CN103983678B - 一种基于球形跨尺度结构阵列的葡萄糖酶电极及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种基于球形跨尺度结构阵列的葡萄糖酶电极及其制备方法。将键合金丝熔凝形成直径为Φ400μm金微球和金丝引线的复合结构；以厚度为520μm的硅基底搭建纵向节距为570μm、横向节距为625μm的3×3金微球阵列组件；用环氧树脂胶将上述3×3金微球阵列组件封装在塑料滴管内，并基于水浴法在该3×3金微球阵列上合成ZnO纳米线，得到球形跨尺度结构阵列；将葡萄糖氧化酶固定在上述球形跨尺度结构阵列表面，制备出基于球形跨尺度结构阵列的葡萄糖酶电极。本发明可高精度、批量、低成本地制备特定节距的金微球阵列；而球形跨尺度结构的吸附面积大，不但有利于葡萄糖氧化酶的固定、酶电极催化性能的提高，还能实现酶电极的小型化。

Description

一种基于球形跨尺度结构阵列的葡萄糖酶电极及其制备方法

技术领域

本发明属于微传感技术领域，主要应用于电化学、生物、医学、食品加工、环境监测等领域，特别涉及一种基于球形跨尺度结构阵列的葡萄糖酶电极及其制备方法，用于人体血液和尿液中葡萄糖浓度的检测。

背景技术

糖尿病是一种内分泌代谢疾病，经常伴随心脑血管疾病、肾衰竭等各种并发症，严重威胁人体健康。第三代葡萄糖传感器以GOD与基底电极间的直接电子转移为主要特征，其灵敏度高、响应速度快、检出限低、易于操作，在糖尿病诊断及血糖控制方面正受到越来越广泛的关注。该类葡萄糖传感器的研究重点主要包括GOD与被测葡萄糖之间的化学反应机理分析、酶电极基质材料的选择、基底电极结构的设计、酶电极的小型化等。作为一种宽带隙半导体材料，ZnO纳米线具有比表面积大、等电点高(IEP～9.5ev)、电子迁移率高、无毒、生物兼容性好、热稳定性好、抗氧化能力强等优点，将其作为酶电极的基质材料，不但能有效地吸附低等电点的GOD(IEP～4.2ev)，还可显著提高GOD和基底电极之间电子转移效率。为了进一步提高GOD的吸附面积、增强GOD的吸附效果、实现葡萄糖酶电极的小型化，进而改善葡萄糖酶电极的灵敏度、响应速度、最低检出限、使用寿命，需要对葡萄糖酶电极的基底电极和基质材料的结构进行精细设计、对其制备工艺进行改进，以便能高精度、低成本、批量地制备小型化的葡萄糖酶电极。

基于跨尺度结构的葡萄糖酶电极目前主要有平面形和圆柱形两大类。平面形跨尺度工作电极的微米级电极基底主要包括溅射有Au膜的玻璃基底、硅基底、ITO导电玻璃等，例如中国科学技术大学的TaoKong等人在溅射有Au膜的硅基底上基于水浴法合成了ZnO纳米线，得到平面形跨尺度结构并用于GOD的吸附和固定，最终制备出相应的葡萄糖传感器。圆柱形跨尺度工作电极的基底主要有键合Au丝、Ag丝、Pt丝、Au-W合金丝、碳纤维等，例如瑞典University的S.M.U.Ali等人在直径为Φ250μm的Ag丝上基于水浴法合成ZnO纳米线，进而得到圆柱形跨尺度结构，最终制备出了基于电位法的葡萄糖传感器。

工作电极的尺度主要由基底电极决定，目前其大小多为毫米级，小型化需要进一步提高。例如德国的J.Perdomo在硅基底上集成了大小为11mm×6mm的乳酸和葡萄糖酶电极芯片；NBIC新药物研究所的WangYi-Ting以直径为Φ3mm的热解石墨盘作为酶电极基底；韩国InhaUniversity的JiYeongKim以镀有Au/Cr且尺寸为3mm×2mm的矩形玻璃基底做为酶电极。

上述研究中所提及的跨尺度葡萄糖酶电极没有涉及球形跨尺度结构阵列。和平面形、圆柱形跨尺度结构相比较，在相同的投影区域内，球形跨尺度结构的电极面积分别增加了4倍、1.3倍，不但能有效提高酶电极的灵敏度、降低最低检出限，还能显著减小酶电极的占用空间、实现酶电极的小型化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于球形跨尺度结构阵列的葡萄糖酶电极及其制备方法，按本发明的制备方法制成的葡萄糖酶电极，其催化效率高、响应速度快、灵敏度高、检出限低、线性范围大、小型化、对制造设备要求较低、成本低廉。

