CN104004769B - TaNAC2蛋白及其编码基因的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种TaNAC2蛋白及其编码基因的应用，TaNAC2基因可以促进植物对氮的吸收利用。本发明公开的一种提高植物氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率的方法，包括如下步骤：将SEQ？ID？No.4所示的蛋白的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率提高。本发明具有如下优点：1、TaNAC2基因作为硝态氮响应的调控因子调控小麦氮素吸收利用途径上的一系列基因的表达，这对阐明植物氮素代谢利用的机理研究将有极大的推动作用。2、通过基因工程技术提高TaNAC2的表达量能够提高氮素同化效率，从而达到少施肥多产出的目的等。

Description

TaNAC2蛋白及其编码基因的应用
技术领域
本发明涉及一种转录调控因子及其编码基因的应用；特别涉及TaNAC2蛋白及其编码基因在调控植物氮素吸收利用中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
小麦是我国重要的粮食作物。无论是栽培面积还是总产量，我国都是世界上最大的小麦生产国。在新中国建立初期，中国的小麦单产很低，1952年只有0.73吨/公顷(48.8公斤/亩)，到2006年达到4.55吨/公顷(303.3公斤/亩)，增加了5.2倍，其中一个重要原因就是化肥用量的增加。据统计，化肥对农业增产的贡献占32％，占农业生产成本的25％，占全部农业生产物质费用的50％。目前我国年氮肥用量超过24Mt(纯氮)，占全世界年氮肥消耗量的30％以上(Juetal.,2004)。然而在我国氮肥利用率较低，只有30-35％(发达国家45％)，有多达45–50％的氮肥未被农作物吸收利用而损失进入环境，导致资源浪费和环境污染(ZhuandChen,2002)。在我国耕地面积持续减少的情况下，仍需依靠增施化肥来促进小麦等农作物增产以满足日益增长粮食需求。因此，利用生物学手段提高小麦吸收利用氮素的效率对保证我国粮食安全和农业可持续发展具有十分重大的战略意义。
植物对氮的吸收利用包括两个过程：氮素的吸收转运和氮素的同化，这其中涉及到的基因在模式植物拟南芥中研究的最清楚。植物对硝酸根的吸收靠两套硝酸根转运系统：高亲和性硝酸根转运蛋白和低亲和性硝酸根转运蛋白。硝酸根浓度较低时高亲和性转运蛋白起作用，AtNRT2.1和AtNRT2是最早克隆到的高亲和性硝酸根转运基因(FilleurandDaniel-Vedele,1999；Zhuoetal.,1999)，根据同源搜索，又发现了这个家族的另外五个基因(Initiative.,2000)。硝酸根浓度较高时低亲和性转运蛋白起作用，AtNRT1.1(CHL1)是在抗氯酸盐(硝酸盐类似物)的突变体中克隆出来的(Tsayetal.,1993)。硝酸根进入植物体后要经过硝酸根还原酶(NR)和亚硝酸根还原酶(NiR)的作用还原为铵态氮(NH4 +)，在谷氨酰胺合成酶GS、谷氨酸脱氢酶GDH的作用下，进入氨基酸代谢途径。研究表明超量表达GS、GOGAT和GDH，可以明显提高农作物氮素同化效率和产量(Amezianeetal.2000；Habashetal.2001；MiflinandHabash2002)。
以上研究只是停留在单个功能基因层面，氮、磷吸收同化的调控是交叉网络式的，涉及光合作用、能量代谢等过程，单凭通路中某个基因的超量表达往往难以提高植物的养分利用效率。Dof是一类植物特有的转录因子，最近的研究表明：将拟南芥中的Dof1基因超量表达，可以显著提高(～30％)拟南芥中的氮净含量和耐受缺氮的能力(Yanagisawaetal.,2004)。其原理是Dof1可以调控碳素同化过程中的关键基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸激酶(PK)等高表达，提高碳代谢途径，积累合成氨基酸所需要的碳骨架，因此增加了蛋白质的含量。因此，寻找新的调控植物氮磷响应的调控因子，不仅可以进一步理解植物适应氮磷胁迫的基因调控网络，而且还可为养分高效农作物新品种培育提供新的基因资源。
