CN103961359B

CN103961359B - 羊毛固醇三萜的用途

Info

Publication number: CN103961359B
Application number: CN201310047983.XA
Authority: CN
Inventors: 林淑萍; 张肇麟; 陈登海
Original assignee: Shuan He Biotech Inc
Current assignee: SANHUA BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2013-02-06
Filing date: 2013-02-06
Publication date: 2016-09-07
Anticipated expiration: 2033-02-06
Also published as: CN103961359A; HK1198422A1

Abstract

在此揭示一种自黄芝(Ganoderma colossum(Fr.)Baker)中分离出来的羊毛固醇三萜类化合物作为抗癌药物佐剂的新颖用途，离体试验证实其具有可增强抗癌药物杀死癌细胞的功效，特别是可增强抗癌药物对于已对艾瑞莎具有抗性的非小细胞肺癌细胞或对蕾沙瓦具有抗性的肝癌细胞产生细胞毒性的效果。

Description

羊毛固醇三萜的用途

技术领域

本揭示内容是有关于一种自灵芝中分离出来具有氧杂-A,B-升二-类固醇(oxa-A,B-dihomo-steroidal)骨架的羊毛固醇三萜类化合物的新颖用途；特别是这些化合物作为抗癌药物(如，艾瑞莎或蕾沙瓦)佐剂的用途。

背景技术

食药用真菌被广泛作为保健食品，其中又以灵芝为大宗。在东南亚地区，更常以灵芝子实体入药。由于灵芝可在生物体内启动诸多正面的反应，相关活性成分的研究很多，其活性成分大致被区分成五大类：灵芝三萜类(triterpenoids)、多醣体(polysaccharides)、核苷(nucleotides)、植物固醇类(phytosterols)及多肽类(polypeptides)。

黄芝(G.colossum)是灵芝科灵芝属中的一属，因黄芝较为稀少，因此相关活性成分的研究并不多。本申请案发明人即是在进行黄芝研究过程中，意外发现分离自黄芝的三萜化合物，包括羊毛固醇三萜G及羊毛固醇三萜H，具有可增强已知抗癌药物抑制癌细胞生长或杀死癌细胞(特别是已对抗癌药物发展出抗药性之癌细胞)的功效。因此，未来可开发成已知抗癌药物(如，艾瑞莎或蕾沙瓦)的佐剂。

发明内容

发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。

如本揭示内容所广泛描述与例示，本揭示内容目标为提供一种自黄芝中分离出来的三萜化合物，亦即，具有如下式(I)结构的的羊毛固醇三萜化合物的新颖用途：

其中，R₁及R₃分别为H或OH，R₂是H或乙酰氧基(acetoxy)。

据此，本揭示内容第一目的在于提供一种上述式(I)化合物的新颖用途，其是可作为已知抗癌药物的佐剂。

依据本发明一实施方式，本发明式(I)化合物可与另一种已知可改善癌症治疗效果的药剂合并使用。这类药剂包括抗癌药物、抗血管增生药物、抗病毒药物、抗生素、减轻疼痛药物、抗贫血药物、细胞激素、颗粒细胞株刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor,G-CSF)、抗呕吐药物以及其它类似物。

在一特定实例中，上述式(I)化合物的R₁与R₃分别为OH，且R₂为乙酰氧基，亦即该式(I)化合物为羊毛固醇三萜H(Colossolactone H)；且适合与此羊毛固醇三萜H一起使用的药剂为艾瑞莎。因此，适合组合使用羊毛固醇三萜H及艾瑞莎来治疗的癌症为肺癌；特别是对艾瑞莎具有抗性的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。

在另一特定实例中，上述式(I)化合物的R₁为OH，R₂为乙酰氧基，且R₃为H；亦即该式(I)化合物为羊毛固醇三萜G(Colossolactone G)；且适合与此羊毛固醇三萜G化合物一起使用的药剂为蕾莎瓦。因此，适合组合使用羊毛固醇三萜G及蕾莎瓦来治疗的癌症为肝癌。

据此，本揭示内容第二目的在于提供一种可抑制癌细胞增生或转移的药学组合物。此药学组合物包含一有效量的抗癌药物和一有效量的上述式(I)化合物；及其药学上可接受的载体(excipient)。

本揭示内容第三目的在于提供一种可延缓一对象体内的癌细胞生长或转移的方法。所述方法包含对该对象施用一有效量的本发明式(I)化合物。依据本发明另一实施方式，所述方法更包含在对该对象施用本发明式(I)化合物的同时、之前或之后，对该对象施用另一种可改善癌症治疗效果的药剂。这类药剂的实例包括抗癌药物、抗血管增生药物、抗病毒药物、抗生素、减轻疼痛药物、抗贫血药物、细胞激素、颗粒细胞株刺激因子、抗呕吐药物以及其它类似物。适合以所述方法来治疗(亦即，延缓癌细胞生长或迁移)的癌症可为肝癌、肺癌或乳癌；特别是具有转移能力或对已知抗癌药物具有抗药性的癌细胞。适合接受所述方法治疗的对象为哺乳动物，例如，人类。

