CN103988067A - 用于传感器校准的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的量的方法，其特征在于，所述确定包括以下步骤：a)在一个单一的波长或在一个以上的波长，确定与所述探针的吸光度相关的物理被测量(xi)，b)关联所述被测量的值与分别结合到所述表面或从所述表面释放的所述光学探针物种的量，其中，步骤a)的所述物理被测量(xi)是其中来自折射率的贡献实质上为零的物理被测量。本发明还提供了峰值宽度的不同用途以及用于所公开的方法的计算机程序产品和试剂盒。

Description

用于传感器校准的方法
技术领域
本发明涉及用于探测结合到或从光学传感器或生物传感器表面释放的化学物种的量或浓度类型的方法的改进。
背景技术
采用化学传感器和生物传感器是历史悠久的。这种传感器通常由两种可区别的元件构成。一种元件提供传感器的化学选择性或生物化学选择性；此元件通常由附着于固体表面上的选择性的层构成。选择性可以通过例如有选择性地吸收的基质、螯合剂、抗体、选择性地结合的蛋白质、核酸链或受体提供。所感兴趣的样品中的分析物的测定通常涉及分析物分别结合到选择层或从选择层释放，或分析物影响其它一些物质结合到选择层或从选择层释放。第二元件分别提供对物质结合到传感器表面或从传感器表面释放的监测。
传感器的一个重要类别是基于结合事件的光学监测；这种传感器称为光学传感器。光学读出机制可基于如吸光度、荧光或折射率的变化。许多这样的传感器基于内部反射的现象；例如，这种传感器可基于表面等离子谐振(SPR)、受抑全内反射、光波导、临界角折射法(refractormetry)、干涉折射法、双偏振干涉法以及其他方法。下面的讨论主要集中在SPR传感器，但是，由于其对本领域技术人员是明显的，讨论的许多方面一般也适用于其它类型的光学传感器且特别是基于内部反射的传感器。
此外，存在SPR传感器的两个主要类别。一种是基于读出对应于在限定的波长的谐振的特定角度；另一种是基于读出对应于在限定的角度的谐振的特定波长。还存在混合型变体，其中角度和波长都是变化的。下面的讨论集中在使用角度读数的SPR传感器。此外，为了简单起见，讨论主要集中在所谓的克莱舒曼SPR配置，但讨论也可适用于其它的配置，例如奥托配置和涉及光栅和波导的不同配置。
利用SPR传感器是历史悠久的(如见L.MLechuga,“OpticalBiosensors”,第5章“BiosensorsandModernBiospecificAnalyticalTechniques”,L.Gorton(ed.)Elsevier,Amsterdam,2005；J.Homola,Chem.Rev.2008,108,462)。一般情况下，不同的物质可实时分析，而无需使用附着到分析物的任何标签。灵敏度对于许多用途是足够的，鲁棒性也是一样。然而，也众所周知的是，在某些应用中使用SPR传感器是有问题的，且SPR传感器的性能对于某些用途可能是不足够的。例如，SPR传感器的灵敏度是有限的，并且可能不足以用于小分子的分析。另一个问题可能是当不使用标记进行读数时的普遍性质；SPR没有用于在分析物的结合和任何其他物质的结合之间进行区分的内在机制。特别成问题的是蛋白质和与生物化学源性样品关联的其它或多或少明确定义的物质的所谓的“非特异性结合”。第三个问题是许多噪声源的影响，像例如温度变化、机械振动、及与传感器表面接触的介质的组成的虚假变化。作为这些问题的结果，定量分析和传感器校准可能表现出SPR传感器的不足的准确度和精度。
SPR传感器通常用于测量折射率，即样品介质的复数折射率的实部。然而，众所周知的是，由于光的吸收影响SPR曲线的形状，SPR传感器也可以用于间接测量吸光度(更正确的术语是消光系数，但在这里使用术语吸光度，因为它更容易理解)，即复数折射率的虚部。还可以从SPR测量中扣除传感器表面的吸附物的厚度。这三个参数的测量在以下文献中作了讨论：例如，H.Kano和S.Kawata，应用光学.1994,33,5166；S.R.Karlsen等人,Sens.ActuatorsB1995,24-25,747；Z.Salamon等人,Biochim.Biophys.Acta1997,1331,117；A.A.Kolomenskii等人,应用光学.2000,39,3314；S.Wang等人,Rev.Sci.Instr.2001,72,3055；和S.Ekgasit等人,Sens.ActuatorsB2005,105,532。
SPR传感器也已被应用到监测显色反应，即伴随有颜色变化的化学反应。一些实例是由Y.Hur等人在分析化学，Acta2002，460，133中报告的银离子检测和由P.Uznanski和J.Pecherz在J.Appl.Pol.Sci.2002,86,1459中报告的氢离子检测，然而，显色反应代表一种特殊的情况，这是由于化学物种简单结合到固体表面一般本质上不伴有颜色变化。