NAC转录因子是植物特有的转录调控因子。自1996年从矮牵牛(Petuniahybrida)中克隆得到植物中第一个NAC转录因子以来，目前已在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻、小麦、大豆(Glycinemax)等物种中相继发现。拟南芥中至少包含107个NAC基因(Riechmannetal.,2000)，水稻中含有140个(Fangetal.,2008)。在NAC转录因子中，最主要的结构特点是各成员的N端含有高度保守的NAC结构域。NAC结构域大约由160个氨基酸残基组成，可分为I、II、III、IV和V共5个亚结构域(Ookaetal.,2003),可能负责与DNA和其它蛋白结合(Ernstetal.,2004)。NAC蛋白的C端保守性较低，具有转录激活功能(Renetal.,2000；Xieetal.,2000；Duvaletal.,2002)。研究表明，NAC类蛋白参与了种子的萌发(Kimetal.,2008)、细胞次生壁的合成(Kuboetal.,2005；Koetal.,2007)、器官边界和分生组织的形成(Aidaetal.,1997；Takadaetal.,2001；Vroemenetal.,2003；Maoetal.,2007)、开花(Kimetal.,2007)、衰老(GuoandGan,2006；Yoonetal.,2008；Uauyetal.,2006)等多个植物生长发育过程。NAC类蛋白还在植物的生物胁迫如病害过程中发挥着重要作用(CollingeandBoller,2001；Jensenetal.,2007；Buetal.,2008)。目前已发现多个NAC蛋白参与植物对逆境的响应。来自水稻的SNAC1/2(stress-responsiveNAC2)基因受到干旱、高盐、低温、伤以及ABA的诱导表达,其过表达植株耐冷、抗盐并能抵御干旱等(Huetal.,2008)，将小麦中的TaNAC2超表达在拟南芥中也能够提高拟南芥对非生物胁迫的耐受力(Maoetal.,2012)。NAC蛋白中中国春小麦的TaNAC2基因的核苷酸序列如SEQIDNo.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示，TaNAC2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。综上，NAC类蛋白作为一类重要的转录因子，在调控植物生长发育过程和多种植物逆境防御反应方面发挥着重要作用，然而关于NAC类蛋白在提高植物养分吸收尤其是调控硝酸根吸收速率方面的研究却鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种TaNAC2蛋白及其编码基因的应用，TaNAC2蛋白及其编码基因可以促进植物对氮的吸收利用。
本发明提供一种提高植物氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率的方法，包括如下步骤：将SEQIDNo.4所示的蛋白的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率提高。
上述方法中，所述编码基因是通过重组载体导入的，所述重组载体是将所述编码基因替换改造后的pACH25的GUS基因序列得到的，具体是将SEQIDNo.3所示的DNA分子插入改造后的pACH25的BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点间，替换改造后的pACH25的GUS基因序列得到的；
所述改造后的pACH25是将Ubiquitin启动子插入pACH25载体的PstⅠ酶切位点间得到；
所述将SEQIDNo.4所示的蛋白的编码基因导入出发植物的方法为基因枪介导转化的方法；
所述编码基因的核苷酸序列具体如SEQIDNo.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示。
上述任一所述的方法中，所述植物为小麦。
如下任一所述的物质在提高植物氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)SEQIDNo.4所示的蛋白；
(2)SEQIDNo.4所示蛋白的编码基因；
(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
如下任一所述的物质在促进植物生长、发育和/或产籽中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)SEQIDNo.4所示的蛋白；
(2)SEQIDNo.4所示蛋白的编码基因；
(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
如下任一所述的物质在促进植物根生长中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)SEQIDNo.4所示的蛋白；
(2)SEQIDNo.4所示蛋白的编码基因；