在一特定实施方式中，本发明方法包含先对罹患肺癌的该对象施用一有效量的艾瑞莎；接着，再施用另一有效量的本发明式(I)化合物-羊毛固醇三萜H。在另一特定实施方式中，所述方法包含同时对罹患肺癌的该对象施用一有效量的艾瑞莎，以及另一有效量的羊毛固醇三萜H。在又另一特定实施方式中，所述方法包含先对罹患肝癌的该对象施用一有效量的蕾莎瓦，再施用另一有效量之本发明式(I)化合物-羊毛固醇三萜G。在另一特定实施方式中，所述方法包含同时对罹患肝肺癌的该对象施用一有效量的蕾莎瓦以及另一有效量的羊毛固醇三萜G。

据此，本揭示内容第四目的在于提供一种可离体杀死癌细胞的方法，包含对该癌细胞施用一有效量的本发明式(I)化合物。在一特定实例中，该式(I)化合物的R₁与R₃分别为OH，且R₂为乙酰氧基，亦即该式(I)化合物为羊毛固醇三萜H(Colossolactone H)，且所施用的有效量介于约10-40μM间；且适合以本方法杀死的癌细胞为肺癌细胞，特别是对艾瑞莎具有抗性的肺癌细胞。在另一特定实例中，该式(I)化合物的R₁ 为OH，R₂为乙酰氧基且R₃为H，亦即该式(I)化合物为羊毛固醇三萜G(Colossolactone G)，且所施用的有效量介于约10-20μM间；且适合以本方法杀死的癌细胞为肝癌细胞。

在参阅下文实施方式后，本领域技术人员当可轻易了解本发明的基本精神及其它发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。

附图说明

为让本发明的上述与其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：

图1是依据本发明一实施方式以羊毛固醇三萜H抑制(A)H1650、(B)A549或(C)PC9三种肺癌细胞株的细胞活性的示意图；

图2是依据本发明一实施方式合并施用羊毛固醇三萜H与艾瑞莎，其造成(A)H1650、(B)A549或(C)PC9三种肺癌细胞株的细胞死亡率的示意图；

图3是依据本发明一实施方式以羊毛固醇三萜H抑制PC-9细胞或抑制对艾瑞莎具有抗药性的PC9-IR细胞的细胞活性的示意图；

图4是依据本发明一实施方式以羊毛固醇三萜H抑制对艾瑞莎具有抗药性的PC9-IR细胞的细胞活性的示意图；

图5是依据本发明一实施方式以羊毛固醇三萜H抑制对艾瑞莎具有抗药性的PC9-IR细胞的细胞死亡率的示意图；

图6是依据本发明一实施方式合并施用羊毛固醇三萜G与蕾莎瓦，其造成(A)Huh7或(B)PLC-5两种肝癌细胞株的细胞死亡率的示意图；

图7是依据本发明一实施方式，羊毛固醇三萜G造成蕾莎瓦在(A)Huh7或(B)PLC-5肝癌细胞中IC₅₀浓度下降的示意图；以及

图8是依据本发明一实施方式，合并施用羊毛固醇三萜G与蕾莎瓦后，其抑制Huh7肝癌细胞形成细胞群落的能力分析示意图。

具体实施方式

为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

以下所提供的发明详细说明与附随图示仅在解释本发明实施方式之用，并非本发明多种实施方式的唯一代表实施方式。以下文字将说明实施例的功能以及如何建构与操作这些实施例的步骤和顺序。但是，本发明请求范围并不仅限于所揭示的实施方式。

黄芝(G.colossum)是灵芝科真菌中较为罕见的一个品种，由于黄芝非常稀有，因此有关其活性成分的研究并不多。有鉴于此，本案发明人利用溶剂萃取以及层析技术，包括硅胶管柱层析与逆相高效液相层析(reverse-phase high performanceliquidchromatography)，而自干燥的黄芝子实体中分离出数种化合物，经过结构鉴定，确认其为含有氧杂-A,B-升二-类固醇(oxa-A,B-dihomo-steroidal)骨架的灵芝三萜类化合物。此等化合物在离体试验(in vitro study)中被证实可增强已知抗癌药物杀死癌细胞的功效，故未来可开发成已知抗癌药物的佐剂。

因此，本发明一方面是提供一种自黄芝子实体中分离出来的灵芝三萜化合物的新颖用途，这些灵芝三萜化合物具有下式(I)之结构：

其中，R₁及R₃分别为H或OH，R₂是H或乙酰氧基。

在一特定实例中，该式(I)化合物的R₁与R₃分别为OH，且R₂为乙酰氧基(acetoxy)，亦即(22S,23R)-A,B-升二-19-降-15--乙酰氧-5,23-二羟-4-氧杂-3-氧代羊毛固醇-1,8,19,24-四烯-26,22-内酯[(22S,23R)-A,B-dihomo-19-nor-15-β-acetoxy-5,23-dihydroxy-4-oxa-3-oxolanosta-1,8,19,24-tetraen-26,22-olide)]或称羊毛固醇三萜H(Colossolactone H)。

