CN104000737B - 一种组织工程化牙髓‑牙本质复合体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种组织工程化牙髓‑牙本质复合体，所述组织工程化牙髓‑牙本质复合体由PDGF‑BB基因修饰的牙髓干细胞构建，通过以下方法制备获得：(1)PDGF‑BB基因转染体外分离培养的牙髓干细胞；(2)将步骤(1)得到的产物负载于生物支架材料构建组织工程化牙髓‑牙本质复合体。本发明的优点在于：PDGF‑BB不仅可以促进牙髓干细胞的增殖、成牙分化以及成血管诱导因子的分泌，还可以促进干细胞的募集以加速牙再生，在裸鼠皮下异位成牙模型中，PDGF‑BB修饰牙髓干细胞的实验组中新生的牙本质量明显增多。本发明验证了PDGF‑BB修饰牙髓干细胞在牙髓‑牙本质复合体再生的应用优势，为牙再生这一难题提供了新的治疗方法。
Description
技术领域
本发明涉及牙再生领域，具体地说，涉及一种PDGF-BB基因修饰的牙髓干细胞构建组织工程化牙髓-牙本质复合体。
背景技术
不可复性牙髓炎是临床上的常见病和多发病，目前根管治疗是该疾病的常规治疗方法，但是牙髓组织的彻底清除将严重影响牙齿的营养供应和正常的代谢活动，牙齿脆性加大而容易折裂。幸运的是，以干细胞为基础的牙髓-牙本质再生技术应运而生。从脱落乳牙、正畸拔牙和阻生智齿等牙齿中分离的牙髓干细胞为牙髓-牙本质再生提供了理想的种子细胞。然而，牙髓腔主要通过狭窄的根管-根尖孔与自体组织相连通，这也是牙髓腔营养供应的主要通道，该生理解剖特点给牙髓-牙本质再生带来了极大困难，另外，牙髓干细胞本身的成牙本质能力还有待提高，有报道通过基因修饰的手段有望改善牙髓-牙本质再生效果，但尚未寻得理想的修饰基因。
PDGF-BB作为强有力的促有丝分裂因子，是伤口愈合和组织修复过程中的主要调控蛋白；PDGF-BB是一个多功能诱导因子，除了促增殖作用外，它还具有明显的血管化诱导作用、促进牙周组织和骨再生的作用以及强大的干细胞募集能力。为此，通过PDGF-BB基因修饰的途径提高牙髓干细胞的增殖、成牙分化、成血管诱导以及干细胞募集等能力将有助于提高牙再生效果。该方面研究尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PDGF-BB基因修饰的牙髓干细胞构建组织工程化牙髓-牙本质复合体。
本发明的第二个目的在于提供一种PDGF-BB基因修饰的牙髓干细胞构建组织工程化牙髓-牙本质复合体的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供PDGF-BB基因修饰牙髓干细胞在构建组织工程化牙髓-牙本质复合体中的应用。
为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种组织工程化牙髓-牙本质复合体，其特征在于，所述组织工程化牙髓-牙本质复合体由PDGF-BB基因修饰的牙髓干细胞构建，通过以下方法制备获得：
(1)PDGF-BB基因转染体外分离培养的牙髓干细胞；
(2)将步骤(1)得到的产物负载于生物支架材料构建组织工程化牙髓-牙本质复合体。
作为一个优选方案，步骤(1)中使用慢病毒介导PDGF-BB基因的转染。使用慢病毒介导PDGF-BB的转染，可以维持PDGF-BB的长期高效表达，也规避了蛋白使用所遇到的价格昂贵、无法维持长期作用效果等弊端。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：一种组织工程化牙髓-牙本质复合体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)PDGF-BB基因转染体外分离培养的牙髓干细胞；
(2)将步骤(1)得到的产物负载于生物支架材料构建组织工程化牙髓-牙本质复合体。
作为一个优选方案，步骤(1)中使用慢病毒介导PDGF-BB基因的转染。
为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：PDGF-BB基因修饰牙髓干细胞在构建组织工程化牙髓-牙本质复合体中的应用。
