CN103966219A - 人泡沫病毒载体介导的抑制HIV-1复制的shRNA的构建及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人泡沫病毒载体介导的抑制HIV-1复制的shRNA的构建和应用。抑制HIV-1复制的shRNA为shRNA1、2或3，它们都包含19nt的siRNA正义链（SEQIDNO.1、3、5），9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和终止信号。这些shRNA能够特异性地抑制HIV-1_NL4-3基因的表达。通过构建表达上述shRNA的人泡沫病毒载体和Luciferase、qPCR、ELISA和LDH分析表明本发明的shRNA可有效稳定地抑制HIV-1_NL4-3基因的表达，展示了人泡沫病毒作为表达载体介导的siRNA在艾滋病治疗中的应用前景，为艾滋病治疗研究提供了实验依据。

Description

人泡沫病毒载体介导的抑制HIV-1复制的shRNA的构建及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，具体涉及人泡沫病毒载体介导的抑制HIV-1复制的shRNA的构建和应用。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)俗称艾滋病(Acquired immunedeficiency syndrome，AIDS)病毒，诱发人类获得性免疫缺陷综合征。该病毒在分类上属逆转录病毒科慢病毒属中的灵长类免疫缺陷病毒亚属。HIV感染一直是公众健康的重大威胁。目前的抗HIV治疗药物不能对疾病进行彻底的治疗，而且患者还需要终身服药。因此，更多的研究开始转变以往的治疗思路，探寻更加有效更加经济的治疗办法。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是近几年发展起来的可用于各种病毒治疗的新方法。目前已有很多研究报道了通过对HIV保守基因进行RNA干扰，进而达到抑制HIV病毒复制的目的。RNAi也称为依赖于RNA的基因沉默机制，是指通过双链RNA特异性地抑制与其序列同源的靶基因mRNA表达的现象。

由于HIV-1的高突变率，其在RNAi靶点序列的碱基突变可显著降低或解除RNAi的抑制效果。因此寻找保守的靶基因至关重要。HIV-1的长末端重复序列(long terminal repeat，LTR)含有病毒复制所必需的重要调控因子，在病毒表达调控中起到了重要作用。因此选择HIV-1LTR区作为RNAi的靶序列。RNAi可以用化学合成的成熟的siRNA(small interferingRNA，小干扰RNA)去瞬时转染细胞，但在体内半衰期很短，短时间内降解，而且在动物中不适用。通过表达shRNA(short hairpin RNA，短发夹RNA)的病毒载体整合进入细胞进行长期稳定表达是RNAi的首选。

泡沫病毒(Foamy virus，FV)，也称合胞体病毒，是逆转录病毒的重要成员。因其感染细胞后可诱导产生类似泡沫的大量空泡、多核细胞而得名，至今仍未能发现其与人类的某种疾病存在着相互关联。病毒载体有许多优点，如转染效率高、整合准确，可将外源基因转移入人体的许多不同类型的细胞等，但也存在着令人不安的难题，其中最主要为潜在的致癌可能性。而泡沫病毒载体的安全性则更高，同时它有着广泛的宿主范围，且可携带大片段外源基因。

人泡沫病毒(Human foamy virus，HFV，也称为原型泡沫病毒(Prototype foamy virus，PFV))缺失载体(ΔФ)缺失了原病毒基因组gag、pol、env、bel1-3附属基因和LTR U3区，但是保留了一个必须的2.5kb长的顺式作用区。另外，终止密码子被引入到保留的gag序列去阻止病毒多肽的表达，进一步消除Gag-Pol融合蛋白的反面影响。同时，还有三种单独的辅助载体质粒(pCiGS、pCiPS、pCiES)来分别表达Gag，Pol，Env蛋白，四种质粒瞬时共转染可以产生正常的人泡沫病毒载体原液(Trobridge G,Josephson N,Vassilopoulos G,Mac J,Russell DW.Improved foamy virus vectors with minimal viral sequences.Mol Ther,2002,6(3):321-8)。

发明内容

本发明的目的首要目的在于提供一种抑制HIV-1复制的siRNA。

本发明的另一目的在于提供含有上述siRNA抑制HIV-1复制的shRNA。

本发明的再一目的在于提供含有上述shRNA抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体及构建方法。