已经做出了许多尝试来提高SPR传感器的性能。在US5,573,956中描述了使用折射率增强物质如何可以改善SPR测定的灵敏度。类似的方法后来由H.Komatsu等人在Sci.Tech.Adv.Mater.2006,7,150及由M.Nakkach等人在应用光学.2008,47,6177中提出。在US5,641,640中描述了在多个波长下的折射率测量如何可以提高灵敏度和减少一些噪声源。类似的方法后来由O.Esteban等人在光学快报.2006,31,3089中讨论。在JP11118802中讨论了低浓度和低分子量的样品如何可通过使用波长等于所述样品或结合到其上的颜料的吸收波长的光来确定。在WO02073171简要指出，样品的吸光度可以通过SPR曲线的形状(反射率和最小倾角宽度)的变化来测量。在JP2002090291讨论了通过利用含有通过捕获小分子物质改变其光吸收特性的物质的感测层；即通过使用显色指示剂，SPR传感器如何可以检测比如离子的小分子物质。在JP2002357536中指出了吸收光的物质可用于以类似于上面提到的US5,573,956和US5,641,640的方式提高SPR测定的灵敏度。它也类似于上述WO02073171中的方式，指出吸光物质可以改变SPR曲线的形状。在JP2003215029中讨论了用于测量表面等离子体谐振和光吸收谱的装置；应当注意的是，该装置利用了波长读数，而不是角度读数，因此在该文献中没有讨论角度读数SPR曲线的形状。
发明内容
如上面所讨论的，已经进行了一些尝试以通过利用其作为吸光度传感器的能力来改善SPR传感器的性能。然而，一个问题是，依赖于吸光度的大部分物理被测量，例如像在某种宽泛的意义上定义的SPR峰值宽度，也在较小或较大的程度上依赖于折射率。因此，上述测量吸光度的尝试一般得到混合的吸光度和折射率信号。以前没有认识到，通过确定与吸光度相关的多个物理被测量，并选择来自折射率的贡献对其来说是最小的一个物理被测量，可以得到对吸光度更纯和更准确地进行估计的方法。也没有认识到这样的选择程序可以改进用于确定结合到光学探针表面或从光学探针表面释放的光学探针物种的量的方法。本发明提供了这种改进的方法和程序。
作为本发明的第一方面，提供了确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的量的方法，其特征在于，所述确定包括以下步骤：
a)在一个单一的波长或在一个以上的波长，确定与所述探针的吸光度相关的物理被测量(xi)，
b)关联所述被测量的值与分别结合到所述表面或从所述表面释放的所述光学探针物种的量，
其中，步骤a)的所述物理被测量(xi)是其中来自折射率的贡献实质上为零的物理被测量。
本发明基于这样的洞察，即如何使用来自其中来自折射率的贡献实质上为零的物理被测量的信息来校准和减少光学传感器中的噪声及用于量化结合到传感器的光学探针的量。本文公开了总的发明构思的几个方面和配置。表述“光学探针”用来表示结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的物种，并且其可被传感器检测到，并且其在至少一个测量波长具有可检测的吸光度。在分析物本身满足这些条件的情况下，它本身可以用作光学探针。光学探针也可能具有荧光性质。然而，在大多数情况下，光学探针被用来以一种更间接的方式确定分析物的数量或浓度；分析物可以例如分别影响光学探针结合到光学表面或从光学表面释放。实现这一点的可设想的方法包括但不限于夹心测定、竞争测定、抑制测定或置换测定。在一些可以设想的实施例中，该光学探针可用于化学标记其他一些物种；例如分析物本身可被标记，分析物的竞争或类似物种可以被标记，或例如第二抗体的一些第二类或第三类试剂可以被标记。
光学探针的光学特性由它的复数折射率描述。缩短的术语“折射率”用来表示更严谨的术语“复数折射率的实部”。术语“消光系数”与“吸光度”用来表示“复数折射率的虚部”。复数折射率在严格意义上是光学连续体的特性；在讨论例如像分子的离散化学物种例的特性时，诸如“摩尔折射率增量”和“吸光率”的术语可以被使用，因为它们可能会更容易理解。光学连续体的特性和离散物种的光学特性之间的区别和关系对本领域技术人员而言是众所周知的。
术语“一个波长”用来表示尖锐的波长尖峰或窄波长间隔，例如可从发光二极管或激光器得到的，或从具有带通滤波器或单色器的宽带光源或发射几个波长的光源得到的。
“物理被测量”涉及物理特性，如所研究的系统的特性，其受到光学探针在传感器表面的结合或释放的影响，这也可以使用光学传感器进行测量或估计。
与吸光度相关的物理被测量可以是主要与吸光度相关的物理被测量。
任何同质材料的光学特性由消光系数ε和折射率n定义。这也适用于例如表面等离子体谐振(SPR)的情况下的样品。SPR的众所周知的将非吸光样品的谐振角Θ关联到折射率n的基本等式为
npsinΘ＝[εmn2/(εm+n2)]1/2      /A/
其中np为玻璃的折射率及εm是金属的介电常数[例如见H.Raether,Surface Plasmons on Smooth and Rough Surfaces and on Gratings,Springer,Berlin1988]：
样品的峰值宽度ΔΘ和消光系数ε的之间的关系也被很好地确立：
ΔΘ1/2＝4γ/(npcosΘ)      /B/
其中ΔΘ1/2是半峰宽度及γ是特别取决于ε和εm的因子。
[参见，例如J.Homola,ElectromagneticTheoryofSurfacePlasmonsinJ.Homola(ed.),SurfacePlasmonResonanceBasedSensors,Springer,Berlin,2006]
然而，在与理论物理的许多等式类比时，等式A和B可能在实践中不完全成立。因此，对于吸光性样品，Θ对吸光度略有依赖性，尽管比对n的依赖性要小得多。类似地，ΔΘ对n也略有依赖性，尽管比对α的依赖性要小得多。然而，光学生物传感器领域的技术人员充分理解，在知晓例如上述的等式A和B后，Θ是主要与折射率相关的被测量的实例，ΔΘ是主要与吸光度相关的被测量的实例。因此，使用当光学探针结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放时发生的现象背后的理论物理学知识，本领域技术人员能够明确地将被测量归类为“与吸光度相关”或“主要与吸光度相关”。例如，由于峰值宽度ΔΘ可以以不同的方式定义，例如定义为SPR曲线的标准偏差或在一些预定的强度值的曲线的宽度，本领域技术人员明白，这些被测量是“主要与吸光度相关的被测量”。
