CN103983684B - 一种高效的maldi板上的糖基化抑制剂筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种MALDI板上反应的糖基化抑制剂的高效筛选方法。它是选取具有游离氨基的多肽与还原糖以一定比例的混合体系为作用底物，加入不同的待测物后直接点样在MALDI板上，干热条件下，烘箱60 ℃，反应4 h，然后加入基质（α‑Cyano‑4‑hydroxycinnamic acid）直接采用MALDI‑TOF‑MS进行分析评价。通过计算DSP，评价指标可为DSP、抑制率以及IC₅₀。从而确定待测物的糖基化抑制性。采用本发明可以定性、定量的对待测物的抑制特性及抑制程度进行测定。此方法具有快速、高效、灵敏、分辨率高以及样品量需求小的优点。

Description

一种高效的MALDI板上的糖基化抑制剂筛选方法

技术领域

本发明涉及一种高效的MALDI板上的糖基化抑制剂筛选方法。尤其是应用在功能性食品、生物医药行业等。

背景技术

美拉德反应在食品领域里起着非常重要的作用。然而，它能够改善食品色、香、味及功能性质，但是也会带来一些不利影响，如降低食品的消化性和营养性；也会产生具有危害作用的物质（丙烯酰胺、AGEs等）导致衰老、糖尿病、癌症等。因此，对美拉德反应的抑制剂的研究越来越引起重视。尤其是对新型的天然的具有美拉德反应抑制效果的物质的筛选更为关注。因而，急需一种高效、快速、简单、可信的美拉德反应抑制剂的筛选方法。目前，现有的有效的糖基化抑制剂筛选方法主要有免疫分析法（ELISA）和荧光光谱分析法等。但是这些方法低效、耗时、耗能、费用高。

发明内容

为了克服现有的分析方法的耗时、耗能等不足，本实用新型提供一种新型的筛选糖基化抑制剂的分析方法，该方法能够给快速的筛选出是否具有糖基化抑制效果，而且能够定量的比较不同抑制剂的抑制性。

本实用新型解决其技术问题所采用的技术方案是：采用MALDI板上反应，高效筛选鉴定糖基化抑制剂。本方法选取具有游离氨基的多肽与还原糖（葡萄糖、半乳糖等）的一定比例的Tris-HCl混合体系为作用底物，加入不同的抑制剂后，直接在MALDI板上，干热条件下，烘箱50~65 ℃，反应1~4 h，然后加入基质（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid等）直接采用MALDI-TOF-MS进行检测分析评价。通过计算DSP，评价指标可为DSP、抑制率以及IC₅₀。从而确定待测物的糖基化抑制性。

每分子肽的平均取代度(DSP)按以下公式计算：

(1)

其中I—每个糖基化肽的信号强度；i—糖基化肽中结合葡萄糖的数目。

(2)

其中 DSP_inh 和 DSP_control 分别代表加待测物和控制组的DSP 值。

本发明的优点是，MALDI-TOF的准确度高达0.1%~0.01%，并具有高灵敏度、简单、高效、重现性好的优点，单次可以检测384个样品，每个样品所需时间仅为数秒；样品制备时间仅需不足4h，采用质谱检测肽的肽段糖基化程度的变化，通过计算多肽分子的平均取代度（DSP），测定肽的糖基化程度变化，进而确定待测物的糖基化抑制活性。其原理在于，美拉德反应的作用位点主要是肽链N端的游离氨基、赖氨酸以及精氨酸的氨基，美拉德反应的过程中会发生加糖脱水的过程，因此，肽段根据被糖基化的位点数不同，质荷比会不同的发生偏移（Δm=162.0528，324.1056…），然后通过DSP的计算进而定量表征糖基化程度在不同待测物的条件下的变化。所采用的方法具有检测灵敏度高、速度快、能耗低，达到高效筛选糖基化抑制剂的效果。本发明所述方法简单，耗时短，具有较高的准确性、可操作性、稳定性以及重复性。