本发明的目的还在于提供上述siRNA、shRNA或人泡沫病毒表达载体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种抑制HIV-1复制的siRNA，为siRNA1、siRNA2或siRNA3；其中，

siRNA1的正义链为：5'-GCATCCGGAGTACTACAAA-3'，

siRNA1的反义链为：5'-TTTGTAGTACTCCGGATGC-3'；

siRNA2的正义链为：5'-GCCCTCAGATGCTACATAT-3'，

siRNA2的反义链为：5'-ATATGTAGCATCTGAGGGC-3'；

siRNA3的正义链为：5'-GCTTGCCTTGAGTGCTCAA-3'，

siRNA3的反义链为：5'-TTGAGCACTCAAGGCAAGC-3'。

一种抑制HIV-1复制的shRNA，为shRNA1、shRNA2或shRNA3，它们都包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和终止信号；shRNA1、shRNA2、shRNA3的siRNA正义链和siRNA反义链分别为siRNA1、siRNA2、siRNA3的正义链和反义链；所述的loop环的碱基序列为TTCAAGAGA；所述的终止信号的碱基序列为TTTTT。

一种抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体，为能表达shRNA1、shRNA2或shRNA3的pΔФ-H1-shRNA1、pΔФ-H1-shRNA2或pΔФ-H1-shRNA3。

所述的抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体的构建方法包括如下步骤：

(1)将shRNA1、shRNA2、shRNA3分别克隆到shRNA表达载体pSUPER上得到pSUPER-shRNA1、pSUPER-shRNA2、pSUPER-shRNA3。

(2)分别以pSUPER-shRNA1、pSUPER-shRNA2、pSUPER-shRNA3进行PCR扩增，引物为：

上游引物P1：5’-AGAGGTACCCGAACGCTGACGTCATCA-3’，

下游引物P2：5’-GAGGATCCCTCGAGGTCGACGGTATC-3’。

(3)通过KpnI和BamHI将(2)扩增的产物克隆到人泡沫病毒载体pΔФ上得到pΔФ-H1-shRNA1、pΔФ-H1-shRNA2或pΔФ-H1-shRNA3。其中，人泡沫病毒载体pΔФ通过下列文献中阐述的材料方法制备得到(Trobridge G,Josephson N,Vassilopoulos G,Mac J,RussellDW.Improved foamy virus vectors with minimal viral sequences.Mol Ther,2002,6(3):321-8；

Trobridge GD,Russell DW.Helper-Free Foamy Virus Vectors.Hum Gene Ther,1998,9(17):2517-25)。

通过Luciferase、qPCR、ELISA和LDH分析表明本发明人泡沫病毒介导的siRNA对HIV-1_NL4-3有明显的抑制作用，能明显抑制HIV-1gag、pol、env基因的mRNA表达水平，能够显著降低HIV-1p24蛋白的表达水平，且无细胞毒性。

基于本发明研究，上述抑制HIV-1复制的siRNA、shRNA或人泡沫病毒表达载体可用于制备治疗艾滋病的药物。

一种治疗艾滋病的药物，包含上述抑制HIV-1复制的siRNA、shRNA或人泡沫病毒表达载体。

本发明提供了能够抑制HIV-1复制siRNA、shRNA，成功构建了无细胞毒性、能抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体，为艾滋病治疗及预防研究提供实验依据及理论基础。

附图说明

图1是shRNA转录生成siRNA的示意图；该shRNA包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和TTTTT终止信号，将其插入pSUPER载体H1启动子下，就能有效表达出所需的siRNA。

图2是将shRNA表达载体质粒或pSUPER空载体分别与pNL4-3.Luc.R-E-、pRL-TK共转染293T细胞，48小时后Luciferase(荧光素酶实验)检测shRNA对HIV-1_NL4-3基因抑制水平的分析图；与空载体对照组比较，***P<0.005。

图3是抑制HIV-1复制的shRNA的人泡沫病毒表达载体pΔФ-H1-shRNA的构建示意图；将含有H1启动子的shRNA基因片段克隆入人泡沫病毒载体pΔФ中得到人泡沫病毒表达载体；图中，CMV(cytomegalovirus，巨细胞病毒)是一种组成型启动子，能够控制基因表达(转录)的起始时间和表达程度。