在另一特定实例中，该式(I)化合物的R₁为OH，R₂为乙酰氧基且R₃为H，亦即(22S,23R)-A,B-升二-19-降-15--乙酰氧-5-羟-4-氧杂-3-氧代羊毛固醇-1,8,19,24-四烯-26,22-内酯[(22S,23R)-A,B-dihomo-19-nor-15-β-acetoxy-5-hydroxy-4-oxa-3-oxolanosta-1,8,19,24-tetraen-26,22-olide)]或称羊毛固醇三萜G(ColossolactoneG)。

本发明(I)化合物可依据2011年6月30日提申，申请号100123260，标题为“新颖化合物、其之制备方法及用途”的台湾专利申请案内容所揭示的方法，从黄芝内单离出此式(I)化合物。据此，将上述专利申请案的全部内容并入本文中作为参考；或者，可依据Kleinwchter等人在2001年1月19日透过网络发布在美国化学学会与美国生药学学会(AmericanChemical Society and American Society of Pharmacognosy) 会刊上标题『羊毛固醇三萜化合物-来自越南灵芝的新颖三萜化合物(Colossolactones,NewTriterpenoid Metabolitesfrom a Vietnamese Mushroom Ganoderma Colossum)』的文章中所揭示的方法，而从黄芝内单离出此式(I)化合物。据此，将上述文章的全部内容并入本文中作为参考。

依据本发明一实施方式，此式(I)化合物可增强一已知抗癌药剂杀死癌细胞的效果。因此，本发明式(I)化合物的新颖用途是作为一种目前已知抗癌药物的佐剂(adjuvant)。

“佐剂(adjuvant)”一词在此是指一物质在加入药学组合物时，可提升另一药物的吸收动力且因而可提升其生物体可用率，但其本身单独施用时不具有或仅具有轻微的直接医疗效果。在一特定实施方式中，本发明式(I)化合物可作为艾瑞莎的佐剂，与艾瑞莎同时或先后被施用至一罹患肺癌的对象身上。例如，先施用艾瑞莎后，再接续施用上述本发明式(I)化合物。在另一特定实施方式中，本发明式(I)化合物可作为蕾莎瓦的佐剂，与蕾莎瓦同时或先后被施用至一罹患肝癌的对象身上。例如，先施用蕾莎瓦后，再接续施用上述本发明式(I)化合物。

“对象(subject)”一词在本文中代表可接受本发明药学组合物的任何一种动物(例如，人类)，包括，但不限于，人类、非人类的灵长类，如哺乳动物、狗、猫、马、羊、猪、牛等。一般来说，“患者(patient)”一词及“对象(subject)”一词在本文中可彼此交替使用。

抗癌药物的实例包括，但不限于，Gefitnib(商品名：艾瑞莎膜衣锭、Sorafenib(商品名：蕾莎瓦)、紫杉醇(paclitaxel)、异丙氧代苯紫杉醇(docetaxel)、喜树碱(camptothecin,CPT)、抗癌妥(topotecan,TPT)、治癌妥(irinotecan,CPT-11)、阿霉素(Doxorubicin)、丹阿霉素(daunorubicin)、艾阿霉素(epirubicin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、顺铂(cis-platin)、碳铂(cyclophosphamide)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱 (vincristine)、尹氟酰胺(ifosfamide)、溶肉瘤素(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)、氨基甲基叶酸(methotrexate)、丝羟酮(mitoxantrone)、鬼臼毒素(teniposide)、鬼臼乙叉苷(etoposide)、博莱霉素(bleomycin)、亚叶酸(leucovorin)、星状素(cytarabine)、放线菌素D(dactinomycin)、链尿佐菌素(streptozocin)、考布丁A4磷酸盐(combretastatin A4-phosphate)、SU5416及其它类似物。在一特定实施方式中，该抗癌药物为艾瑞莎。在另一特定实施方式中，该抗癌药物为蕾莎瓦。

据此，本发明另一目的是提供一种可杀死癌细胞或抑制癌细胞增生的药学组合物，包含一有效量的抗癌药物和另一有效量的上述式(I)化合物；及其药学上可接受的载体。

“一有效量(an effective amount)”一词意指对治疗对象施用一具有疗效的化合物或组合物的剂量。疗效的衡量可为客观的(亦即，利用一些试验或标记物(marker)来衡量)或是主观的(亦即，治疗对象对治疗效果与感觉的主观叙述)。本发明药学组合物的有效剂量范围可自约1毫克/公斤至约1,000毫克/公斤，或是自10毫克/公斤至约100毫克/公斤。有效剂量亦会随着施用途径的不同以及可能并用的其它药剂的不同而有所改变。本领域技术人员会知道有可能会使用比上述多或少的剂量。对特定病人所使用的特定剂量与治疗方法将会受许多变因的影响，包含使用药物的活性、年龄、体重、整体健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、施用频率、排泄速率、合并用药、疾病的进程与严重度、患者疾病位置、症状状况、医生对疾病的处理与判断。