为达到上述目的，本发明采用的电极：包括塑料滴管以及用环氧树脂胶封装在塑料滴管内的3×3金微球阵列组件，所述的3×3金微球阵列组件包括硅基底以及设置在硅基底上的由金微球和金丝引线构成的复合结构，且在3×3金微球阵列的金微球上合成的ZnO纳米线，基于物理吸附法而固定在ZnO纳米线上的葡萄糖氧化酶。

所述复合结构金丝引线的长度为17mm、直径为Φ50μm，金微球的直径为Φ400μm。

所述的硅基底的长度为8mm、宽度为8mm、厚度为520μm。

所述的3×3金微球阵列的横向节距为625μm，纵向节距为570μm。

用水浴法在金微球表面合成的ZnO纳米线，其端面为正六边形结构，长度为1～2μm，正六边形结构直径为Φ40～60nm。

所述的塑料滴管大端直径为Φ12mm，管身直径为Φ5mm。

本发明的制备方法如下：

1)取九根长度为80mm、直径为Φ50μm的键合金丝，分别熔融至17mm，得到九个包含有金丝引线和直径为Φ400μm的金微球的复合结构材料；

2)从厚度为520μm、直径为Φ100mm的硅片中裁取块长度为8mm、宽度为8mm的硅基底清洗干净；

3)将三根带有金属线和复合金微球的复合结构材料按625μm的节距均匀排列在贴有导电胶带且厚度为520μm的硅基底上形成1×3金微球阵列；

4)重复步骤3)，在另外2块厚度为520μm的硅基底上分别形成节距为625μm的1×3金微球阵列；

5)将上述三个厚度为520μm且带有节距为625μm的1×3金微球阵列的硅基底放置在一起并在最上层的硅基底上铺设另一硅基底后用导电胶带同向粘贴在一起，则形成横向节距为625μm、纵向节距为570μm的3×3金微球阵列组件；

6)按环氧树脂﹕固化剂﹕无水乙醇为5﹕5﹕3的质量比配制环氧树脂溶液；

7)剪取塑料滴管的中间部分，放入步骤5)得到的3×3金微球阵列组件；将3×3金微球阵列从塑料滴管大端露出，而将金丝引线从塑料滴管的管身引出；向塑料滴管管身注入环氧树脂溶液，在干燥箱中于80℃下保持30min，使管身密封；往塑料滴管大端中注入环氧树脂溶液，并在干燥箱中于80℃下保持2h使环氧树脂溶液完全固化；

8)对步骤7)封装好的3×3金微球阵列组件进行清洗；

9)配制浓度为1mmol/L的ZnO纳米线种子层溶液；

10)将3×3金微球阵列浸入ZnO纳米线种子层溶液，在其表面上得到ZnO纳米线种子层；

11)将沉积有ZnO纳米线种子层的3×3金微球阵列组件置于120℃的干燥箱中完成退火处理；

12)配制浓度为0.025mol/L的ZnO纳米线生长液；

13)将沉积有种子层的3×3金微球阵列浸入ZnO纳米线生长液中，基于水浴法于90℃下保持2.5h，则在3×3金微球阵列上生长了ZnO纳米线，进而得到球形跨尺度结构阵列；

14)用去离子水超声清洗生长有ZnO纳米线的球形跨尺度结构阵列，并在室温下干燥；

15)配制浓度为0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液；

16)将活力为50U/mg的GOD加入到上述PBS溶液中，得到浓度为40mg/mL的GOD溶液；

17)将生长有ZnO纳米线的球形跨尺度结构阵列浸入到GOD溶液中，在冰箱中于4℃下保持3h后取出，用PBS溶液冲洗，然后在室温下干燥，得到一层固定在ZnO纳米线上的用于催化作用的GOD。

本发明利用熔凝法形成包含有金微球和金丝引线的复合结构，方法简单、成本低廉；由于金微球上有金丝引线相连，便于对金微球进行操作；将特定厚度的硅基底和特定节距的光纤纤芯阵列作为定位夹具，易于高精度、批量制备纵、横节距一定的金微球阵列，而用常规微细加工技术无法得到该类结构；和平面形、圆柱形跨尺度结构，以及矩形、三角形跨尺度结构阵列相比较，球形跨尺度结构阵列不但能有效改善GOD的吸附效果、进一部提高相应酶电极的测试性能，还能实现酶电极的小型化。