图4是辅助载体质粒pCiGS、pCiPS、pCiES的示意图；图中，Gag、Pol、Env分别是泡沫病毒的衣壳蛋白，逆转录酶和病毒糖蛋白；CMV(cytomegalovirus，巨细胞病毒)是一种组成型启动子，能够控制基因表达(转录)的起始时间和表达程度；SpA(Simian virus40polyadenylation signal，SV40poly(A))猿猴空泡病毒40多聚腺苷酸序列，对上游基因的转录水平起调控作用。

图5是将人泡沫病毒表达载体和辅助载体质粒及pNL4-3.Luc.R-E-、pRL-TK共转染293T细胞48h后，Luciferase(荧光素酶实验)检测人泡沫病毒载体介导的shRNA对HIV-1_NL4-3基因抑制水平的分析图；与空载体对照组比较，***P<0.005。

图6是将人泡沫病毒载体介导的shRNA和辅助载体质粒及pNL4-3.Luc.R-E-共转染293T细胞48h后，qPCR检测细胞培养基中HIV-1gag(A)、pol(B)、env(C)基因mRNA水平的分析图；与未转染shRNA的对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

图7是将人泡沫病毒载体介导的shRNA和辅助载体质粒及pNL4-3-Luc共转染293T细胞48h后，ELISA(酶联免疫吸附试验)检测胞内HIV-1p24蛋白表达水平的分析图；与空载体对照组比较，**P<0.01，***P<0.005。

图8是将人泡沫病毒载体介导的shRNA和辅助载体质粒及pNL4-3.Luc.R-E-共转染293T细胞48h后，LDH(乳酸脱氢酶实验)分析图，表明人泡沫病毒载体介导的shRNA不会产生细胞毒性；与空载体对照组比较，P>0.05，无显著性差异(non significant，ns)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 由shRNA转录生成siRNA的策略

shRNA转录生成siRNA的示意图如图1所示。设计的寡核苷酸链每条均为60nt，5’端和3’端分别包含BglII和HindIII酶切位点，便于与pSUPER载体连接。5’端19nt的序列(siRNA正义链)与靶基因同源，另一端19nt的序列(siRNA反义链)与其反向互补，其间由9nt的TTCAAGAGA间隔序列形成环状结构，末端加有转录终止信号TTTTT。具有上述结构特征的寡核苷酸链经退火、磷酸化后形成双链DNA，然后定向插入经相同酶切的pSUPER载体H1启动子下。具有上述结构的pSUPER载体能转录生成shRNA，后者经Dicer酶切后成为siRNA而发挥抑制基因表达的功能。

实施例2 针对HIV-1基因干涉位点的选择与寡核苷酸的设计

根据shRNA的设计原则，以HIV-1(GenBank编号：AF324493)LTR基因序列作为siRNA的靶序列，设计了3条shRNA oligo，设计的shRNA序列进行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)同源分析证实为HIV-1特异序列。设计得到的shRNA及其靶向HIV-1_NL4-3的位点如表1所示。

表1.shRNA序列及其靶向HIV-1_NL4-3的位点

将设计的3条shRNA oligo按照实施例1中pSUPER表达载体的要求，设计成60nt能编码siRNA的寡核苷酸链，寡核苷酸序列两端包含BglII和HindIII酶切位点，能直接与经相同酶切的pSUPER载体连接。

实施例3 将双链寡核苷酸克隆入pSUPER真核表达载体

(1)寡核苷酸的退火和磷酸化

合成的单链寡核苷酸溶解于H₂O中，调整其浓度为10μM。各取9μL相应的寡核苷酸合成片段，混匀，95℃变性5min，70℃孵育10min，缓慢冷却至4℃得到退火双链DNA。

(2)双链寡核苷酸与载体的连接

退火的寡核苷酸与经BglII和HindIII双酶切的pSUPER载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆、摇菌培养后提取质粒，EcoRI和HindIII双酶切进行鉴定，阳性质粒切出约300bp的条带，而空质粒的大小为240bp。序列测定证实重组质粒序列与所设计序列完全一致，分别命名为pSUPER-shRNA1、pSUPER-shRNA2、pSUPER-shRNA3。

实施例4 Luciferase实验检测设计的shRNA对HIV-1基因是否有明显的抑制作用

使用Dual-Luciferase试剂盒(Promega)分析人泡沫病毒介导的siRNA对HIV-1基因的影响，具体步骤如下：

(1)将293T细胞按照1.5×10⁵/孔接种到24孔板，培养24h。

(2)用Lipofectamine2000转染试剂将shRNA真核表达载体质粒pSUPER-shRNA1、pSUPER-shRNA2、pSUPER-shRNA3和空载体pSUPER分别与pNL4-3.Luc.R-E-，pRL-TK(600ng、200ng、3ng)共转染293T细胞。