本发明的优点在于：使用PDGF-BB转染牙髓干细胞，不仅明显促进了细胞的增殖，使得在更短的时间内获得足够数量的种子细胞，PDGF-BB还促进了牙髓干细胞的成牙分化，增强了细胞的成牙能力，PDGF-BB转染的牙髓干细胞可以分泌更多的成血管诱导因子，对于快速恢复牙髓腔内的营养供应至关重要，同时PDGF-BB还可以募集更多的干细胞以更好更快地促进牙再生。另外，使用慢病毒介导PDGF-BB的转染，可以维持PDGF-BB的长期高效表达，也规避了蛋白使用所遇到的价格昂贵、无法维持长期作用效果等弊端。本发明验证了PDGF-BB修饰牙髓干细胞在牙髓-牙本质复合体再生中的应用优势，为牙再生这一难题提供了新的治疗方法。
附图说明
图1为人牙髓干细胞的培养与鉴定。(A-D)牙髓组织的取出以及长梭形的牙髓干细胞从组织块中爬出；(E)流式细胞仪鉴定人牙髓干细胞表面干细胞标志物的表达情况；(F)人牙髓干细胞成脂诱导分化，油红O染色；(G)人牙髓干细胞成软骨诱导分化，阿利新蓝染色；(H)人牙髓干细胞成骨诱导分化，茜素红染色。
图2为Lenti-PDGF对人牙髓干细胞转染情况。(A)转染后3天，荧光显微镜下观察绿色荧光表达；(B)流式细胞仪检测Lenti-PDGF的转染效率；(C)细胞转染Lenti-PDGF后的增殖情况；(D)免疫荧光检测细胞内PDGF的表达情况；(E)RT-PCR检测细胞转染Lenti-PDGF后PDGF-BB基因表达情况；(F)Western Blot检测细胞转染Lenti-PDGF后PDGF-BB蛋白表达情况；(G)Elisa检测细胞转染Lenti-PDGF后分泌PDGF-BB蛋白情况(**p<0.01)。
图3为Lenti-PDGF促进人牙髓干细胞的成牙分化情况。(A)细胞在转染Lenti-PDGF后3、7、14和21天时的VEGF、OCN、DMP-1和DSPP基因表达情况；(B)细胞在转染Lenti-PDGF后3、7、14和21天时的VEGF和DSPP蛋白表达水平；(C)Western Blot检测的半定量结果；(D)细胞在转染Lenti-PDGF后7和14时的ALP染色和半定量结果(**p<0.01)。
图4为PDGF的体外募集能力检测。(A)PDGF-BB激活PI3K/Akt信号通路；(B)LY294002可以抑制PDGF-BB激活PI3K/Akt信号通路；(C)Transwell小室细胞迁移情况；(D)细胞计数结果(**p<0.01)。
图5为人牙髓干细胞体内募集实验。“DAPI”所示经DAPI染料标记的细胞核；“Dil”所示经CM-Dil染料标记的人牙髓干细胞，即所募集的细胞。
图6为异位成牙的组织学和免疫组化检测结果。(A-D)HE染色结果；(E)新生矿化组织百分比；(F-H)新生矿化组织免疫组织化学检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.PDGF-BB对人牙髓干细胞(hDPSCs)体外生物活性的影响
步骤一、人牙髓干细胞的分离培养及鉴定
临床收集正畸需求或阻生齿拔除牙齿，用无菌生理盐水将离体牙齿表面的血冲洗干净；用牙科裂钻在牙齿颈部切割一圈，便于牙髓腔的暴露；用拔髓针轻轻将牙髓组织取出，操作轻柔，尽量避免损伤组织；将取出的牙髓组织用PBS冲洗两次，用无菌眼科剪将其剪至约1×1mm大小的组织块，用消毒盖玻片将组织块覆盖，防止组织块漂浮。然后加入含20％胎牛血清的DMEM培养液进行培养。每三天半量换液。待hDPSCs从组织块爬出至60％-80％融合时，胰蛋白酶消化，1:1传代培养。传代后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液进行培养。采用流式细胞术检测P3代hDPSCs表面抗原CD31，CD34，CD90，CD105分子。红色荧光(PE)标记CD31，CD105，及CD34，绿色荧光(FITC)标记CD90。并进一步进行成骨、成软骨和成脂三向分化鉴定。
实验结果见图1，牙髓组织块培养约7天左右，成功从牙髓组织爬出，原代牙髓干细胞形态类似成纤维细胞，呈长梭形(图1D)。P3代收集后进行流式检测，结果显示hDPSCs几乎不表达造血系统所特有的标记物CD31，CD34,表达率分别仅为3.6％，3.1％。而间充质干细胞所特有的表面标记物CD90及CD105表达率分别高达71.9％，96.4％(图1E)。在不同的诱导培养条件下，hDPSCs可以向脂肪细胞，软骨细胞，成骨细胞方向分化(图1F-H)。
步骤二、人牙髓干细胞转染PDGF-BB慢病毒颗粒(Lenti-PDGF)