本发明将球形跨尺度结构阵列引入葡萄糖酶电极的设计中，其显著特点包括以下三方面：

1)将若干个带有金微球和金丝引线的复合结构按特定横向和纵向节距均匀排列，进而形成微米级的金微球阵列电极基底。和平面形和圆柱形基底电极相比较，金微球阵列显著增大了基底电极面积。

2)用水浴法在金微球阵列上合成ZnO纳米线，形成球形跨尺度结构阵列。该球形跨尺度结构阵列不但进一步增大了GOD的吸附面积，而且还基于ZnO纳米线优异的物理化学性能，进一步改善了球形跨尺度结构阵列的润湿性能，使得葡萄糖酶电极的催化效率、检测灵敏度、最低检出限均得到大幅度改善。

3)将特定厚度的硅基底和特定节距的光纤纤芯阵列作为定位夹具，手工构建微米级的3×3金微球形阵列，制备方法简单、操作性强、加工精度高、成本低；另外由于金微球阵列的节距小且便于控制，还便于该类葡萄糖酶电极的小型化及批量化制备。

该发明所制备的一种球形跨尺度结构阵列的葡萄糖酶电极，不仅可应用于人体血液和尿液里葡萄糖浓度的检测，而且在生物、食品加工、电化学、环境监测等领域中亦有显著的应用前景。

附图说明

图1是金微球阵列的制备流程图；

图2是球形跨尺度结构阵列及相应酶电极结构图，其中图2(c)为图2(a)中球形跨尺度结构放大图，图2(d)为图2(b)中吸附有GOD的球形跨尺度酶电极放大图。

具体实施方式

以下结合附图及实施案例对本发明作进一步的详细说明：

参见图1，2，将键合金丝通过熔凝法形成金微球和金丝引线的复合结构，并分别以特定厚度的硅基底和特定节距的光纤纤芯阵列作为纵向和横向定位夹具而形成的3×3金微球阵列组件。所述的键合金丝直径为Φ50μm；金微球的直径为Φ400μm；光纤纤芯的长度为13mm、直径为Φ125μm；硅基板的长度为8mm、宽度为8mm、厚度为520μm；采用水浴法在金微球表面合成ZnO纳米线，其长度为1～2μm，端面为正六边形结构，正六边形结构直径为Φ40～60nm；固定在ZnO纳米线上的活力为50U/mg的GOD；用于封装金微球阵列组件的环氧树脂胶和塑料滴管。

参见图1，2，本发明的制备方法包括以下步骤：

1)取多模光纤一根，用丙酮浸泡后剥去其包层，抽出直径为Φ125μm的多模光纤纤芯3，剪取长度为13mm的光纤纤芯若干段，然后进行标准清洗：依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声各清洗5min，然后在干燥箱中80℃下烘干。

2)取9根长度为80mm，直径为Φ50μm的键合金丝，利用酒精灯熔融长度为17mm的键合金丝，得到9个具有金丝引线7和直径为Φ400μm的金微球4的复合结构的复合结构材料。

3)裁取长度为8mm、宽度为8mm、厚度为520μm的硅基底1，并进行标准清洗：依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声各清洗5min，然后在干燥箱中80℃下烘干。

4)将直径为Φ125μm的光纤纤芯紧密排列在贴有导电胶带2的、厚度为520μm的硅基底1上，并每隔4根抽出一根光纤纤芯，形成节距为625μm的光纤纤芯阵列；将3个具有金丝引线和金微球的复合结构分别粘贴在被抽出的光纤纤芯位置上，随后将剩余光纤纤芯全部移除，则在厚度为520μm的硅基底上得到节距为625μm的1×3金微球阵列，如图1(a)、1(b)、1(c)、1(d)。

5)重复步骤4)，在另外2个厚度为520μm的硅基底上分别形成节距为625μm的1×3金微球阵列。

6)将上述三个厚度为520μm且带有节距为625μm的1×3金微球阵列的硅基底1放置在一起并在最上层的硅基底1上铺设另一硅基底1后用导电胶带2同向粘贴在一起，则形成横向节距为625μm、纵向节距为570μm的3×3金微球阵列组件；如图1(e)。