具体实施方式

为了便于理解，下面结合具体实施例对本发明予以进一步说明。

实施例1

采用MALDI板上反应，高效筛选鉴定糖基化抑制剂。本方法选取0.2 mg/mL的多肽RGYVYQGL （m/z 955.4996）与葡萄糖的以1:10的摩尔比配制成Tris-HCl（6 mM，pH 8.0）混合体系为作用底物，取1.5 μL上述混合溶液点板，风干，作为控制组。对于待测物组，在上述混合作用底物加入不同浓度梯度（10^-6 ~1 M）的芦丁（待测物），混匀后，将其直接点在MALDI板上，风干。将样品风干后的MALDI板置于湿度为65%，干热条件下，烘箱60 ℃，控制反应湿度为65%，反应4 h，反应完成后，在样品点上滴1.5 μL 5 mg/mL的基质（α-氰基-4-羟基肉桂酸 ），风干后，装机，直接采用MALDI-TOF-MS以及MS/MS进行检测分析评价。通过提取不同离子峰的峰强度，根据公式1来计算DSP，每个样品浓度至少要三个点，每个点扫谱60次，取平均值，计算标准方差，评价指标为DSP。通过公式2，将DSP值换算成抑制率。采用高斯对数拟合得到不同浓度的芦丁与抑制率的曲线，计算出IC₅₀。 从而确定待测物的糖基化的抑制性。其中控制组为芦丁溶液的溶剂（甲醇/乙醇）。

实施例2

首先，配制0.2 mg/mL的多肽 SELLQRPGKIRFREQWLRD （m/z 2427.3368）的Tris-HCl（6 mM，pH 8.0）溶液，然后以1:10的肽糖摩尔比加入半乳糖的组成混合体系为作用底物。取1.5 μL上述混合溶液点板，风干，作为控制组。对于待测物组，在上述混合作用底物加入不同浓度梯度（10^-6 ~1 M）的肌肽（待测物），混匀后，将其直接点在MALDI板上，风干。将风干后的MALDI板，干热条件下，烘箱60 ℃，控制反应湿度为65%，反应2 h，反应完成后，在样品点上滴1.5 μL 5 mg/mL的基质（α-氰基-4-羟基肉桂酸 ），风干后，装机，直接采用MALDI-TOF-MS以及MS/MS进行检测分析评价。通过提取糖基化前后肽段的离子峰的峰强度，根据公式1来计算DSP值；通过公式2，将DSP换算成抑制率，采用高斯对数拟合得到不同浓度的芦丁与抑制率的曲线，计算出IC₅₀。从而确定待测物是否为糖基化抑制剂。计算出IC₅₀，可以同时与其它待测物对比相对的糖基化抑制活性。其中控制组为水溶液。

Claims (4)

1.一种高效的MALDI板上的糖基化抑制剂筛选方法，其特征是：采用具有游离氨基的多肽与还原糖一定的比例混合的物质为反应底物，并以Tris-HCl缓冲液缓冲；将反应底物与一定浓度或一系列浓度的待测物混匀，点在MALDI板上，直接对MALDI板进行加热，在MALDI板上进行Maillard反应，然后通过MALDI-TOF-MS进行检测；采用MALDI-TOF质谱法，通过对肽的DSP计算，可以得到抑制率及IC₅₀，筛选出具有糖基化抑制性的待测物。

2.根据权利要求1所述的一种高效的MALDI板上的糖基化抑制剂筛选方法，其特征是所述加热方式为：空气挥发干后，采用烘箱50~60 ℃直接加热MALDI板1~4 h，进行糖基化反应孵育过程。

3.根据权利要求1所述的一种高效的MALDI板上的糖基化抑制剂筛选方法，其特征是Tris-HCl缓冲液的pH为8.0。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种高效的MALDI板上的糖基化抑制剂筛选方法，其特征是采用DSP、抑制率以及IC₅₀多指标评价、筛选待测物的糖基化抑制性。