此外，本领域技术人员使用如等式A和B的知识，进一步理解“来自折射率的贡献实质上为零”指的是什么样的被测量。如上面所讨论的，大多数被测量可在一定程度上依赖于折射率，但“来自折射率的贡献实质上为零”的被测量对折射率的依赖性小于例如对吸光度的依赖性。
本领域技术人员可以例如改变样品的折射率并测量不同的物理被测量的响应如何变化，以便找到来自折射率的贡献实质上为零的被测量。
因此，本发明的第一方面基于这样的洞察，即测量与吸光度相关但其中来自折射率的贡献实质上为零的至少一个被测量，并在确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的量时使用该被测量(或从该被测量得到的信息)，导致受噪声较少影响的结果。
在第一方面的实施方式中，步骤a)的物理被测量通过执行以下步骤进行选择：
a1)确定与所述探针的吸光度相关的多个物理被测量xn，及
a2)从所述多个被测量中选择其中来自折射率的贡献实质上为零的被测量xi。
步骤a2)例如可以包括：从所述多个被测量中选择对折射率的依赖性最小的被测量。
在第一方面的实施方式中，光学传感器基于表面等离子体谐振(SPR)。
SPR传感器可以是使用角度读数的SPR传感器。
作为一个例子，多个被测量可与作为入射角的函数的反射光强度的SPR曲线中的峰值宽度(PW)相关。
本发明人发现，峰值宽度的定义是有利的，因为它可以提供其中来自折射率的贡献实质上为零的被测量。这在本公开的实施例中进一步示出。
因此，峰值宽度可以是SPR的感测图的“SPR倾角(SPR-dip)”的峰值宽度。例如，峰值宽度(PW)可被定义为在绝对强度的预定值的峰值宽度、在相对强度(例如表示为最大强度和最小强度之间的百分比)的预定值的峰值宽度、在所述最小强度以上的预定强度值的峰值宽度、和/或相对于在绝对或相对强度值定义的基准确定的SPR倾角的标准偏差或转动惯量。
作为一个例子，步骤a1)可包括：
对于与所述峰值宽度相关的所述物理被测量，确定在所述样品的光学特性发生变化时的所述峰值宽度的变化(ΔPW)，
并且步骤a2)可包括
从所述多个被测量中选择其中在下式中k2被最小化或比率k1/k2被最大化的至少一个被测量
ΔPW＝k1*Δε+k2*Δn，
其中Δε是在所述样品的光学特性发生变化时的吸光度的变化，及Δn为折射率的变化。
另外，在第一方面的实施方式中，步骤b)包括使用所述被测量的值区分测量噪声(N)和来自所述光学探针物种的结合或释放的信号。
表述“噪声”或“测量噪声”打算在广泛的意义上进行解释。它被用来表示对任何被测量的模糊、扰乱或干扰光学探针物种的确定的任何贡献，即不仅是被测量的短期随机变化。特别地，该术语用来表示不想要的或不受控制的温度变化、与传感器表面接触的介质的组成的虚假变化，及不想要的或不受控制的任何其它化学物种分别结合到传感器表面或从传感器表面释放。所谓的“非特异性结合”包含在“噪声”的定义中。但是应当理解的是，几个、定义的或未定义的噪声源可以同时做出贡献。不同的噪声源可以相同或不同的方式贡献于一组被测量。在大多数情况下，来自不同噪声源的贡献可以相加的方式求和。
因此，第一方面的方法在确定光学探针和传感器表面之间的相互作用时，提供了更准确的结果。
作为补充或作为替代，步骤b)可以包括以下步骤：
b1)使用物理被测量x1用于减少光学传感器中的噪声，及
b2)确定结合到表面或从表面释放的光学探针物种的量。
因此，步骤b2)的确定与如果步骤a)未被执行相比受噪声的影响更小。进一步地，在本公开中讨论步骤b)时，实施方式可涉及上面的步骤b1)。
在第一方面的实施方式中，步骤b)包括：确定被测量的至少一个函数f，即f(x1)，使得所述光学探针结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的信号-噪声比(S/N)增大。
因此，与如果不执行根据本发明的方法，也就是说，与如果未执行本文定义的步骤a)和b)相比，S/N比可增加。
本领域技术人员理解如何确定函数使得信号-噪声比增加。这可以例如通过迭代过程来执行。
作为一个例子，测量噪声(N)可源于结合到所述表面或从所述表面释放的至少一种附加的化学物种，并且步骤b)包括使用所述被测量的值区分所述光学探针物种的结合或释放与所述至少一种附加的化学物种。
本实施方式包括“非特异性结合”的情况。在这方面，与在其它方面一样，不排除几种噪声源可以以类似或不同的方式同时做出贡献。作为一个例子，无色蛋白(像例如白蛋白)到表面的非特异性结合主要贡献于与折射率相关的被测量而对与吸光度相关的被测量贡献较少，而光学探针结合将主要贡献于与吸光度相关的被测量。
作为另一个例子，测量噪声(N)通过改变附加的化学物种分别到所述光学传感器表面的结合或从所述光学传感器表面的释放已经被确定。
所述结合或释放可能已经以受控的方式被改变。
此外，测量噪声(N)可源于温度变化，并且步骤b)包括使用所述被测量的值区分所述光学探针物种的结合或释放与温度变化噪声。
温度变化主要贡献于与折射率相关的被测量。例如，水的折射率随每1℃的温度增加降低0.0001折射率单位。另一方面，温度变化对与吸光度相关的被测量的贡献显著较小，除非与光学探针表面接触的介质是强吸光性的。