7)按环氧树脂﹕固化剂﹕无水乙醇为5﹕5﹕3的质量比配制环氧树脂溶液5。

8)剪取塑料滴管6的中间部分，放入步骤6)得到的3×3金微球阵列组件；将3×3金微球阵列从塑料滴管6大端露出，而将金丝引线从塑料滴管6的管身引出；向塑料滴管6管身注入少量环氧树脂溶液，在干燥箱中于80℃下保持30min，使管身密封；往塑料滴管6大端中注入环氧树脂溶液，并在干燥箱中于80℃下保持2h使环氧树脂溶液完全固化，结构如图1(f)。

9)将步骤8)封装好的球形阵列进行清洗：依次用无水乙醇、去离子水超声各清洗5min，然后在干燥箱中80℃下烘干。

10)用电子秤称取0.06585g乙酸锌(Zn(CH₃COO)₂·2H₂O)并放入50mL烧杯中，加入24mL无水乙醇；将烧杯放在磁力搅拌器上，在转速500r/min下边加热边搅拌，直至完全溶解，后自然冷却至室温；取出4mL乙酸锌溶液，加入32mL无水乙醇，用保鲜膜封住烧杯口，放入水浴箱中65℃加热5min。

11)用电子秤称取0.024g氢氧化钠(NaOH)并放入50mL烧杯中，加入30mL无水乙醇；将烧杯放在磁力搅拌器上，以3000r/min的转速边加热边搅拌，直至完全溶解，后自然冷却至室温；取4mL氢氧化钠溶液，加入10mL无水乙醇，用保鲜膜封住烧杯口，放入水浴箱中65℃加热5min。

12)将步骤10)和步骤11)分别得到的乙酸锌溶液和氢氧化钠溶液混合，用保鲜膜封住烧杯口，放入水浴箱中65℃加热30min；取出后自然冷却至室温，得到浓度为1mmol/L的ZnO纳米线种子层溶液。

13)将步骤8)得到的球形阵列浸入到ZnO纳米线种子层溶液中并保持1-2min，取出后在120℃条件下退火处理10min，浸入和退火过程重复三次，完成种子层溶液的沉积。

14)分别称取3.71g硝酸锌(Zn(NO₃)₂·6H₂O)、1.75g六次甲基四胺(C₆H₁₂N₄)并放入同一烧杯中，后加入500mL去离子水，并在磁力加热搅拌器上以3000r/min的转速边加热边搅拌直至90℃，得到浓度为25mmol/L的ZnO纳米线生长液。

15)将步骤13)得到的表面沉积有种子层的球形阵列组件置于ZnO纳米线生长溶液中并密封后，放入水浴锅中于90℃生长2.5h得到生长有ZnO纳米线的球形跨尺度结构阵列，如图2(a)，2(c)。

16)超声清洗生长有ZnO纳米线8的球形跨尺度结构阵列5min，并在室温下干燥。

17)配制浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS，称取2.9009g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)，0.2964g磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)，0.7455g氯化钾(KCl)，加去离子水稀释，玻璃棒搅拌，然后定容至1000mL。

18)配制浓度为40mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液，称取0.04g葡萄糖氧化酶，加入1mL的上述PBS，搅拌均匀。

19)将生长有ZnO纳米线的球形跨尺度结构阵列浸入到GOD溶液中，在冰箱中4℃下保持3h后取出，并在室温下干燥，得到一层固定在ZnO纳米线上的用于催化作用的GOD9，如图2(b)，2(d)。

Claims (7)

1.一种基于球形跨尺度结构阵列的葡萄糖酶电极，其特征在于：包括塑料滴管(6)以及用环氧树脂胶(5)封装在塑料滴管(6)内的3×3金微球阵列组件，所述的3×3金微球阵列组件包括硅基底(1)以及设置在硅基底(1)上的由金微球(4)和金丝引线(7)构成的复合结构，且在3×3金微球阵列的金微球(4)上合成的ZnO纳米线(8)，基于物理吸附法而固定在ZnO纳米线(8)上的葡萄糖氧化酶(9)。

2.根据权利要求1所述的基于球形跨尺度结构阵列的葡萄糖酶电极，其特征在于：所述复合结构金丝引线(7)的长度为17mm、直径为Φ50μm，金微球(4)的直径为Φ400μm。