一般来说，本发明式(I)化合物的含量占整体药学组合物重量约0.1%至99%（重量%）。在某些实施方式中，本发明式(I)化合物的含量占整体药学组合物重量的至少1%（重量%）。在特定实施方式中，本发明式(I)化合物的含量占整体药学组合物重量的至少5%（重量%）。在另一些实施方式中，本发明式(I)化合物的含量占整体药学组合物重量的至少10%（重量%）。在又另一些实施方式中，本发明式(I)化合物的含量占整体药学组合物重量的至少25%（重量%）。

除本发明式(I)化合物外，上述药学组合物内还包含一种已知可改善癌症治疗效果的抗癌药剂。此抗癌药剂的实例包括，但不限于，Gefitnib(商品名：艾瑞莎膜衣锭(、Sorafenib(商品名：蕾莎瓦膜衣锭()、紫杉醇(paclitaxel)、异丙氧代苯紫杉醇(docetaxel)、喜树碱(camptothecin,CPT)、抗癌妥(topotecan,TPT)、治癌妥(irinotecan,CPT-11)、阿霉素(Doxorubicin)、丹阿霉素(daunorubicin)、艾阿霉素(epirubicin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、顺铂(cis-platin)、碳铂(cyclophosphamide)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、尹氟酰胺(ifosfamide)、溶肉瘤素(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)、氨基甲基叶酸(methotrexate)、丝羟酮(mitoxantrone)、鬼臼毒素(teniposide)、鬼臼乙叉苷(etoposide)、博莱霉素(bleomycin)、亚叶酸(leucovorin)、星状素(cytarabine)、放线菌素D(dactinomycin)、链尿佐菌素(streptozocin)、考布丁A4磷酸盐(combretastatin A4-phosphate)、SU5416及其它类似物。在一特定实施方式中，此抗癌药剂为艾瑞莎；且合并施用艾瑞莎与上述式(I)化合物(例如，羊毛固醇三萜H)可协同性地提高肺癌细胞死亡率超过2倍以上。在另一特定实施方式中，此抗癌药剂为蕾莎瓦；且合并施用蕾莎瓦与上述式(I)化合物(例如，羊毛固醇三萜G)可有效提高肝癌细胞死亡率约2倍以上。

这类医药品或药学组合物较佳是透过可有效传送所述组合物中式(I)化合物及抗癌药剂的途径施用至一哺乳类(较佳是人类)身上适当或可产生欲求效果的位置。适当的施用途经可以是例如主动或被动地经口、经鼻、经肺或经皮膜等方式；或是以经肠胃外的方式，如直肠栓剂、皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、鼻腔内、眼用溶液或软膏。

举例来说，本发明药学组合物可经由口服（如，口服用胶囊、悬浮液或药锭）、或肠胃外（parenterally）等适当方法施用。肠胃外（parenterally）施用方式包括例如肌肉内注射、静脉注射、皮下注射或腹膜内注射等系统性方式施用。或是，也可透过穿皮膜方式施用，如局部皮肤涂抹或是吸入性(如支气管内、鼻腔内、口腔内或鼻滴剂等)；或是直肠内方式施用。施用时可以单独给药或并同熟知的药学上可接受的辅料一起给药。在较佳实施方式中，可经由口服方式(如，透过食物)将本发明药学组合物投予治疗对象。

若以口服方式施用，可将本发明药学组合物配方成为内含各种辅剂(如微晶纤维素、碳酸钙、磷酸二钙及甘胺酸)；各种崩解剂(如淀粉、藻酸及特定硅酸盐)；以及颗粒黏合剂(如，聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶及相思树胶(acacia))的药锭。除此外，还可包含诸如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠及滑石等的润滑剂。此固态配方也可当作填充剂用于明胶胶囊内，与此相关的较佳材料包括乳糖或牛奶中的糖以及高分子量聚乙二醇。当使用方式是口服用悬浮液和/或特效药液(elixirs)时，可组合活性成分与各种甜味剂或风味剂、着色剂或染料一起配方，需要时还可加入乳化剂和/或悬浮剂，以及诸如水、酒精、丙二醇、甘油等稀释剂。

若以肠胃外（parenterally）方式施用，可将本发明药学组合物配方成为液态的药学组合物，其可为能以静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射或腹膜内注射等方式施用的无菌溶液或悬浮液。可用来制造上述无菌注射溶液或悬浮液的稀释剂包括，但不限于，1,3-丁二醇、甘露醇、水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液。也可使用脂肪酸(如，油酸)及其甘油酯衍生物，或是药学可接受的油(如，橄榄油或菜籽油)来制造可供注射用的溶液或悬浮液。这类油性溶液或悬浮液中也可包含用来稀释的醇类或羧甲基纤维素或类似的分散剂。也可使用其它常用的表面活性剂(如，Tweens或Spans系列)或乳化剂，或药学领域制造配方时常用来增强生物可利用性的药剂。