(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
如下任一所述的物质在促进植物主根长增长和/或侧根数增加中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)SEQIDNo.4所示的蛋白；
(2)SEQIDNo.4所示蛋白的编码基因；
(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
如下任一所述的物质在提高植物硝酸根吸收速率中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)SEQIDNo.4所示的蛋白；
(2)SEQIDNo.4所示蛋白的编码基因；
(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
如下任一所述的物质在提高植物分蘖数或地上部分干重，或提高植物单株籽粒产量，或提高植物植株中氮含量，或提高植物籽粒中氮浓度中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)SEQIDNo.4所示的蛋白；
(2)SEQIDNo.4所示蛋白的编码基因；
(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
上述任一所述的应用中，所述植物为小麦；
所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示。
本发明具有如下优点：
1、虽然目前已经克隆到了一些氮素吸收、同化、转运等过程的关键基因，但植物氮素吸收利用的调控是交叉网络式的，单个功能基因不足以阐明其调控网络，而本发明克隆的TaNAC2基因作为硝态氮响应的调控因子调控小麦氮素吸收利用途径上的一系列基因的表达，这对阐明植物氮素代谢利用的机理研究将有极大的推动作用。
2、TaNAC2基因可以促进小麦提高硝酸根吸收速率、单株籽粒产量、植株总氮含量、籽粒氮浓度以及氮素收获指数，说明通过基因工程技术提高TaNAC2的表达量能够提高氮素同化效率，从而达到少施肥多产出的目的。
3、TaNAC2基因不仅影响氮素吸收利用，超表达该基因还增加了小麦的侧根数目和最长根长，该基因的功能研究对于植物水肥高效利用的研究意义深远。
附图说明
图1为pACH25/TaNAC2载体示意图。
图2为转基因植株的DNA水平鉴定。
图3为转基因植株的RNA水平鉴定。
图4为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下根系表型。
图5为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下根的硝酸根吸收速率。
图6为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下分蘖数。
图7为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下苗期的地上部干重。
图8为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下单株籽粒产量。
图9为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下苗期总氮含量测定。
图10为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下籽粒氮浓度。
图11为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下氮素收获指数。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
中国春小麦(TriticumaestivumL.，“ChineseSpring”)在文献“BrenchleyR,SpannaglM,PfeiferM,etal.Analysisofthebreadwheatgenomeusingwhole-genomeshotgunsequencing[J].Nature,2012,491(7426):705-710.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
KODplusDNA聚合酶购自TOYOBO公司。
10×PCRbufferforKODplus购自TOYOBO公司。
pACH25载体在文献“ChristensenAH,QuailPH，1996，Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicRes5:213–218，”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，改造后的pACH25载体是将Ubiquitin启动子插入pACH25载体的PstⅠ酶切位点间得到。