作为一个例子，测量噪声(N)通过改变与光学传感器表面接触的介质的温度已经被确定。
温度可能已经以受控的方式被改变。
此外，测量噪声可源于与传感器表面接触的介质的组成变化，并且步骤b)包括使用所述被测量的值区分所述光学探针物种的结合或释放和所述组成变化。
再次，只要该组成变化是由于无色物种引起的，其影响将主要针对与折射率相关的被测量，而着色的物种还将严重影响与吸光度相关的被测量。作为一个例子，测量噪声(N)已通过改变与光学传感器表面接触的介质的组成来确定。
该组成可能已经以受控的方式已被改变且介质可以例如是缓冲液。
在第一方面的实施方式中，光学传感器的感测原理基于内部反射。
内部反射经常与化学传感器和生物传感器结合使用。内部反射光创建用于探测传感器表面及其紧邻的周围环境的渐逝波。内部反射方法的一个优点是，探测光束不必通过样品溶液，否则可能引起与光的吸收和散射相关的问题。
作为例子，光学传感器的感测原理可以基于光波导折射法、受抑全内反射、基于波导的表面等离子体谐振、光栅耦合折射法、干涉折射法或双偏振干涉法。
这些方法的共同点是它们被用来探测接近传感器表面的折射率，但是表面上或表面紧邻的附近的光的吸收也会影响测量。
如上面所讨论的，光学传感器的感测原理可以基于使用角度读数的表面等离子体谐振(SPR)。
这可能是生物传感最常用的方法。该方法还主要用于折射法，但测量也受到表面上或表面紧邻的附近的光的吸收的影响。这种影响通常被视为该方法的一个缺点，但是，如在本发明的描述中详细描述的，它也可以变成一个明显的优势。
此外，与探针的吸光度相关的至少一个被测量(x1)可从SPR曲线的最小反射率值、宽度、标准偏差、偏斜度和峰度中选择。
在第一方面的实施方式中，所述至少一个测量波长被选择为接近所述探针的最大吸光度的波长，优选在距离最大值50nm内，并且更优选在距离最大值20nm内。
发明人已经有利地发现，在接近吸光性物质的吸光最大值处，对折射率的影响小。发明人因此发现，对于第一种简化近似，该光学探针可被视为当至少一个测量波长被选择为接近探针的最大吸光度的波长时仅对与吸光度相关的被测量有贡献。
在本发明的第一方面的另一种配置中，提供了一种用于基于表面等离子体谐振(SPR)估计光学传感器中的样品的吸光度ε的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定与所述样品的吸光度ε相关的多个物理被测量(xn)；
b)从步骤a)的所述多个物理被测量(xn)选择其中来自折射率的贡献实质上为零的物理被测量xi，及
c)利用来自步骤b)的所述物理被测量xi估计所述吸光度ε。
因此，本发明的构思提供了用于分析或确定SPR传感器中的样品的吸光度的直接方法。
作为一个例子，所述多个被测量xn为与作为入射角的函数的反射光强度的SPR曲线的峰值宽度(PWi)相关的不同被测量。
作为一个例子，峰值宽度(PW)可以被定义为在绝对强度的预定值的峰值宽度、在相对强度(例如表示为最大强度和最小强度之间的百分比)的预定值的峰值宽度、在所述最小强度以上的预定强度值的峰值宽度、和/或相对于在绝对或相对强度值定义的基准确定的SPR倾角的标准偏差或转动惯量。
进一步，作为一个例子，
步骤b)可以包括对于所述多个被测量xn，确定在所述SPR传感器中运行的样品介质的光学特性发生变化时的峰值宽度的变化(ΔPWn)，以及
步骤c)可以包括从ΔPWn中选择其中在等式ΔPW＝k1*Δε+k2*Δn中k2被最小化或比率k1/k2被最大化的ΔPWi，其中Δε是在所述样品的光学特性发生变化时的吸光度的变化，而Δn为折射率的变化，并且使用ΔPWi估计吸光度ε。
在本发明的第一方面的另一种配置中，提供了一种用于基于表面等离子体谐振(SPR)的光学传感器的校准方法，包括以下步骤：
a)运行具有不同折射率n的至少两种校准样品和具有不同吸光度ε的至少两种校准样品，
b)对于每种样品，确定作为入射角的函数的反射光强度的SPR曲线中的至少一个峰值宽度PWn，
c)估计在所述校准样品之间的所述至少一个峰值宽度PWn的变化ΔPWn，
d)在步骤c的ΔPWn中选择在关系式ΔPW＝k1*Δε+k2*Δn中k2被最小化或比率k1/k2被最大化的ΔPWi，其中Δε是在所述样品的光学特性发生变化时的吸光度的变化，而Δn为折射率的变化。
因此，本发明的概念还提供了一种用于校准SPR传感器的方法。
术语“校准”在这里用来表示用于提高分析方法的定量准确度或精度的任何程序。校准通常作为在分析步骤本身之前(或之后)的单独的实验步骤来执行。在校准步骤中，光学探针的结合或释放对一组被测量的特定贡献和/或至少一种噪声源对一组被测量的贡献被以定量或半定量的方式确定。在分析步骤中，如此确定的特定贡献被用于提高通过“数学方法”的准确度或精确度。
SPR传感器可以是使用角度读数的SPR传感器。
“运行样品”指的是在SPR中使用样品，即根据仪器协议注入它。
作为一个例子，该方法还可以包括以下步骤：
d)利用PWi分析结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的所述样品中的光学探针物种的量。
另外，步骤b)的至少一个峰值宽度可以被定义为在绝对强度的预定值的峰值宽度、在相对强度(例如表示为最大强度和最小强度之间的百分比)的预定值的峰值宽度、在所述最小强度以上的预定强度值的峰值宽度、和/或相对于在绝对或相对强度值定义的基准确定的SPR倾角的标准偏差或转动惯量。
在本发明的第二方面，提供了峰值宽度PWi用于估计表面等离子体谐振SPR传感器中的样品的吸光度的用途，其中所述PWi已被选择为来自作为入射角的函数的反射光强度的SPR曲线中的峰值宽度的多个定义中的峰值宽度，并且PWi是其中来自折射率的贡献实质上为零的峰值宽度的定义。