也可将本发明的上述医药品或药学组合物调制成多种可供局部表面给药（topical application）的剂型。可使用此领域中熟知的的各种皮肤可接受的惰性辅剂在这类剂型中。适合皮肤表面施用的配方包括液体、乳霜、乳液、乳膏、凝胶、喷剂、气雾喷剂、皮肤贴片等类似物。常用的惰性辅剂如水、乙醇、聚乙烯吡咯啶、丙二醇、矿物油、硬脂醇及其它可形成胶状物的材料。所有上述剂型与辅剂皆为药学领域所熟知。对于本文所述的组合物的效果而言，剂型的选择并非关键。

亦可将本发明的上述医药品或药学组合物制成多种适用于黏膜给药（mucosalapplication）的剂型，如经颊（buccal）和/或舌下（sublingual）药物剂型单元，以递送药物穿过口腔黏膜。可使用多种生物可降解且药学可接受的高分子辅剂，此种辅剂可使得药学组合物具有可接受的吸附效果以及所欲的药物释放模式，且可和经颊和/或舌下药物剂型单元中所含的欲施用活性成分或其它成分兼容。一般来说，上述的高分子辅剂包含亲水性聚合物，其可黏附至口腔黏膜的湿润表面。高分子辅剂的实施例包括但不限于丙烯酸聚合物与共聚物（acrylic acid polymers and copolymers）；水解聚乙烯醇（hydrolyzedpolyvinylalcohol）；聚乙烯氧化物（polyethylene oxides）；聚丙烯酸酯（polyacrylates）；乙烯聚合物与共聚物（vinyl polymers and copolymers）；聚乙烯吡咯啶；葡萄糖（dextran）；瓜胶（guar gum）；果胶（pectins）；淀粉；及纤维素聚合物（cellulosic polymers）

因此，本发明另一方式为提供一种延缓或抑制一对象身上多数癌细胞生长或转移的方法，其至少包含对该对象施用一有效量的所述药学组合物，使得该对象身上约90%的该些癌细胞的生长停滞或是不会转移，因而能达到延缓肿瘤或癌生长或扩散的目的。适合以本发明方法或药学组合物来治疗(亦即，延缓癌细胞生长或转移)的癌症为肝癌、肺癌或乳癌；特别是具有转移能力或是具有抗药性的肺癌或肝癌。在一特定实施方式中，适以本发明方法或药学组合物来治疗的癌症是对非小细胞肺癌的第二线用药-艾瑞莎具有抗性的肺癌。在此特定实施方式中，是对一罹患肺癌的对象合并施用一有效量的艾瑞莎与另一有效量的所述药学组合物(其包含有效量之本发明式(I)化合物)。相较于单独施用所述药学组合物的治疗效果而言，合并施用艾瑞莎与本发明式(I)化合物(如，羊毛固醇三萜Ｈ)，可提高对艾瑞莎具有抗性的肺癌细胞(如，PC9-IR细胞)之死亡率约2倍以上。在另一特定实施方式中，适以本发明方法或药学组合物来治疗的癌症是对第三期肝癌药物-蕾莎瓦具有抗性的肝癌。在此特定实施方式中，是对一罹患肝癌的对象合并施用一有效量的蕾莎瓦与另一有效量的所述药学组合物(其包含有效量之本发明式(I)化合物-羊毛固醇三萜Ｇ)。相较于单独施用所述药学组合物的治疗效果而言，合并施用蕾莎瓦与本发明式(I)化合物，可提高对蕾莎瓦杀死肝癌细胞之死亡率2倍以上。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅做示范之用。于本申请书中所提到的所有参考文献均全体纳入参考，以揭露并叙述该文献所记载之相关方法及/或材料。此外，文中所讨论的文献仅揭露本发明申请日前的熟知的技术。并且无任何文献显示本发明内容曾为熟知的技术所揭露。本发明内容所得到的实际数据会因个别的实施条件而与本发明揭露于说明书内容中之数据有所不同。

除非另外指明，否则在本文及附随之权利要求范围中所述及的单数型式词，“一(“a“,“an”)或该(“the”)”均涵盖其复数形式。

虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数界是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本领域技术人员的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比（例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其它相似者）均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求书所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。

除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本领域技术人员所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。

下文提出多个实验例来说明本发明的某些方式，以利本领域技术人员实作本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。