小麦陇春23在文献“袁俊秀，杨文雄，丰产广适优质春小麦新品种-陇春23号，麦类作物学报,2009,29(4):740”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
实施例中氮素浓度分别为2mM和0.2mM的高氮营养液和低氮营养液的配方如表1所示。
表1高氮营养液和低氮营养液的配方
在上述体系中各加入0.04g/100mlMES(中文名2-(4-吗啉)乙磺酸)的水溶液调节pH至5，除上述组分外，高氮营养液和低氮营养液的余量为水。
实施例1、转TaNAC2基因小麦的构建
一、转TaNAC2基因植株的制备
(一)TaNAC2基因的获得
1、提取中国春小麦的总RNA，反转录得到其基因组cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，以如下引物为引物进行PCR扩增。
上游引物：5’-GGATCCATGGGGATGCCGGCCGTG-3’(SEQIDNo.1)
(下划线所示序列为BamHⅠ酶切识别位点)
下游引物：5’-GGTACCGAACGGGGCCGGCATGC-3’(SEQIDNo.2)
(下划线所示序列为KpnⅠ酶切识别位点)
PCR体系(40μl)：模板cDNA4μl，KODplusDNA聚合酶1μl，10×PCRbufferforKODplus4μl，dNTPs(2mMeach)4μl，25mM的MgSO42μl，上下游引物各20mM，再用双蒸水将反应体系补足至40μl。
PCR反应程序：98℃2min；98℃30sec，58℃30sec，68℃45sec，35个循环。
PCR扩增产物如SEQIDNo.3所示。TaNAC2基因的核苷酸序列如SEQIDNo.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示，TaNAC2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。
(二)TaNAC2基因克隆载体的构建
用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切SEQIDNo.3所示的DNA分子，得到基因片段；BamHⅠ和KpnⅠ双酶切改造后的pACH25载体，得到载体大片段，将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pACH25/TaNAC2，将重组质粒送测序，结果正确。pACH25/TaNAC2中TaNAC2基因由Ubiquitin启动子启动，如图1所示。
(三)转基因小麦的获得
将pACH25-TaNAC2用基因枪的方法转入小麦陇春23中，得到T0代转TaNAC2基因小麦。提取T0代转TaNAC2基因小麦叶片的基因组DNA，以其作为模板，用正向引物和反向引物进行PCR扩增，得到500bp左右的片段，即为阳性T0代转TaNAC2基因小麦。
pF：5’-TTAGCCCTGCCTTCATACGC-3’(SEQIDNo.5)
pR:5’-CAGTCGGTCTTGACCCCCTTA-3’(SEQIDNo.6)
将上述鉴定为阳性的T0代转TaNAC2基因小麦培养至T3代，T1-T3代按照T0代的鉴定方法进行鉴定，筛选T3代转TaNAC2基因纯合系(即T2代的种子收获后PCR鉴定下一代植株全部是转TaNAC2基因阳性植株的系认定为纯合系)，收获种子，后续实验均采用该T3代转TaNAC2基因纯合系(以下简称T3代转TaNAC2基因小麦株系)。
将载体pACH25利用上述方法转化小麦陇春23，得到转空载体小麦。
二、转基因植株的检测及表型分析
(一)DNA水平检测
分别提取T3代转TaNAC2基因小麦、转空载体小麦以及野生型小麦陇春23的叶片的DNA，分别以其为模板，以pF和pR为引物进行PCR扩增，同时以水作为空白对照。
PCR反应体系(20μl)：
PCR反应程序：94℃，3min；94℃30s，60℃30s，72℃40s，40个循环；72℃5min。
TaNAC2基因的目的PCR扩增条带为500bp左右，结果如图2所示。
图2中，LC：野生型小麦陇春23；OE1和OE2分别是两个T3代转TaNAC2基因小麦株系。
图2表明，野生型小麦陇春23没有目的条带，两个T3代转TaNAC2基因小麦株系OE1和OE2经初步鉴定为阳性转TaNAC2基因小麦。
转空载体小麦的实验结果与野生型小麦陇春23的实验结果一致。
(二)RNA水平检测