作为第二方面的配置，提供了峰值宽度PWi用于校准表面等离子体谐振(SPR)传感器的用途，其中所述PWi已被选择为来自作为入射角的函数的反射光强度的SPR曲线中的峰值宽度的多个定义中的峰值宽度，并且PWi是其中来自折射率的贡献实质上为零的峰值宽度的定义。
正如从本公开中理解的，术语“峰值宽度的用途”可以指使用测得的峰值宽度，或使用从测得的峰值宽度获得的信息。
在第二方面的实施方式中，所述峰值宽度(PW)的多个定义被定义为包括在绝对强度的预定值的峰值宽度、在相对强度(例如表示为最大强度和最小强度之间的百分比)的预定值的峰值宽度、在所述最小强度以上的预定强度值的峰值宽度、和/或相对于在绝对或相对强度值定义的基准确定的SPR倾角的标准偏差或转动惯量。
作为本发明的第三方面，提供了光学探针在根据上述第一方面的方法中的用途。
这种用途是如此有利的，因为它例如提供了用于执行根据上述的第一、第二和/或第三方面的方法。
作为第四方面，提供了一种计算机程序产品，所述产品包括计算机可执行组件，当所述计算机可执行组件在包括在设备中的处理单元上运行时，所述计算机可执行组件使所述设备执行关于第一方面或第二方面陈述的步骤中的任何一个或所有步骤。
作为一个例子，该计算机程序产品可以包括用于执行根据本发明的方面的任何方法中的至少步骤c)的软件。因此，计算机程序产品可包括例如用于确定或估计函数f使得结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针的信号-噪声比(S/N)增加的软件。
此外，所述计算机程序产品还可以包括用于实现在本发明的实施例中的不同噪声源的受控变化的软件。该软件可以实现受控的温度变化、或与光学传感器表面接触的介质的成分的受控变化，或实现光学探针或其它结合物质或其他液体成分的注入。
为了提供本公开的方法和用途的准确实现，以及用于确定结合到传感器表面或从传感器表面释放的光学探针，本发明人已经实现了将至少一种光学探针物种与例如如何根据本公开的方法和用途使用光学探针的指令组合在单一的试剂盒中的价值。
作为本发明的第五方面，提供了一种试剂盒，其包括至少一种光学探针物种和如何根据本发明的方法使用其的指令。
所述试剂盒还可以含有一种或几种试剂、缓冲液、或其它化学物种，其中至少一种是光学探针物种。光学探针物种可以是，例如天然或合成的染料分子、反应性染料分子、耦合到另一物种的染料分子、有色颗粒或珠子、或有色蛋白。该试剂盒因此适用于预期的方法。试剂盒的各个组成部分也可以如上所述地结合本公开的方法方面进行选择和指定。
指令包括如何将该试剂盒用于预期的方法的描述。
在第五方面的实施方式中，试剂盒包括具有可测量的RI和可忽略的吸光率的第一样品、具有不同于所述第一样品的RI和可忽略的吸光度的第二样品、以及具有可测量的吸光度的第三样品。
在第五方面的实施方式中，所述试剂盒还包括根据上述第四方面的计算机程序产品。
附图说明
图1示出所得到的作为入射角的函数的反射光强度的曲线图的示意图，并且也是“SPR倾角”的峰值宽度的例子。
图2是在670纳米的SPR测量的例子。该图显示了在许多不同的强度水平测量的蔗糖样品和染料样品与缓冲溶液相比的SPR倾角的峰值宽度。
具体实施方式
一般实例
当光在透明的光学材料(通常为玻璃)和SPR活性金属(通常为金)的薄膜之间的表面反射时，观察到表面等离子体谐振(SPR)的现象。在入射角大于临界角时，光被全反射。然而，在大于临界角的一定角度，光被吸收并以表面等离子体波的形状耗散。如众所周知的，该SPR吸收角度取决于金层(样品)的另一侧的材料的折射率。然而，人们发现，SPR被观察到的角度不是无穷窄的角；而光被吸收的角度间隔有几度宽。
在实践中，当光强度作为反射角度的函数被测量时，观察到SPR。图1示出所得到的SPR曲线或SPR倾角形状的吸收曲线图。
该样品的光学特性是由消光系数ε和折射率n定义的。
最小角度(MA)在较大程度上取决于n，但在较小程度上还取决于一些其它的变量。
峰值宽度(PW)取决于许多变量，这些变量中的一个重要变量是ε。然而，PW也取决于许多其它变量，包括例如表面粗糙度和金膜的厚度，并在较小程度上还取决于n。
假定只有样品介质的光学特性变化，而所有其他变量不变，PW的变化将只取决于ε和n的变化：
ΔPW＝k1*Δε+k2*Δn      (式1)
对于吸光性样品，项n一般比项ε小得多。在吸光性样品的情况下，PW的测量可能会产生样品吸光度的近似但有些粗略的测定。现在，没有对PW的单一的、独特的定义。与此相反，PW可以无限多的不同方式被定义，例如：
·在绝对强度的任何预定值的峰值宽度。
·在相对强度(表达为最大强度和最小强度之间的百分比)的任何预定值的峰值宽度。
·在最小强度以上的任何预定的强度值的峰值宽度。(最小强度由于样品的光学特性的变化可能有所变化。)
·相对于在任何绝对或相对强度值定义的基准确定的SPR倾角的标准偏差。
发明人发现，式1中的常数k1和k2将根据PW如何定义而变化，且该变化可以被利用以提高SPR传感器的性能。发明人发现，甚至可能有PW的如此定义，其中k2是零或者至少足够小以至于从实用的角度出发可被忽视。对于PW的这种定义，式1被简化为：
ΔPW≈k1*Δε      (式2)
