂肪酶与式(Ⅰ)化合物的质量比为0.001～100∶1。
12.根据权利要求11所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述脂肪酶与式(Ⅰ)化合物的质量比为0.1～0.2∶1。
13.根据权利要求1所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述手性有机胺与式(Ⅰ)化合物的摩尔比为0.01～50∶1。
14.根据权利要求13所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述手性有机胺与式(Ⅰ)化合物的摩尔比为1.05～1.1∶1。
15.根据权利要求1所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述壳聚糖或壳聚糖复合物与式(Ⅰ)化合物的质量比为0.01～100∶1。
16.根据权利要求15所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述壳聚糖或壳聚糖复合物与式(Ⅰ)化合物的质量比为0.5～2∶1。
17.根据权利要求1所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述反应的温度为30～40℃。
18.根据权利要求1所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述反应的时间为1～72h。
19.根据权利要求18所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述反应的时间为8～12h。
20.根据权利要求1至19任一项所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：反应后所得的反应液，经过滤除去脂肪酶和壳聚糖或脂肪酶和壳聚糖复合物，再通空气30～400min，水溶液萃取1～3次，水相用二氯甲烷萃取2～5次，合并所有有机相，旋转蒸发干燥得粗产品，再经乙酸乙酯重结晶得式(Ⅱ)化合物。
21.根据权利要求20所述的瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法，其特征在于：所述的再通空气是60～120min，水溶液萃取是1次，水相用二氯甲烷萃取是3次。
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