(1)利用Gateway技术构建pLV.EX3d.P/puro-EF1A>PDGFB>IRES/eGFP及pLV.EX3d.P/puro-EF1A>Lacz>IRES/eGFP慢病毒载体，转染293FT细胞制取病毒液。转染后24h换液，48h后收集培养上清进行浓缩。换液后继续培养，72h后再次收集浓缩。将收集的病毒分装置于-80℃保存、备用。
(2)P2代hDPSCs接种在10cm培养皿或六孔板中，培养24小时候后，融合度达70％-80％细胞状态良好。将病毒液(5×107TU/ml)加入培养液中，37℃，5％CO2条件下培养培养过夜。第二天吸去原有培养液，加入新鲜10％FBS的DMEM培养液。转染第三天后，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，收集细胞，流式细胞仪检测细胞转染效率。
(3)免疫荧光检测PDGF-BB基因的表达。病毒转染72h后，4％多聚甲醛固定15min，Triton X-100处理细胞30min，10％山羊血清封闭1小时，PBS清洗3次。PDGF-BB(1:200)一抗孵育4℃过夜，然后孵育红色荧光二抗，37℃，1h。DAPI处理细胞核5分钟，PBS洗3次。荧光显微镜下观察。
(4)Real-time PCR检测PDGF-BB的表达。病毒转染后，在3,7,14,21天利用Trizol试剂分别收集各组样品的总RNA，检测PDGF-BB基因的表达情况。
(5)Western Blot检测PDGF-BB的表达。病毒转染后，在3,7,14,21天不同时间点收集细胞总蛋白，检测PDGF-BB蛋白的表达情况。
(6)酶联免疫法(Elisa)检测细胞外分泌的PDGF-BB。病毒转染后，于3,7,14,21天收集细胞培养上清，采用酶联免疫法(Elisa)检测上清中PDGF-BB蛋白的含量。
实验结果见图2，Lenti-PDGF和Lenti-LacZ(对照组)病毒转染hDPSCs后，第三天荧光显微镜下观察到绿色荧光表达(图2A)；流式细胞仪检测病毒转染效率，结果显示转染效率高达80％以上(图2B)。免疫荧光观察结果提示Lenti-PDGF组PDGF-BB表达上升明显(图2D)。病毒转染后，Real-time PCR检测hDPSCs中PDGF-BB基因的表达，病毒转染后，于3,7,14,21天不同时间点，提取细胞RNA检测PDGF-BB的表达，结果显示病毒转染后，PDGF-BB能够持续稳定的表达(图2E)。为了进一步在蛋白表达水平验证PDGF-BB的表达，于转染后3，7，14，21天提取细胞蛋白质检测其表达，结果证明病毒转染后，PDGF-BB蛋白水平也呈现稳定高表达(图2F)。Elisa检测细胞上清中PDGF-BB的含量，证明PDGF-BB基因转染牙髓干细胞后，牙髓干细胞能够持续分泌PDGF-BB蛋白因子(图2G)。
步骤三、PDGF-BB促进人牙髓干细胞的增殖
Lenti-PDGF转染的hDPSCs以5×103/孔的细胞密度接种于96孔板中，于37℃、5％CO2培养箱培养。接种后1、3、5、7天不同时间点检测细胞增殖情况。检测时，毎孔加入20μlMTT液，孵育4小时后吸去板内原有液体，毎孔加入200μl二甲基亚砜(DMSO),振荡15min，使结晶充分溶解。酶标仪OD490nm检测吸光度值，分析细胞增殖情况。
结果显示hDPSCs过表达PDGF-BB能够促进其增殖活性(图2b)。第1天，三组吸光度没有明显差异，在第3、5、7天时，Lenti-PDGF组吸光度值明显高于Lenti-LacZ与Control(即未转染病毒的hDPDCs)两对照组。说明Lenti-PDGF病毒转染后，能够促进hDPSCs的增殖。
步骤四、PDGF-BB促进人牙髓干细胞的分化
(1)Real-time PCR检测成血管/成牙相关基因的表达
病毒转染后，在3、7、14、21天利用Trizol试剂分别收集各组样品的总RNA,检测相关基因的表达。紫外分光光度计260nm和280nm下测定提取RNA的浓度及纯度，根据逆转录试剂盒说明，合成cDNA。之后进行PCR检测牙本质基质蛋白(dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)相关基因的表达。以管家基因磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为内参。引物序列见下表，CT值代表Real-time PCR结果。最后根据公式：2-△△CT计算出基因的相对表达量。