(3)转染48h后，吸去细胞培养上清，PBS洗涤2次。

(4)配20％(稀释5倍)裂解液，每孔加入100μL裂解液，在摇床上室温孵育20min；然后12000rpm离心1min，将上清移至新的离心管中，做好标记。

(5)取100μL上清和萤火虫荧光素酶检测试剂Ⅱ(Luciferase Assay Reagent II，LARII)100μL混合，在TD-20/20荧光发光计第一次检测萤火虫荧光素酶活性，然后加入100μLStop&Glo试剂，混合后第二次检测海肾荧光素酶活性；结果以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值表示。

Luciferase检测结果如图2所示：结果表明设计的shRNA对HIV-1_NL4-3基因有明显的抑制作用。

实施例5 可特异性抑制HIV-1复制的shRNA的人泡沫病毒表达载体pΔФ-H1-shRNA的构建

以上述得到的pSUPER-shRNA重组载体质粒为模板，设计引物，并在上下游引物的5’端分别引入KpnI、BamHI酶切位点，引物为：

上游引物P1：5’-AGAGGTACCCGAACGCTGACGTCATCA-3’，下划线为KpnI位点；

下游引物P2：5’-GAGGATCCCTCGAGGTCGACGGTATC-3’，下划线为BamHI位点。

分别以克隆得到的真核表达质粒pSUPER-shRNA1、pSUPER-shRNA2、pSUPER-shRNA3以及pSUPER空载体为模板，利用上述合成的引物，PCR扩增分别得到目的基因H1-shRNA1、H1-shRNA2、H1-shRNA3以及H1作为阴性对照。

抑制HIV-1复制的shRNA的人泡沫病毒表达载体pΔФ-H1-shRNA的构建示意图如图3所示。利用克隆技术将得到的目的基因和人泡沫病毒载体pΔФ进行KpnI和BamHI双酶切，然后将目的基因连接入人泡沫病毒载体pΔФ。转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆、摇菌培养后提取质粒，KpnI和BamHII双酶切进行鉴定，测序验证。成功构建可特异性抑制HIV-1复制的shRNA的人泡沫病毒表达载体pΔФ-H1-shRNA1、pΔФ-H1-shRNA2、pΔФ-H1-shRNA3以及阴性对照pΔФ-H1。

该实施例中用到的人泡沫病毒载体pΔФ以及实施例6中的辅助载体质粒pCiGS、pCiPS、pCiES可以通过下列文献中阐述的材料方法制备得到(Trobridge G,Josephson N,VassilopoulosG,Mac J,Russell DW.Improved foamy virus vectors with minimal viral sequences.Mol Ther,2002,6(3):321-8；Trobridge GD,Russell DW.Helper-Free Foamy Virus Vectors.Hum Gene Ther,1998,9(17):2517-25)。

实施例6 Luciferase分析人泡沫病毒介导的siRNA对HIV-1基因的影响

使用Dual-Luciferase试剂盒(Promega)分析人泡沫病毒介导的siRNA对HIV-1基因的影响，具体步骤如下：

(1)将293T细胞按照1.5×10⁵/孔接种到24孔板，培养48h；

(2)用Lipofectamine2000转染试剂将pNL4-3.Luc.R-E-，pRL-TK以及表达shRNA的人泡沫病毒载体质粒pΔф-H1-shRNA或空载体pΔф-H1和辅助载体质粒pCiGS、pCiPS、pCiES(100ng、3ng、320ng、320ng、40ng、20ng)共转染293T细胞；辅助载体质粒pCiGS、pCiPS、pCiES的示意图如图4所示。

(3)转染48h后，将上清转移到1.5mL Ep管中(-80℃保存，供实施例8ELISA实验使用)，PBS洗涤2次；

(4)配20％(稀释5倍)裂解液，每孔加入100μL裂解液，在摇床上室温孵育20min；然后12000rpm离心1min，将上清移至新的离心管中，做好标记；

(5)取100μL上清和萤火虫荧光素酶检测试剂Ⅱ(Luciferase Assay Reagent II，LARII)100μL混合，在TD-20/20荧光发光计第一次检测萤火虫荧光素酶活性，然后加入100μLStop&Glo试剂，混合后第二次检测海肾荧光素酶活性；结果以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值表示；