实施例

材料与方法

细胞培育在本研究中所使用的细胞株包括以下：肺癌细胞株PC9，以及对艾瑞莎敏感的PC9肺癌细胞株(在本文中称为PC9-IR)；人类肺腺癌细胞株(human lungadenocarcinoma)，包括CL1-5、A549及H1650细胞株；人类肝癌细胞株(humanhepatocarcinoma)，包括Huh7及PLC5细胞株；人类直肠癌细胞株(human coloncarcinoma cells，简称HCT116)；人类乳腺癌细胞株(human carcinoma cells，简称MDA-MB-231)。将每一细胞株的细胞分别培育在经Dulbecco氏改良过的Eagle 氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)中，并添加10%胎牛血清(fetal calfserum,FCS)、100单位/ml的盘尼西林、100ng/ml的链霉素硫酸盐(Invitrogen,Carlsbad,CA)、2mM L-谷氨酸、非必要氨基酸及丙酮酸钠(1%)于该基础培养液中，并维持在37℃的潮湿环境下(5%CO₂及95%空气)。平时将细胞培养于10公分培养盘内，当细胞长到八分满时进行继代培养。继代培养方式是先吸去旧的培养液后，以3毫升的磷酸缓冲液(PBS)清洗培养细胞一次，接着，在37℃下以1毫升之胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.025%)溶液处理细胞5分钟，使细胞脱离培养盘成悬浮状态；接着，在悬浮细胞中加入2毫升新鲜的培养液，以中和胰蛋白酶的活性。然后，将细胞打散使平均分布于细胞悬浮液中，留下适当比例的细胞数后，加入新培养液补至适当体积并混匀后，放入37℃培养箱内培养。

细胞活性分析取约3,000个细胞，将之接种在平底96孔盘中，以培养液补充每一培养孔内的培养液，使体积达180μL，接着将培养盘放入37℃的培养箱培养过夜。次日加入含不同浓度的式(I)化合物及艾瑞莎的上述培养液。各培养孔内最终体积为200μL，每个浓度进行三重复，放入37℃培养箱培养，于48小时后测定细胞活性。

细胞活性测定活细胞中有大量酸性磷酸酶(ACP)可将其受质磷酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)转换成对-硝基苯酚(p-nitrophenol,p-NP)，p-NP在405nm波长下有最大吸光值，故可藉测定吸光值可定量出细胞中ACP活性，进而推算出细胞的活性。测定细胞活性时，先吸去培养液，以200μL PBS清洗一次，加入100μl的分析用缓冲液(内含10mM p-NPP、0.1M醋酸钠、0.1%Triton X-100，且pH约为5.5)，于37℃反应30-40分钟后加入10μl的氢氧化钠(0.1N)终止反应，以SpectraMax M5Microplate Reader(MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA)于波长405nm测定吸光值代表其细胞活性，以未处理药物组的细胞活性为1，计算出不同条件药物处理下的细胞活性比。

死亡细胞分析利用活细胞对于碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)染剂的拒染性来评估细胞是否死亡。将2×10⁵颗细胞接种在平底的6孔培养皿中，于培养箱中培养过夜，加入药物处理48小时后，以5μg/mL的PI溶液染色30分钟，接着以PBS清洗。再利用胰蛋白脢分解使细胞脱离培养盘后，加入2毫升的PBS将细胞打散，放入流式细胞仪(EpicsXL-MCL FlowCytometer)中进行分析，并以EXPO32分析软件分析所得结果。死亡细胞会呈现比较高的荧光强度。

细胞群落形成能力分析将1.4%的低熔点洋菜胶以1:1的方式与10%FBS-RPMI混合(最终浓度为5%FBS)，在6孔盘的每个孔洞加入2毫升。接着将Huh7细胞用10%FBS-RPMI配成含不同条件药物(蕾沙瓦：浓度分别为0或5μM，本发明式(I)化合物浓度分别为0、10或20μM)的细胞液，以1:1的方式和稀释于PBS的0.7%的低熔点洋菜胶混合均匀后，在6孔盘的每个孔洞分别加入2毫升(2,500颗细胞，5%FBS)，待凝固后于上层加入2毫升含药物的20%FBS-RPMI，并将其培养在37°C且含有5%CO₂的培养箱内。7天后以3%的结晶紫进行染色，并以Olympus IX71倒立式荧光显微镜计数每个孔洞内直径大于100μm的细胞群落数目。

实施例1

1.1羊毛固醇三萜H作为艾瑞莎佐剂以抑制非抗药性肺癌细胞株活性及生长的效果

在本试验中，是以人类肺癌细胞株PC9、人类肺泡腺癌细胞株A549以及人类支气管肺泡癌细胞株H1650进行活体外抗癌分析；将上述各种癌细胞以不同浓度的羊毛固醇三萜H处理后，测量细胞内酸性磷酸酵素(Acid phosphatase,ACP)的活性，作为细胞活性的指标，结果示于图1-2。

如图1A所示，当合并使用艾瑞莎与羊毛固醇三萜H来处理H1650细胞后，随着羊毛固醇三萜H(浓度分别为10、20、 40μM)以及艾瑞莎(浓度分别为0.5、1、5、10μM)的浓度上升，H1650细胞活性下降也越趋明显。类似的趋势也可在A549细胞株中观察到，参见图1B。