1、分别提取T3代转TaNAC2基因小麦、转空载体小麦以及野生型小麦陇春23的叶片的总RNA，并反转录成cDNA。
2、分别以步骤1得到的cDNA为模板，以TaNAC2RTpF和TaNAC2RTpR为引物进行RT-PCR，扩增TaNAC2基因，同时以TublinpF和TublinpR为引物进行RT-PCR，扩增内参基因Tublin。
引物如下：
上游引物TaNAC2RTpF:5’-CTGGGTGCTCTGCCGGCTCTAC-3’(SEQIDNo.7)
下游引物TaNAC2RTpR:5’-CTCCGCCTTGGGCTCCATCATC-3’(SEQIDNo.8)
上游引物TublinpF:5'-ACCGCCAGCTCTTCCACCCT-3'(SEQIDNo.9)
下游引物TublinpR:5'-TCACTGGGGCATAGGAGGAA-3'(SEQIDNo.10)
PCR体系：
(lightCyclerSYBRGreenImaster,购自Roche)
PCR程序：94℃，5min；94℃10s，60℃20s，72℃15s，40个循环。
定量分析：采用RocheLightCycler480ⅡrealtimePCR仪分析其CT值。以Tublin为内参,以野生型小麦陇春23中的TaNAC2基因的相对表达量为1，T3代转TaNAC2基因小麦和转空载体小麦中的TaNAC2基因用2-ΔΔct进行相对定量。
OE1和OE2两个T3代转TaNAC2基因小麦中TaNAC2基因的检测结果如图3所示。
图3中，LC代表野生型小麦陇春23。
图3表明，与野生型小麦陇春23相比，OE1和OE2两个T3代转TaNAC2基因小麦中TaNAC2基因的表达量分别增加了8.13和3.38倍。
转空载体小麦的实验结果与野生型小麦陇春23的实验结果一致。
经过步骤(一)的DNA水平检测和步骤(二)的RNA水平检测确定OE1和OE2两个T3代转TaNAC2基因小麦构建成功。
实施例2、转TaNAC2基因小麦的表型检测
一、根系表型鉴定在水培条件下进行，具体步骤如下：
将得到的T3代转TaNAC2基因小麦(OE1和OE2)、野生型小麦陇春23的种子于23℃培养箱中萌发(自来水培养)7天后，去掉胚后分别转入高氮营养液或低氮营养液中培养。
二、步骤一的植株培养14天后，用尺子量取主根长(最长根长)，用WinRHIZO根系扫描系统分析侧根数(侧根分支数)。
结果如图4所示。图4中，LC代表野生型小麦陇春23，LN代表低氮营养液中培养结果，HN代表高氮营养液中培养结果。
图4表明，低氮培养条件下野生型小麦陇春23的平均侧根分支数为972.33个，平均最长根长为36.03cm；OE1的平均侧根分支数为1271.6个，平均最长根长为38.15cm；OE2的平均侧根分支数为1112.4个,平均最长根长为37.68cm。高氮培养条件下野生型小麦陇春23的平均侧根分支数为910.4个，平均最长根长为34.4cm；OE1的平均侧根分支数为1218.33个，平均最长根长为35.7cm；OE2的平均侧根分支数为1058.67个，平均最长根长为35.18cm。
结果表明，无论是高氮还是低氮条培养件下转TaNAC2基因小麦相对于野生型小麦陇春23的侧根数增加明显，同时最长根长也有一定的增加。
三、步骤一的植株培养7天后，硝酸根吸收速率的测定采用BIO-IM非损伤测试系统(YoungerUSA,LLC)，相关测定参数的选择参见文献“LuoJ,QinJ,HeF,etal.NetfluxesofammoniumandnitrateinassociationwithH+fluxesinfinerootsofPopuluspopularis[J].Planta,2013,237(4):919-931.”
结果如图5所示。图5中，LC代表野生型小麦陇春23，LN代表低氮营养液中培养结果，HN代表高氮营养液中培养结果。
图5表明，低氮条件下野生型小麦陇春23的硝酸根吸收速率为51.17pmol/cm-2.s-1,OE1为94.63pmol/cm-2.s-1，OE2为83.46pmol/cm-2.s-1；高氮条件下野生型小麦陇春23的硝酸根吸收速率为325.21pmol/cm-2.s-1,OE1为551.63pmol/cm-2.s-1，OE2为455.64pmol/cm-2.s-1。
图5表明，水培条件下，无论高氮还是低氮培养转TaNAC2基因小麦根系的硝酸根吸收速率都明显高于野生型小麦陇春23。
四、分蘖数及地上部干重的表型鉴定在盆栽条件下进行，具体步骤如下：
将得到的T3代转TaNAC2基因小麦(OE1和OE2)、野生型小麦陇春23在小麦春播时，23oC避光放置2天，挑选发芽一致的种子播种于含有3kg土的花盆中(高氮施肥量为100mgN/kg.土，低氮施肥量为0mgN/kg.土)于空旷地自然光条件下生长四周后，对分蘖数进行统计；之后收取地上部，105℃15min，然后70℃烘干至恒重，称量地上部干重。