Luciferase检测结果如图5所示：结果表明人泡沫病毒介导的shRNA对HIV-1_NL4-3基因有明显的抑制作用。

实施例7 qPCR分析HIV-1gag、pol、env基因的mRNA表达水平

(1)样本准备：按2×10⁴细胞/孔的浓度将293T细胞接种在12孔的细胞培养板上，37℃、5％的湿润CO₂培养箱中培养过夜。用Lipofectamine2000转染试剂将pNL4-3.Luc.R-E-以及表达shRNA的人泡沫病毒载体质粒pΔф-H1-shRNA或空载体pΔф-H1和辅助载体质粒pCiGS、pCiPS、pCiES(250ng、800ng、800ng、100ng、50ng)共转染293T细胞，培养48h。

(2)总RNA的提取：Trizol试剂提取细胞和组织的总RNA，Trizol试剂购自Invitrogen公司，具体步骤如下：

1)向细胞培养皿中加入500μL Trizol，冰上放置10min，用枪头反复吹打混匀，转移到RNase-free的1.5mL Ep管中。

2)加入100μL氯仿，剧烈震荡30s后，室温静置10min。

3)4℃、12000rpm离心15min，将上层无色液体吸入至另一RNase-free的1.5mL Ep管中，加入等体积异丙醇，室温静置10min。

4)4℃、12000rpm离心10min。

5)弃上清，用500μL75％(v/v)乙醇洗涤沉淀。

6)4℃、12000rpm离心5min。

7)弃上清，室温干燥10min，向Ep管中加入40μL DEPC水溶解沉淀物，于-80℃保存备用。

8)另取2μL RNA溶于98μL水中，分别测RNA的浓度和纯度。

9)取5μL RNA进行琼脂糖凝胶电泳(2％Agarose，1×TBE)，检测RNA质量。

(3)逆转录：采用广州市锐博生物科技有限公司的逆转录试剂盒。反应体系及条件：RNA模板2μg，oligod(T)1μL，dNTPs1μL，DEPC水补齐至10μL；每管分别混匀，65℃水浴5min，冰浴2min，然后再加入Reaction Buffer4μL，Ribolock RT1μL，Rever Aid RT1μL，DEPC水补齐至20μL；混匀后42℃60min；70℃15min。反转录得到cDNA，置于冰上。

(4)qPCR：运用GeneCopoeia公司All-in-OneTM qPCR mix进行qPCR，采用Bio-Rad公司iCycler thermal cycler PCR仪。

反应体系：2×qPCR Mix10μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，cDNA模板1μL，ddH₂O8μL。内参为Actin。qPCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性15秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，其中变性、退火、延伸为34个循环。引物序列如下：

gag的引物为：

正向引物P1：5’-GGAAGTGACATAGCAGGAAC-3’，

反向引物P2：5’-CATGCTGTCATCATTTCTTC-3’；

pol的引物为：

正向引物P1：5’-TTCCCTCAAATCACTCTTTG-3’，

反向引物P2：5’-GGATGCGGTATTCCTAATT-3’；

env的引物为：

正向引物P1：5’-GGAGCAGCAGGAAGCACTAT-3’，

反向引物P2：5’-CTCTCCACCTTCTTCTTCGATT-3’；

内参Actin的引物为：

正向引物P1：5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，

反向引物P2：5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’。

qPCR结果如图6所示：与未转染shRNA的对照组相比，HIV-1gag、pol、env基因的mRNA表达水平明显降低，表明shRNA对HIV-1有明显的抑制作用。

实施例8 ELISA分析胞内HIV-1p24蛋白的表达水平

使用HIV-1p24ELISA试剂盒(XpressBio)分析胞内HIV-1p24蛋白的表达水平，具体步骤如下：

(1)准备工作：利用实施例6中的细胞上清作为本实验的样品；将试剂盒中的洗涤液(20×)用灭菌的去离子水稀释20倍到200mL；取20μL Positive p24Control(10ng/mL)，用980μLDMEM培养基稀释到1mL，混匀作为标准品A，浓度即为200pg/mL。取500μL标准品A，加500μL DMEM培养基，混匀稀释到100pg/mL，作为标准品B；取500μL标准品B，加500μLDMEM培养基，混匀稀释到50pg/mL，作为标准品C；取500μL标准品C，加500μL DMEM培养基，混匀稀释到25pg/mL，作为标准品D；取500μL标准品D，加500μL DMEM培养基，混匀稀释到12.5pg/mL，作为标准品E；