因此，PW可用于确定吸光度而无需对n的变化进行任何校正。发明人还发现，PW和“最佳”PW的选择依赖于许多变量，例如样品(即用作光学探针物种的特定染料)的吸收光谱、最小角度(MA)的实际值、玻璃的折射率和可能的消光系数、使用的特定仪器(例如与标称波长相对的仪器的实际波长)、传感器表面的粗糙度、金膜厚度等。因此，对于精确测量，优选定期执行“最佳PW”校准，例如基于每天。由于PW依赖关系的复杂模式，可能难以基于纯理论依据来预测“最佳PW”。相反，它应该通过经验的校准程序来确定。
在选择“最佳PM”时，可以权衡额外的性能参数，例如：
·k2的大小，即该方法的灵敏度。
·k2对光学探针的吸光度或浓度的线性度。
下面的非限制性实例将进一步说明本发明。
实例1
该实例是在使用角度读数的SPR仪器上进行的，且全角扫描在670nm处被连续记录。SPR芯片是金覆盖的玻璃芯片。缓冲液的连续流被用于基准读数。首先，注入溶解在运行缓冲液(runningbuffer)中的1％的蔗糖。然后，注入溶解于运行缓冲液的在636nm处具有强吸光率的染料的50ppm的溶液。蔗糖代表折射率发生变化但基本上没有吸光率的样品。染料代表折射率和吸光率均发生变化的样品。光强数据被以16位格式保存，即由65536个像素(pixel)表示。在第一数据评估步骤，对SPR最小角度进行计算。最小角度的变化对于蔗糖样品是+0.76角度单位及对于染料样品是+0.09角度单位。在第二步骤中，阈值被设定在65000个强度像素，并计算出在从阈值到倾角最小强度的距离的75％的SPR倾角宽度。宽度变化对于蔗糖样品是-0.11角度单位及对于染料样品是+0.40角度单位。在第三步骤中，将阈值设定为55000个像素，并计算从阈值到倾角最小强度的距离的75％的SPR倾角宽度。宽度变化对于蔗糖样品是+0.15角度单位及对于染料样品是+0.44角度单位。根据这些数据的内插，我们估计，通过将阈值设置为60000个像素，蔗糖样品的宽度变化将基本上为零。因此，在第四数据评估步骤中，阈值被设定为60000个像素，并计算从阈值到倾角最小强度的距离的75％的SPR倾角宽度。宽度变化对于蔗糖样品基本为零及对于染料样品为+0.43角度单位。因此，相对于染料浓度的灵敏度为每ppm0.0086角度单位。这个例子演示了与吸光度相关但对折射率的依赖性可以忽略不计的物理被测量的选择过程。该示例还演示了该被测量的值如何与染料浓度相关或相对于染料浓度校准。
实例2
该实例是在使用角度读数的SPR仪器上进行的，且全角扫描在670nm处被连续记录。SPR芯片是金覆盖的玻璃芯片。缓冲液的连续流被用于基准读数。首先，注入溶解在运行缓冲液中的1％的蔗糖。然后，注入溶解在运行缓冲液的在636nm处具有强吸光率的染料的50ppm溶液。针对缓冲液、蔗糖样品和染料样品的全SPR倾角被记录并保存。SPR倾角的全宽在从0.029个单位(靠近最小倾角)到0.25个单位的多个固定的强度值被测量。结果总结在下面的表中并绘制在图2中。
从表中明显看出倾角宽度不仅受吸光性染料样品的影响，也受非吸光性蔗糖样品的影响。此外，蔗糖和缓冲液之间的峰值宽度差异取决于倾角宽度被读出的强度值。为了获得提供吸光度(或染料浓度)的很好的测量结果的被测量，峰值宽度应最佳地在约0.032-0.04强度单位被读取，其中折射率变化的影响最小。例如，通过在0.034强度单位执行峰值宽度测量，来自蔗糖的贡献将基本上为零，而相对于染料浓度的灵敏度将是每ppm约0.13角像素。
实例3
竞争测定法常用于SPR。这是描述这样的测定的概念性例子。SPR感测表面被涂覆有对分析物具有亲和力的抗体，并且对SPR现象进行监测。在第一步骤中，选择与吸光度相关但对折射率的依赖性可以忽略不计的合适的被测量如实例1或2中所述的执行。在第二步骤中，使用所选择的被测量，使用具有不同但是已知的分析物浓度和被标记了合适的染料的分析物或分析物类似物的浓度的混合物绘制校准曲线。在第三步骤中，将未知样品与已知浓度的被标记的分析物类似物混合，由染料发出的SPR信号被确定，并且从校准曲线确定未知样品中的分析物的浓度。
实例4
抑制测定法常用于SPR。这是描述这样的测定的概念性例子。SPR感测表面被涂覆有分析物或分析物类似物，且SPR现象被监测。在第一步骤中，选择与吸光度相关但对折射率的依赖性可以忽略不计的合适的被测量如实例1或2中所述的执行。在第二步骤中，使用所选择的被测量，使用预平衡的具有不同但是已知浓度的被标记合适的染料的抗体的混合物和已知浓度的分析物绘制校准曲线，该抗体对分析物具有亲和力。在第三步骤中，将未知样品与已知浓度的被标记的抗体混合并使其平衡。从染料发出的SPR信号被确定，并且根据校准曲线确定未知样品中的分析物的浓度。
实例5
夹心测定法常用于SPR。这是描述这样的测定的概念性例子。SPR感测表面被涂覆有对分析物具有亲和力的抗体，并且对SPR现象进行监测。在第一步骤中，选择与吸光度相关但对折射率的依赖性可以忽略不计的合适的被测量如实例1或2中所述的执行。在第二步骤中，使用所选择的被测量，使用不同但是已知浓度的分析物绘制校准曲线。在每次注入分析物后，被标记合适的染料的对分析物具有亲和力的第二抗体被注入。在第三步骤中，含有未知浓度的分析物的样品被注入，然后注入被标记的第二抗体，并且从校准曲线确定浓度。
实例6
经常使用SPR进行分子间的相互作用的动力学和平衡常数的确定。这是使用由本发明提出的方法的具有竞争力的动力学测定的概念性例子。SPR感测表面被涂覆有对配体具有亲和力的受体，以及对SPR现象进行监测。在第一步骤中，选择与吸光度相关但对折射率的依赖性可以忽略不计的合适的被测量如实例1或2中所述的执行。在第二步骤中，使用所选择的被测量，注入不同但是已知浓度的被标记合适的染料的配体或配体类似物，从染料发出的SPR信号被确定，及动力学常数kon和koff及平衡常数Kd被确定。该配体类似物对与配体相同的受体具有亲和力。在第三步骤中，注入待研究的配体和被标记的配体类似物的混合物。现在配体和配体类似物竞争表面上的相同的亲和位置。从染料发出的特定信号被实时监测，并且配体-受体相互作用的动力学和平衡常数通过竞争动力学的数学方法(R.Karlsson,Anal.Biochem.1994,221,142；R.Karlsson,A.J.Immunol.Methods1997,200,121)被计算。