分蘖数统计结果如图6所示。图6中，LC代表野生型小麦陇春23，LN代表低氮培养结果，HN代表高氮培养结果。
图6表明，盆栽低氮条件下野生型小麦陇春23的平均分蘖数为7.71个，OE1的平均分蘖数为9.83个，OE2的平均分蘖数为9.5个；盆栽高氮条件下野生型小麦陇春23的平均分蘖数为10.47个，OE1的平均分蘖数为10.83个，OE2的平均分蘖数为10.58个。
图6表明，在低氮条件下转TaNAC2基因植株的苗期分蘖数明显高于野生型小麦陇春23。
地上部干重结果如图7所示。图7中，LC代表野生型小麦陇春23，LN代表低氮培养结果，HN代表高氮培养结果。
图7表明，盆栽低氮条件下野生型小麦陇春23的平均地上部干重为0.64克,OE1的平均地上部干重为0.73克,OE2的平均地上部干重为0.69克；盆栽高氮条件下野生型小麦陇春23的平均地上部干重为0.81克,OE1的平均地上部干重为0.96克,OE2的平均地上部干重为0.93克。
图7表明，在高、低氮条件下转TaNAC2基因植株的苗期长势优于野生型小麦陇春23，苗期地上部生物量明显高于野生型小麦陇春23。
五、单株籽粒产量的测定是在大田条件下，种植地为北京昌平，具体步骤如下：
在每个小区中将得到的T3代转TaNAC2基因小麦(OE1和OE2)、野生型小麦陇春23分别播种3行，4个重复，行长1.5m，株距5cm的种植条件下测定单株籽粒产量，分为低氮培养和高氮培养两种条件。其中低氮为不施氮肥，高氮为15kgN/亩的氮肥施用量。
结果如图8所示。图8中，LC代表野生型小麦陇春23，LN代表低氮培养结果，HN代表高氮培养结果。
图8表明，大田低氮条件下野生型小麦陇春23的平均单株籽粒产量为12.0克，OE1的平均单株籽粒产量为13.2克，OE2的平均单株籽粒产量为12.8克；大田高氮条件下LC的平均单株籽粒产量为14.0克，OE1的平均单株籽粒产量为16.4克，OE2的平均单株籽粒产量为14.7克。
结果表明，在高、低氮条件下转TaNAC2基因小麦与野生型小麦陇春23相比单株籽粒产量都明显增加。
六、氮含量的测定
(一)植株氮含量的测定
将得到的T3代转TaNAC2基因小麦(OE1和OE2)、野生型小麦陇春23的种子于23℃培养箱中萌发(自来水培养)7天后，去掉胚后分别转入高氮营养液或低氮营养液中培养14天后，用万分之一天平称取苗期T3代转TaNAC2基因小麦(OE1和OE2)、野生型小麦陇春23样品(旋风磨粉碎)0.3～0.5g装入100mL开氏瓶或消煮管的底部，加浓H2SO45mL，摇匀(最好放置过夜)，在电炉或消煮炉上先小火加热，待H2SO4发白烟后再升高温度，当溶液呈均匀的棕黑色时取下。稍冷后加10滴30％的H2O2，再加热至微沸，消煮约7～l0min，稍冷后重复加30％的H2O2，再消煮。如此重复数次，每次添加的H2O2应逐次减少，消煮至溶液呈无色或清亮后，再加热约10min，除去剩余的H2O2。取下冷却至室温后定容。氮含量的测定采用Novozamsky等的靛酚兰比色的方法，具体参考文献“NovozamskyI,EckRvan,SchouwenburgJCvan,etal.Totalnitrogendeterminationinplantmaterialbymeansoftheindophenol-bluemethod[J].NetherlandsJournalofAgriculturalScience,1974,22(1):3-5”。
结果如图9所示。图9中，LC代表野生型小麦陇春23，LN代表低氮培养结果，HN代表高氮培养结果。
图9表明，水培低氮条件下野生型小麦陇春23的平均单株总N含量为68.77mg，ＯE1为94.21mg，ＯE2为80.42mg；水培高氮条件下野生型小麦陇春23的平均单株总N含量为109.63mg，OE1为134.39mg，ＯE2为133.67mg。
结果表明，转TaNAC2基因小麦苗期总氮含量高于野生型小麦陇春23。
(二)籽粒氮浓度的测定
获取步骤五得到的T3代转TaNAC2基因小麦(OE1和OE2)、野生型小麦陇春整个生育期108天后的籽粒，进行氮含量的测定，方法同步骤(一)。
结果如图10所示。图10中，LC代表野生型小麦陇春23，LN代表低氮培养结果，HN代表高氮培养结果。
图10表明，大田低氮条件下野生型小麦陇春23的籽粒氮浓度为2.28％，OE1为2.51％，OE2为2.37％；大田高氮条件下野生型小麦陇春23的籽粒氮浓度为2.47％，OE1为2.54％，OE2为2.63％。
结果表明，转TaNAC2基因小麦籽粒的氮浓度明显高于野生型小麦陇春23。
(三)氮素收获指数的测定