(2)从铝箔袋中取出所需数量的微孔板条，装至微孔板架上。设空白对照2复孔，HIV-1p24标准品A、B、C、D、E各2复孔，pΔф-H1、pΔф-H1-shRNA1、pΔф-H1-shRNA2、pΔф-H1-shRNA3各3复孔；每孔加20μL裂解液(空白对照孔不加)。

(3)向各孔内分别加入200μL的HIV-1p24标准品或待测样品。用封板膜将微孔板密封，置37℃孵育60min。

(4)洗涤：弃去微孔板反应孔内液体，每孔(含空白对照孔)加入350μL工作浓度洗涤液，然后将洗涤液弃去。重复洗板5次，最后在干净的滤纸上拍干。

(5)每孔加入检测抗体100μL(空白对照孔不加)，用封板膜将微孔板密封，置37℃孵育60min。

(6)洗涤：步骤同(4)。

(7)每孔加入HRP标记链亲和素100μL(空白对照孔不加)，用封板膜将微孔板密封，置室温孵育30min。

(8)洗涤：步骤同(4)。

(9)立即加入100μL底物缓冲液(含空白对照孔)，用封板膜将微孔板密封，置室温避光孵育30min。

(10)每孔加入终止液100μL(含空白对照孔)，轻轻振荡微孔板，使内容物充分混匀。

(11)终止反应后1小时内，用酶标仪在450nm波长处，测定各孔吸光度值。

(12)数据处理：

质量控制：空白对照孔的吸光度值不高于0.10；100pg/mL的标准品的吸光度值不低于0.60。

a.求出HIV-1p24抗原标准品的吸光度平均值。

b.以HIV-1p24抗原标准品的吸光度平均值为纵轴，以HIV-1p24标准品的浓度为横轴，作标准曲线。

c.将测得的样品的吸光度值在上述标准曲线上求出样品的HIV-1p24抗原的浓度。

d.利用Graphpad Prism5软件将计算得到的样品的浓度数据作柱状图。

ELISA结果如图7所示：人泡沫病毒介导的shRNA能够显著降低HIV-1p24蛋白的表达水平。

实施例9 LDH分析shRNA是否会产生细胞毒性

使用非放射性细胞毒性检测(CytoToxNon-Radioactive Cytotoxicity Assay)试剂盒(Promega)分析shRNA是否会产生细胞毒性，具体步骤如下：

(1)样本准备：准备96孔细胞培养板的293T细胞(每孔100μL)：包括无细胞的DMEM培养基(背景空对照组)、未处理的对照细胞(样品对照组)、未处理的后续裂解的细胞(样品最大酶活性对照组)以及处理样品组。每组设3复孔，并做好标记(细胞浓度为每孔2×10³至2×10⁴细胞)。

(2)处理样品组：用Lipofectamine2000转染试剂将pNL4-3-Luci以及表达shRNA的人泡沫病毒载体质粒pΔф-H1-shRNA或空载体pΔф-H1和辅助载体质粒pCiGS、pCiPS、pCiES(25ng、80ng、80ng、10ng、5ng)共转染293T细胞，培养48h，收集上清。

(3)背景空对照组和样品对照组：培养48h直接收集上清。

(4)样品最大酶活性对照组：未处理的对照细胞培养48h后，按每100μL培养基加入10μL裂解液(10×)，裂解细胞；在37℃，5％的湿润CO₂培养箱中孵育45min；收获上清，以评估最大LDH活性。

(5)分别将上述获得的上清液转移到新的96孔板内，50μL/孔。

(6)用检测缓冲液配制底物混合物：

室温避光融化检测缓冲液(Assay Buffer)，取出12mL，加入到一瓶Substrate Mix中轻轻颠倒摇晃使底物溶解；一旦溶解，避免强光直射底物，立即使用。