通过使用在本实例中概述的方法，对相同的受体具有亲和力的许多不同的配体的动力学和平衡常数可以通过与相同的被标记的配体类似物即参考化合物的竞争和比较来确定。而且可以执行不同配体的亲和力的快速排序。该方法在药物筛选和片段筛选中可能是特别有用的，其中受体与大量不同的配体之间的相互作用通常被研究。
实例7
直接结合测定法常用于SPR。这是描述这样的测定的概念性例子。SPR感测表面被涂覆有单链DNA寡核苷酸，且对SPR现象进行监测。在第一步骤中，选择与吸光度相关但对折射率的依赖性可以忽略不计的合适的被测量如实例1或2中所述的执行。在第二步骤中，使用所选择的被测量，表面与含有被标记合适的染料的互补DNA链的样品接触，并通过分析特定于染料的SPR信号，对DNA链的相互作用进行研究。相互作用包括结合和重排动力学及浓度的确定。
本发明当然不局限于上文具体描述的方面、实施方式和变体，或具体的实施例，而是可以在不脱离在以下权利要求中限定的总的发明构思的情况下做出许多变化和修改。

Claims (33)

1.一种确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的量的方法，其特征在于，所述确定包括以下步骤：
a)在一个单一的波长或在一个以上的波长，确定与所述探针的吸光度相关的物理被测量(xi)，
b)关联所述被测量的值与分别结合到所述表面或从所述表面释放的所述光学探针的量，
其中，步骤a)的所述物理被测量(xi)是其中来自折射率的贡献实质上为零的物理被测量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)的所述物理被测量通过执行以下步骤来选择：
a1)确定与所述探针的吸光度相关的多个物理被测量xn，及
a2)从所述多个被测量中选择其中来自折射率的贡献实质上为零的被测量xi。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述光学传感器基于表面等离子谐振SPR。
4.根据权利要求3和2所述的方法，其中所述多个被测量与作为入射角的函数的反射光强度的SPR曲线中的峰值宽度PW相关。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述峰值宽度PW被定义为在绝对强度的预定值的峰值宽度、在相对强度(例如表示为最大强度和最小强度之间的百分比)的预定值的峰值宽度、在所述最小强度以上的预定强度值的峰值宽度、和/或相对于在绝对或相对强度值定义的基准确定的SPR倾角的标准偏差或转动惯量。
6.根据权利要求4或5中任一项所述的方法，其中，步骤a1)包括：
对于与所述峰值宽度相关的所述物理被测量，确定在所述样品的光学特性发生变化时的所述峰值宽度的变化ΔPW，
并且步骤a2)包括
从所述多个被测量中选择其中在下式中k2被最小化或比率k1/k2被最大化的至少一个被测量：
ΔPW＝k1*Δε+k2*Δn，
其中Δε是在所述样品的光学特性发生变化时的吸光度的变化，而Δn为折射率的变化。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤b)包括使用所述被测量的值区分测量噪声N和来自所述光学探针物种的结合或释放的信号。
8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤b)包括确定所述被测量的至少一个函数f，即f(x1)，使得所述光学探针结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的信号-噪声比S/N增大。
9.根据权利要求7-8中任一项所述的方法，其中所述测量噪声N源于结合到所述表面或从所述表面释放的至少一种附加的化学物种，并且步骤b)包括使用所述被测量的值区分所述光学探针物种的结合或释放与所述至少一种附加的化学物种的结合或释放。
10.根据权利要求7-8中的任一项所述的方法，其中所述测量噪声N通过改变附加的化学物种分别到所述光学传感器表面的结合或从所述光学传感器表面的释放已经被确定。
11.根据权利要求7-8中的任一项所述的方法，其中所述测量噪声N源于温度变化，并且步骤b)包括使用所述被测量的值区分所述光学探针物种的结合或释放与温度变化噪声。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述测量噪声N通过改变与所述光学传感器表面接触的介质的温度已经被确定。
13.根据权利要求7-8中的任一项所述的方法，其中所述测量噪声源于与所述传感器表面接触的介质的组成变化，并且步骤b)包括使用所述被测量的值区分所述光学探针物种的结合或释放和所述组成变化。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述测量噪声N通过改变与所述光学传感器表面接触的介质的组成已经被确定。