另一株人类肺癌细胞株PC9对艾瑞莎的处理相当敏感，单独施以浓度约0.001μM的艾瑞莎时，可造成约10%的癌细胞活性下降；若合并施以约40μM的羊毛固醇三萜H，则可使癌细胞活性下降超过50%。当提高艾瑞莎浓度至0.005μM时，可造成癌细胞活性下降达70%；若合并施用艾瑞莎与羊毛固醇三萜H，则癌细胞活性下降可达约85%(图1C)。

此外，如图2A及2B的死亡细胞分析结果所示，对H1650和A549细胞来说，单独施用艾瑞莎(10μM)或式(I)化合物(40μM)所能杀死的癌细胞比例有限(<5%)；但合并施用艾瑞莎(10μM)及羊毛固醇三萜H(40μM)后，则可协同性地提高癌细胞死亡率至少4倍，达20-25%。

类似的，如图2C所示，对于对艾瑞莎较为敏感的PC9细胞来说，单独施用艾瑞莎(浓度0.001μM)或羊毛固醇三萜H(40μM)所能杀死的癌细胞比例不超过10%；然而合并施用艾瑞莎(0.001μM)及羊毛固醇三萜H(40μM)后，同样也可协同性地提高癌细胞死亡率约3倍，达25%左右。

1.2羊毛固醇三萜H作为艾瑞莎佐剂以抑制抗药性肺癌细胞株(PC9-IR)活性及生长的效果

在癌症临床治疗上，最常遇到的困境是癌细胞对所施加的抗癌药物发展出抗药性。因此，本实施例进一步测试羊毛固醇三萜H对具有抗药性之癌细胞的功效，特别是其作为目前临床抗癌药物佐剂的功效。

在本实例中，所使用的临床标靶药物为肺癌第二线用药-艾瑞莎，用来测试的癌细胞为对艾瑞莎具有抗性的肺癌细胞株PC9(以下简称PC9-IR细胞株)。大致依照前述方式培养PC9-IR细胞株，并分别测定合并施用羊毛固醇三萜H与艾瑞莎后，PC9-IR细胞的细胞活性与死亡细胞比例。结果示于图3、4及5。

图3绘示出分别对PC-9细胞与对艾瑞莎具有抗性的PC9-IR细胞，合并施用羊毛固醇三萜H与艾瑞莎两种药物后，其细胞活性下降的结果。数据显示，相较于一般PC-9细胞，PC9-IR细胞确实对艾瑞莎不敏感。对没有抗药性的PC-9细胞来说，仅需约0.005μM的艾瑞莎，即足以令其细胞活性减少约70%；但对具有抗药性的PC9-IR细胞来说，即使提高艾瑞莎浓度两百倍至约1μM，细胞活性仅下降不到20%。但，合并施加羊毛固醇三萜H至经艾瑞莎处理的PC9-IR细胞，则可降低细胞活性至60%；提高艾瑞莎浓度两千倍至约10μM，细胞活性也仅下降约40%。但，合并施加羊毛固醇三萜H至经艾瑞莎处理的PC9-IR细胞，则可协同性地提高细胞活性降低超过80%。类似的结果也绘示在图4中。

图5则绘示出合并施用羊毛固醇三萜H(40μM)与艾瑞莎(10μM)至PC9-IR细胞后所造成的细胞死亡率。对于对艾瑞莎具有抗药性的PC9-IR细胞来说，单独施用艾瑞莎(浓度10μM)或羊毛固醇三萜H(40μM)所能杀死的癌细胞比例约8%；然而合并施用艾瑞莎(10μM)及羊毛固醇三萜H(40μM)后，可协同性地提高癌细胞死亡率约3倍，达25%左右。

实施例2

2.1羊毛固醇三萜G抑制各种癌细胞株生长的效果

在本试验中，是以人类肺癌细胞株PC9、CL1-5、对艾瑞莎具有抗性的PC9-IR细胞；人类乳腺癌细胞株MDA-MB-231；人类大肠癌细胞株HCT-116以及人类肝癌细胞株Huh7和HCT116进行活体外癌细胞生长抑制分析。将上述各种癌细胞以不同浓度的羊毛固醇三萜G处理后，再测量其死亡率，并据以计算出羊毛固醇三萜G达成50%致死率的有效浓度。结果示于表I中。