3.根据权利要求1所述的基于球形跨尺度结构阵列的葡萄糖酶电极，其特征在于：所述的硅基底(1)的长度为8mm、宽度为8mm、厚度为520μm。

4.根据权利要求1所述的基于球形跨尺度结构阵列的葡萄糖酶电极，其特征在于：所述的3×3金微球阵列的横向节距为625μm，纵向节距为570μm。

5.根据权利要求1所述的基于球形跨尺度结构阵列的葡萄糖酶电极，其特征在于：用水浴法在金微球(4)表面合成的ZnO纳米线(8)，其端面为正六边形结构，长度为1～2μm，正六边形结构直径为Φ40～60nm。

6.根据权利要求1所述的基于球形跨尺度结构阵列的葡萄糖酶电极，其特征在于：所述的塑料滴管(6)大端直径为Φ12mm，管身直径为Φ5mm。

7.权利要求1～6中任意一项所述的基于球形跨尺度结构阵列的葡萄糖酶电极的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取九根长度为80mm、直径为Φ50μm的键合金丝，分别熔融至17mm，得到九个包含有金丝引线(7)和直径为Φ400μm的金微球(4)的复合结构材料；

2)取4块厚度为520μm长度为8mm、宽度为8mm的硅基底(1)清洗干净；

3)将三根带有金丝引线(7)和金微球(4)的复合结构材料按625μm的节距均匀排列在贴有导电胶带(2)且厚度为520μm的硅基底(1)上形成1×3金微球阵列；

所述按625μm的节距均匀排列是将直径为Φ125μm的光纤纤芯紧密排列在贴有导电胶带（2）的、厚度为520μm的硅基底（1）上，并每隔4根抽出一根光纤纤芯，形成节距为625μm的光纤纤芯阵列；

所述形成1×3金微球阵列是将3个具有金丝引线和金微球的复合结构分别粘贴在被抽出的光纤纤芯位置上，随后将剩余光纤纤芯全部移除，则在厚度为520μm的硅基底上得到节距为625μm的1×3金微球阵列；

4)重复步骤3)，在另外2块厚度为520μm的硅基底(1)上分别形成节距为625μm的1×3金微球阵列；

5)将上述三个厚度为520μm且带有节距为625μm的1×3金微球阵列的硅基底(1)放置在一起并在最上层的硅基底上铺设另一硅基底后用导电胶带同向粘贴在一起，则形成横向节距为625μm、纵向节距为570μm的3×3金微球阵列组件；

6)按环氧树脂﹕固化剂﹕无水乙醇为5﹕5﹕3的质量比配制环氧树脂溶液；

7)剪取塑料滴管(6)的中间部分，放入步骤5)得到的3×3金微球阵列组件；将3×3金微球阵列从塑料滴管(6)大端露出，而将金丝引线(7)从塑料滴管(6)的管身引出；向塑料滴管(6)管身注入环氧树脂溶液，在干燥箱中于80℃下保持30min，使管身密封；往塑料滴管(6)大端中注入环氧树脂溶液，并在干燥箱中于80℃下保持2h使环氧树脂溶液完全固化；

8)对步骤7)封装好的3×3金微球阵列组件进行清洗；

9)配制浓度为1mmol/L的ZnO纳米线种子层溶液；

10)将3×3金微球阵列浸入ZnO纳米线种子层溶液，在其表面上得到ZnO纳米线种子层；

11)将沉积有ZnO纳米线种子层的3×3金微球阵列组件置于120℃的干燥箱中完成退火处理；

12)配制浓度为0.025mol/L的ZnO纳米线生长液；

13)将沉积有种子层的3×3金微球阵列浸入ZnO纳米线生长液中，基于水浴法于90℃下保持2.5h，则在3×3金微球阵列上生长了ZnO纳米线(8)，进而得到球形跨尺度结构阵列；

14)用去离子水超声清洗生长有ZnO纳米线的球形跨尺度结构阵列，并在室温下干燥；

15)配制浓度为0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液；

16)将活力为50U/mg的GOD加入到上述PBS溶液中，得到浓度为40mg/mL的GOD溶液；

17)将生长有ZnO纳米线的球形跨尺度结构阵列浸入到GOD溶液中，在冰箱中于4℃下保持3h后取出，用PBS溶液冲洗，然后在室温下干燥，得到一层固定在ZnO纳米线上的用于催化作用的GOD(9)。