15.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述光学传感器的感测原理基于内部反射。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述光学传感器的感测原理基于光波导折射法、受抑全内反射、基于波导的表面等离子体谐振、光栅耦合折射法、干涉折射法、或双偏振干涉法。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述光学传感器的感测原理基于使用角度读数的表面等离子体谐振SPR。
18.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中至少一个测量波长被选择为接近所述探针的最大吸光度的波长，优选在距离最大值50nm内，并且更优选在距离最大值20nm内。
19.一种用于基于表面等离子体谐振SPR估计光学传感器中的样品的吸光度ε的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定与所述样品的吸光度ε相关的多个物理被测量(xn)；
b)从步骤a)的所述多个物理被测量(xn)选择其中来自折射率的贡献实质上为零的物理被测量xi，及
c)利用步骤b)的所述物理被测量xi估计所述吸光度ε。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述多个被测量xn为与作为入射角的函数的反射光强度的SPR曲线中的峰值宽度PWi相关的不同被测量。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述峰值宽度PW被定义为在绝对强度的预定值的峰值宽度、在相对强度(例如表示为最大强度和最小强度之间的百分比)的预定值的峰值宽度、在所述最小强度以上的预定强度值的峰值宽度、和/或相对于在绝对或相对强度值定义的基准确定的SPR倾角的标准偏差或转动惯量。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中
步骤b)包括对于所述多个被测量xn，确定在所述SPR传感器中运行的样品介质的光学特性发生变化时的峰值宽度的变化ΔPWn，以及
步骤c)包括从ΔPWn中选择其中在等式ΔPW＝k1*Δε+k2*Δn中k2被最小化或比率k1/k2被最大化的ΔPWi，其中Δε是在所述样品的光学特性发生变化时的吸光度的变化，而Δn为折射率的变化，以及使用ΔPWi估计所述吸光度ε。
23.一种用于基于表面等离子体谐振SPR的光学传感器的校准方法，所述方法包括以下步骤：
a)运行具有不同折射率n的至少两种校准样品和具有不同吸光度ε的至少两种校准样品，
b)对于每种样品，确定作为入射角的函数的反射光强度的SPR曲线中的至少一个峰值宽度PWn，
c)估计所述至少一个峰值宽度PWn在所述校准样品之间的变化ΔPWn，
d)在步骤c)的ΔPWn中选择在关系式ΔPW＝k1*Δε+k2*Δn中k2被最小化或比率k1/k2被最大化的ΔPWi，其中Δε是在所述样品的光学特性发生变化时的吸光度的变化，而Δn为折射率的变化。
24.根据权利要求23所述的方法，还包括以下步骤：
d)利用PWi分析所述样品中结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的光学探针物种的量。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中步骤b)中的至少一个峰值宽度被定义为在绝对强度的预定值的峰值宽度、在相对强度(例如表示为最大强度和最小强度之间的百分比)的预定值的峰值宽度、在所述最小强度以上的预定强度值的峰值宽度、和/或相对于在绝对或相对强度值定义的基准确定的SPR倾角的标准偏差或转动惯量。
26.峰值宽度PWi用于估计表面等离子体谐振SPR传感器中的样品的吸光度的用途，其中所述PWi已被选择为来自作为入射角的函数的反射光强度的SPR曲线中的峰值宽度的多个定义中的峰值宽度，且PWi是其中来自折射率的贡献实质上为零的峰值宽度的定义。
27.峰值宽度PWi用于校准表面等离子体谐振SPR传感器的用途，其中所述PWi已被选择为来自作为入射角的函数的反射光强度的SPR曲线中的峰值宽度的多个定义中的峰值宽度，且PWi是其中来自折射率的贡献实质上为零的峰值宽度的定义。
28.根据权利要求26或27所述的用途，其中峰值宽度PW的所述多个定义被定义为包括在绝对强度的预定值的峰值宽度、在相对强度(例如表示为最大强度和最小强度之间的百分比)的预定值的峰值宽度、在所述最小强度以上的预定强度值的峰值宽度、和/或相对于在绝对或相对强度值定义的基准确定的SPR倾角的标准偏差或转动惯量。
29.光学探针在根据权利要求1-25中任一项所述的方法中的用途。
30.一种计算机程序产品，包括计算机可执行组件，当所述计算机可执行组件在包括在设备中的处理单元上运行时，使所述设备执行权利要求1-25中任一项中陈述的步骤中的任何一个或所有步骤。
31.一种试剂盒，所述试剂盒包括至少一种光学探针物种和如何根据权利要求1-25中任一项所述的方法使用它的指令。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，包括具有可测量的折射率RI和可忽略的吸光度的第一样品，具有不同于所述第一样品的折射率的折射率RI和可忽略的吸光度的第二样品，及具有可测量的吸光度的第三样品。
33.根据权利要求31-32中任一项所述的试剂盒，还包括根据权利要求30所述的计算机程序产品。
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