(2)Western Blot检测
病毒转染后，在3、7、14、21天不同时间点收集各组细胞蛋白质，进一步使用Western Blot方法检测DSPP,VEGF蛋白的表达，并进行定量测量。
(3)ALP染色和半定量检测
病毒转染后，以2×104/ml的细胞密度接种在24孔板，于37℃、，5％CO2培养箱培养，第7和14天分别进行ALP染色及半定量检测。
实验结果见图3，Lenti-PDGF病毒转染后，hDPSCs的VEG、OCN、DMP-1和DSPP的mRNA表达水平随时间延长明显上升，显著性高于Control组及Lenti-LacZ组(图3A)；WesternBlot结果进一步验证了VEGF和DSPP的蛋白表达水平，同样随时间延长明显上升，并且显著性高于Control组及Lenti-LacZ组(图3B和C)；最后还检测了细胞的ALP表达情况，ALP参与了矿化的早期调控过程，染色和半定量结果均提示：在Lenti-PDGF转染后，hDPSCs的ALP活性明显提高(图3D)。
步骤五、人牙髓干细胞分泌PDGF-BB的体外干细胞募集能力验证
(1)Western Blot检测PI3K/Akt信号通路
为了检测PDGF-BB是否通过激活hDPSCs的PI3K/Akt信号通路来促进牙髓干细胞的迁移，收集Lenti-PDGF转染hDPSCs的上清(步骤二中Elisa实验结果已证实Lenti-PDGF转染后，hDPSCs的PDGF-BB蛋白分泌水平显著性提高)，及PDGF-BB蛋白作于hDPSCs后，WesternBlot检测PI3K/Akt信号通路是否被激活。为了进一步验证PI3K/Akt信号通路是否被激活，采用LY294002(10μM)预处理hDPSCs。
(2)Transwell细胞迁移实验
为检测PDGF-BB对牙髓干细胞的体外募集作用，采用transwell小室细胞迁移实验模型检测PDGF-BB对牙髓干细胞的趋化作用。具体步骤如下：①胰酶消化细胞后，离心制备细胞悬液，2×104个细胞100μl培养液加入transwell小室上层，transwell小室下层按照分组分别加入以下液体：(a)DMEM；(b)DMEM+PDGF-BB(5ng/ml)；(c)Lenti-LacZ转染细胞培养上清及(d)Lenti-LPDGF转染细胞培养上清，为了抑制PI3K/Akt信号通路，细胞提前用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002(10μM)作用30min；②37℃，5％CO2条件下培养20h；③将transwell小室取出，4％多聚甲醛室温固定15min，PBS冲洗3次；④苏木素染色20min，染色完成后，用PBS冲洗，去除多余染料；⑤用湿棉签将小室上层未迁移细胞去除，镜下观察迁移至小室底部的细胞。每个小室在一百倍视野下随机选择6个视野，计算细胞的迁移个数。
实验结果见图4，Lenti-PDGF转染的hDPSCs细胞培养上清和rhPDGF-BB蛋白一样作用于hDPSCs后，可以激活PI3K/Akt信号通路，p-AKT表达量明显上升(图4A)，而这一激活作用可以被Akt通路特异性抑制剂LY294002所抑制(图4B)；体外采用transwell小室进行细胞募集能力检测，可见Lenti-PDGF上清组及DMEM+rhPDGF-BB蛋白组有更多的hDPSCs迁移至transwell小室底部，证明PDGF-BB是hDPSCs的强烈趋化因子(图4C)；而加入PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002可以明显抑制PDGF-BB对hDPSCs的趋化作用，说明PDGF-BB是通过激活PI3K/Akt信号通路来促进hDPSCs的迁移(图4D)。
实施例2.PDGF-BB基因修饰人牙髓干细胞(hDPSCs)的体内干细胞募集效果以及牙髓-牙本质复合体异位再生能力
步骤一、人牙髓干细胞的裸鼠体内募集实验
(1)采用CM-DiI染料标记hDPSCs细胞膜，染液的浓度为1μg/mL。具体步骤如下：①胰酶消化细胞，离心1000转/min,5min；②弃上清，加入1mlDMEM培养液，将细胞重悬，加入5μl的CM-DiI染液，37℃孵育5min，然后4℃孵育15min；③最后再次离心，PBS洗涤两次以去除染液。