(7)向每孔中加入50μL配好的底物混合物，室温避光孵育30min。

(8)向每孔中加入50μL的终止液；用注射器针头把大气泡戳破，加入终止液后1小时之内在490nm测量吸光值。

(9)计算处理样品实际吸光读数：处理样品孔吸光读数-样品对照孔吸光读数-背景空对照孔吸光读数。

(10)计算样品细胞最大酶活性的实际吸光读数：样品最大酶活性对照孔吸光读数-样品对照孔吸光读数-背景空对照孔吸光读数。

(11)计算细胞毒性(％)：(处理样品实际吸光读数/样品细胞最大酶活性的实际吸光读数)×100。

(12)利用Graphpad Prism5软件将计算得到的数据作柱状图。

LDH结果如图8所示：人泡沫病毒载体介导的shRNA无细胞毒性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 人泡沫病毒载体介导的抑制HIV-1复制的shRNA的构建及应用

<130> 1

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siRNA1正义链

<400> 1

gcatccggag tactacaaa 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siRNA1反义链

<400> 2

tttgtagtac tccggatgc 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siRNA2正义链

<400> 3

gccctcagat gctacatat 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siRNA2反义链

<400> 4

atatgtagca tctgagggc 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siRNA3正义链

<400> 5

gcttgccttg agtgctcaa 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> siRNA3反义链

<400> 6

ttgagcactc aaggcaagc 19

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物P1

<400> 7

agaggtaccc gaacgctgac gtcatca 27

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物P2

<400> 8

gaggatccct cgaggtcgac ggtatc 26

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gag正向引物P1

<400> 9

ggaagtgaca tagcaggaac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gag反向引物P2

<400> 10

catgctgtca tcatttcttc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pol正向引物P1

<400> 11

ttccctcaaa tcactctttg 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pol反向引物P2

<400> 12

ggatgcggta ttcctaatt 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> env正向引物P1

<400> 13

ggagcagcag gaagcactat 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> env反向引物P2

<400> 14

ctctccacct tcttcttcga tt 22

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Actin正向引物P1

<400> 15

cacgatggag gggccggact catc 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Actin反向引物P2

<400> 16

taaagacctc tatgccaaca cagt 24

Claims (6)

1.一种抑制HIV-1复制的siRNA，其特征在于：所述的抑制HIV-1复制的siRNA为siRNA1、siRNA2或siRNA3；其中，

siRNA1的正义链为：5'-GCATCCGGAGTACTACAAA-3'，

siRNA1的反义链为：5'-TTTGTAGTACTCCGGATGC-3'；

siRNA2的正义链为：5'-GCCCTCAGATGCTACATAT-3'，

siRNA2的反义链为：5'-ATATGTAGCATCTGAGGGC-3'；

siRNA3的正义链为：5'-GCTTGCCTTGAGTGCTCAA-3'，

siRNA3的反义链为：5'-TTGAGCACTCAAGGCAAGC-3'。

2.一种抑制HIV-1复制的shRNA，其特征在于：所述的抑制HIV-1复制的shRNA为shRNA1、shRNA2或shRNA3，它们都包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和终止信号；shRNA1、shRNA2、shRNA3的siRNA正义链和siRNA反义链分别为权利要求1中siRNA1、siRNA2、siRNA3的正义链和反义链；所述的loop环的碱基序列为TTCAAGAGA；所述的终止信号的碱基序列为TTTTT。

3.一种抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体，其特征在于：所述的抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体为能表达权利要求2中shRNA1、shRNA2或shRNA3的人泡沫病毒表达载体。

4.权利要求3种所述的抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将权利要求2中的shRNA1、shRNA2、shRNA3分别克隆到shRNA表达载体pSUPER上得到pSUPER-shRNA1、pSUPER-shRNA2、pSUPER-shRNA3；

（2）分别以pSUPER-shRNA1、pSUPER-shRNA2、pSUPER-shRNA3进行PCR扩增，引物为：

上游引物P1：5’-AGAGGTACCCGAACGCTGACGTCATCA-3’，

下游引物P2：5’-GAGGATCCCTCGAGGTCGACGGTATC-3’；

（3）通过KpnI和BamHI将（2）扩增的产物克隆到人泡沫病毒载体pΔФ上得到抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体pΔФ-H1-shRNA1、pΔФ-H1-shRNA2或pΔФ-H1-shRNA3。

5.权利要求1所述的siRNA、权利要求2所述的shRNA或权利要求3所述的人泡沫病毒表达载体在制备治疗艾滋病的药物中的应用。

6.一种治疗艾滋病的药物，其特征在于：包含权利要求1所述的siRNA、权利要求2所述的shRNA或权利要求3所述的人泡沫病毒表达载体。