氮素收获指数是衡量植物氮素利用效率的重要生理指标，其中氮素收获指数＝籽粒中的氮含量/地上部总氮含量，氮素收获指数高表明其氮素的利用效率高，有利于节约肥料，提高经济效益，减少环境污染。
获取步骤五得到的T3代转TaNAC2基因小麦(OE1和OE2)、野生型小麦陇春整个生育期108天后的籽粒以及地上部，进行氮含量的测定，方法如步骤(一)。
结果如图11所示。图11中，LC代表野生型小麦陇春23，LN代表低氮培养结果，HN代表高氮培养结果。
图11表明，大田低氮条件下野生型小麦陇春23的氮素利用效率为83.49％，OE1为88.46％，OE2为87.97％；大田高氮条件下野生型小麦陇春23的氮素利用效率为75.91％，OE1为84.09％，OE2为83.60％。
结果表明，转TaNAC2基因小麦的氮素收获指数明显高于野生型小麦陇春23。

Claims (10)

1.一种提高植物氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率的方法，包括如下步骤：将SEQIDNo.4所示的蛋白的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率提高；所述植物为小麦。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过重组载体导入的，所述重组载体是将SEQIDNo.3所示的DNA分子插入改造后的pACH25的BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点间，替换改造后的pACH25的GUS基因序列得到的；
所述改造后的pACH25是将Ubiquitin启动子插入pACH25载体的PstⅠ酶切位点间得到；
所述将SEQIDNo.4所示的蛋白的编码基因导入出发植物的方法为基因枪介导转化的方法；
所述编码基因的核苷酸序列具体如SEQIDNo.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示。
3.如下任一所述的物质在提高植物氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率中的应用：
（1）SEQIDNo.4所示的蛋白；
（2）SEQIDNo.4所示蛋白的编码基因；
（3）含有（2）所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述植物为小麦。
4.如下任一所述的物质在提高植物籽粒产量中的应用：
（1）SEQIDNo.4所示的蛋白；
（2）SEQIDNo.4所示蛋白的编码基因；
（3）含有（2）所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述植物为小麦。
5.如下任一所述的物质在提高植物硝酸根吸收速率中的应用：
（1）SEQIDNo.4所示的蛋白；
（2）SEQIDNo.4所示蛋白的编码基因；
（3）含有（2）所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述植物为小麦。
6.如下任一所述的物质在提高植物分蘖数中的应用：
（1）SEQIDNo.4所示的蛋白；
（2）SEQIDNo.4所示蛋白的编码基因；
（3）含有（2）所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述植物为小麦。
7.如下任一所述的物质在提高植物地上部分干重中的应用：
（1）SEQIDNo.4所示的蛋白；
（2）SEQIDNo.4所示蛋白的编码基因；
（3）含有（2）所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述植物为小麦。
8.如下任一所述的物质在提高植物植株中氮含量中的应用：
（1）SEQIDNo.4所示的蛋白；
（2）SEQIDNo.4所示蛋白的编码基因；
（3）含有（2）所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述植物为小麦。
9.如下任一所述的物质在提高植物籽粒中氮浓度中的应用：
（1）SEQIDNo.4所示的蛋白；
（2）SEQIDNo.4所示蛋白的编码基因；
（3）含有（2）所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述植物为小麦。
10.根据权利要求4-9任一所述的应用，其特征在于：
所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示。
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