表I羊毛固醇三萜G对各种癌细胞的IC₅₀

由表I结果可知，羊毛固醇三萜G本身即具有抑制癌细胞生长的效果，惟其需较高浓度，约40-60μM方可达成50%致死率。

2.2低浓度羊毛固醇三萜G作为蕾莎瓦佐剂以抑制肝癌细胞株活性及生长的效果

依据前述材料方法中的实验步骤及实施例1的方式，来评估羊毛固醇三萜G与已知抗癌药物-蕾沙瓦协同抑制肝癌细胞活性的效果，结果示于图6、7。

如图6A-6B所示，当合并使用蕾沙瓦与羊毛固醇三萜G来处理各种肝癌细胞株后，随着羊毛固醇三萜G(浓度分别为0、10、20μM)以及蕾沙瓦(浓度分别为0、2.5、5、10μM)的浓度上升，各肝癌细胞株(包括Huh7、及PLC-5细胞株)之细胞活性下降也越趋明显。与表I结果最大的不同在于，在此合并使用抗癌药剂-蕾沙瓦的实例中，所使用的羊毛固醇三萜G浓度相当低，仅为10-20μM，约为其单独使用时对各肝癌细胞株(包括Huh7及PLC-5及细胞株)的IC₅₀浓度的1/4–1/2浓度。

如图6A所示，在Huh7细胞经72小时培养，以浓度2.5μM的蕾沙瓦单独处理时，仅可造成约5%的癌细胞活性下降；但若合并施以20μM的羊毛固醇三萜G，则可加成性地使癌细胞活性下降约25%。当提高蕾沙瓦浓度至5μM时，可造成癌细胞活性下降约10%；但若合并施用蕾沙瓦与羊毛固醇三萜G，则可使癌细胞活性下降达约42%(图6A)。类似的效果也可在PLC-5人类肝癌细胞株中观察到(图6B)。

2.3羊毛固醇三萜G可有效降低蕾莎瓦50%致死率浓度

图7绘示出合并使用蕾沙瓦(浓度分别为0、5、10、15、 20μM)与羊毛固醇三萜G(浓度分别为0、10、20μM))来分别处理Huh7肝癌细胞或PLC-5细胞后，羊毛固醇三萜G对蕾沙瓦之IC₅₀浓度的影响。结果显示在Huh7细胞，当合并施用蕾沙瓦与羊毛固醇三萜G(浓度20μM)48小时，可有效降低蕾沙瓦的IC₅₀浓度约52%；在PLC-5细胞，当合并施用蕾沙瓦与羊毛固醇三萜G(浓度20μM)72小时，可有效降低蕾沙瓦的IC₅₀浓度约51%。

2.4羊毛固醇三萜G抑制Huh7肝癌细胞形成群落

细胞群落形成能力分析(clonogenic assay)乃是癌症研究领域中，惯用来测试药物处理，对癌细胞本身后续继续无限制地进行分裂的能力的试验，其是透过计算这些癌细胞形成群落的数目或群落的大小来估算。每一细胞群落至少必须包含50个细胞。

先依据本文“材料与方法”段落中所揭示的步骤，对上述肝癌细胞施以药物(蕾沙瓦：浓度分别为0或5μM)；羊毛固醇三萜G：浓度分别为0、10或20μM)处理，然后再继续培育残存的癌细胞，并以细胞群落分析来观察这些肝癌细胞后续形成细胞群落的能力。结果绘示于图8。

如图8所示，单独使用羊毛固醇三萜G，对Huh7肝癌细胞形成群落能力的影响不大；浓度20μM的羊毛固醇三萜G，可减少24%的癌细胞群落数目。单独使用5μM蕾沙瓦，可减少约32%之癌细胞群落数目，若合并使用5μM蕾沙瓦及20μM的羊毛固醇三萜G，则可进一步减少约70%的癌细胞群落数目。此结果显示，本发明的羊毛固醇三萜G确实具有当作抗癌药物的佐剂的功能。

虽然本揭示内容已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本揭示内容，任何本领域技术人员，在不脱离本揭示内容的精神和范围内，当可作各种之更动与润饰。举例来说，上述的说明书、实施例与数据已提供了与本发明相关的结构与实施例的完整说明，任何本领域技术人员将可在不背离本发明精神与范畴下，参照上述一或多个特定实施方式进行各种改良或变化，这些改良或变化应该被视为本发明下附权利要求的范畴。

虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不悖离本发明之原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随权利要求书所界定者为准。

Claims

1.一种具有下式(I)结构的化合物作为制备治疗癌症药物的应用，其中该药物可作为一抗癌药物的佐剂：

其中，R₁及R₃分别为H或OH；R₂是H或乙酰氧基(acetoxy)；且该抗癌药物是艾瑞莎或蕾莎瓦。

2.一种可杀死癌细胞的药学组合物，包含：

一有效量的式(I)化合物，

其中，R₁及R₃分别为H或OH，R₂是H或乙酰氧基；

一有效量的抗癌药物；及

其药学上可接受的载体；

其中，该抗癌药物是艾瑞莎或蕾莎瓦。

3.如权利要求2所述的药学组合物，其中该癌细胞为肺癌细胞。

4.如权利要求3所述的药学组合物，其中该癌细胞为对艾瑞莎具有抗性的肺癌细胞。

5.如权利要求2所述的药学组合物，其中该癌细胞为肝癌细胞。

6.如权利要求5所述的药学组合物，其中该癌细胞为对蕾莎瓦具有抗性的肝癌细胞。