(2)取P3代hDPSCs，转染Lenti-PDGF及Lenti-LacZ病毒，当细胞融合度达90％以上时，胰酶消化，收集各组细胞，制备成细胞悬液，终浓度为2×107个/ml，接种于多孔CPC支架材料上(直径5mm，厚度2-3mm)，按照以下分组埋植于裸鼠皮下：①单纯CPC组，②hDPSCs/CPC组，③Lenti-PDGF转染hDPSCs/CPC组，④Lenti-LacZ转染hDPSCs/CPC组。待上述细胞材料复合物植入裸鼠皮下一周后，收集上述CM-DiI标记的hDPSCs，约106个细胞重悬于250μl培养液中，注射于埋植材料附近的裸鼠背部皮下。待细胞注射一周后取出埋植材料，10％中性福尔马林固定，EDTA脱钙，石蜡包埋切片，DAPI染核，荧光显微镜下观察标记细胞的体内迁移情况。
实验结果见图5，免疫荧光显微镜下观察，可见更多的CM-DiI标记的hDPSCs迁移至PDGF基因修饰的hDPSCs/CPC复合物植入处，这可能是PDGF基因修饰的hDPSCs分泌的PDGF-BB蛋白促进了体内注射的CM-DiI标记的hDPSCs的定向迁移。
步骤二、裸鼠皮下异位成牙实验
(1)取P3代hDPSCs转染Lenti-PDGF及Lenti-LacZ病毒，当细胞融合度达90％以上时，胰酶消化，收集各组细胞，制备成细胞悬液，终浓度为2×107个/ml，接种于多孔CPC支架材料上(直径5mm，厚度2-3mm)，按照以下分组埋植于裸鼠皮下：①单纯CPC组，②hDPSCs/CPC组，③Lenti-PDGF转染hDPSCs/CPC组，④Lenti-LacZ转染hDPSCs/CPC组。待体内植入12周后取材，10％中性福尔马林固定，EDTA脱钙，石蜡包埋，切片，行苏木素-伊红(HE)染色，镜下观察组织再生情况，并使用Image Pro5.0system软件进行新生牙本质组织面积测量。进一步进行DSPP免疫组化验证新生硬组织为牙本质。
实验结果见图6，HE染色镜下观察可见：除CPC组外(仅有纤维结缔组织形成)，各组均有牙髓-牙本质样组织形成，成牙本质样细胞围绕在新形成的牙本质样组织周围，矿化的牙本质着色较深，在其深层是前期牙本质样组织，富含血管的牙髓样结缔组织被矿化的牙本质样组织包围，其中Lenti-PDGF组中新生的牙髓-牙本质复合体组织最多(图6A-D)。组织形态学分析不同组别新生牙本质组织面积百分比如下：DPSCs/CPC组为9.88±1.58％，Lenti-LacZ/CPC组为10.16±1.78％，Lenti-PDGF/CPC组为19.92±2.71％(显著高于其它各组，p<0.01，图6E)。免疫组化结果显示：新生牙本质及牙髓样细胞DSPP染色呈阳性，与正常牙体组织染色结果相似(骨组织DSPP着色较浅，没有明显变化，图6F-H)。
本发明对PDGF-BB转染牙髓干细胞后增殖、成牙分化、成血管诱导蛋白的分泌以及干细胞募集能力等生物活性进行了检测；并在体内裸鼠皮下异位成牙模型上，检测了PDGF-BB转染牙髓干细胞对干细胞的体内募集能力以及牙髓-牙本质复合体的再生效果。研究结果表明：(1)PDGF-BB转染牙髓干细胞后明显促进了细胞的增殖能力；(2)PDGF-BB转染牙髓干细胞后明显促进了细胞成牙分化，DMP-1、DSPP和OCN等成牙相关指标显著增高；(3)PDGF-BB转染牙髓干细胞后明显促进了细胞对成血管诱导因子VEGF的分泌；(4)PDGF-BB转染牙髓干细胞后明显促进了细胞对牙髓干细胞的体内外募集能力，并证实通过PI3K/Akt通路实现；(5)PDGF-BB转染牙髓干细胞明显促进了体内牙髓-牙本质复合体的再生。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.组织工程化牙髓-牙本质复合体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)PDGF-BB基因转染体外分离培养的牙髓干细胞；
(2)将步骤(1)得到的产物负载于生物支架材料构建组织工程化牙髓-牙本质复合体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中使用慢病毒介导PDGF-BB基因的转染。
3.PDGF-BB基因修饰牙髓干细胞在制备构建组织工程化牙髓-牙本质复合体中的应用。
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